מטבוליטים אימונומודולטוריים הם מאפיין מרכזי של המיקרו-סביבה הגידולית (TME), אך למעט מספר יוצאים מן הכלל, זהותם נותרה ברובה בלתי ידועה. כאן, ניתחנו גידולים ותאי T מגידולים ומיימת של חולים עם קרצינומה סרוזית בדרגה גבוהה (HGSC) כדי לחשוף את המטבולומה של מדורי TME שונים אלה. מיימת ותאי גידול קיימים הבדלים נרחבים במטבוליטים. בהשוואה למיימת, תאי T החודרים לגידול מועשרים באופן משמעותי ב-1-מתילניקוטינאמיד (MNA). למרות שרמת ה-MNA בתאי T גבוהה, הביטוי של ניקוטינאמיד N-מתילטרנספראז (אנזים המזרז את העברת קבוצות מתיל מ-S-אדנוזילמתיונין לניקוטינאמיד) מוגבל לפיברובלסטים ותאי גידול. מבחינה פונקציונלית, MNA גורם לתאי T להפריש את הציטוקין מקדם הגידול גורם נמק הגידול אלפא. לכן, MNA שמקורו ב-TME תורם לוויסות החיסוני של תאי T ומהווה מטרה אימונותרפית פוטנציאלית לטיפול בסרטן אנושי.
מטבוליטים שמקורם בגידול יכולים להיות בעלי השפעה מעכבת עמוקה על חסינות אנטי-גידולית, ויותר ויותר ראיות מראות שהם יכולים לשמש גם ככוח מניע מרכזי להתקדמות המחלה (1). בנוסף לאפקט ורבורג, מחקרים אחרונים החלו לאפיין את המצב המטבולי של תאי גידול ואת הקשר שלו עם המצב החיסוני של המיקרו-סביבה הגידולית (TME). מחקרים על מודלים של עכברים ותאי T אנושיים הראו כי מטבוליזם של גלוטמין (2), מטבוליזם חמצוני (3) ומטבוליזם של גלוקוז (4) יכולים לפעול באופן עצמאי על תת-קבוצות שונות של תאי חיסון. מספר מטבוליטים במסלולים אלה מעכבים את תפקוד האנטי-גידולי של תאי T. הוכח כי חסימת הקואנזים טטרהידרוביופטרין (BH4) יכולה לפגוע בהתפשטות של תאי T, ועלייה ב-BH4 בגוף יכולה לשפר את התגובה החיסונית האנטי-גידולית בתיווך CD4 ו-CD8. בנוסף, ניתן להציל את ההשפעה החיסונית המדכאת של קינורןינין על ידי מתן BH4 (5). בגליובלסטומה עם מוטציה של איזוציטרט דהידרוגנאז (IDH), הפרשת האננטיומטבולי (R)-2-הידרוקסיגלוטרט (R-2-HG) מעכבת את ההפעלה, התפשטות ופעילות הציטוליזה של תאי T (6). לאחרונה, הוכח כי מתילגליוקסל, תוצר לוואי של גליקוליזה, מיוצר על ידי תאי מדכא ממקור מיאלואידי, והעברת מתילגליוקסל מתאי T יכולה לעכב את תפקוד תאי T אפקטוריים. בטיפול, ניטרול מתילגליוקסל יכול להתגבר על פעילותם של תאי מדכא שמקורם במיאלואידים (MDSC) ולשפר באופן סינרגטי את טיפול חסימת נקודות הבקרה במודלים של עכברים (7). מחקרים אלה מדגישים יחד את התפקיד המרכזי של מטבוליטים שמקורם ב-TME בוויסות תפקוד ופעילות תאי T.
תפקוד לקוי של תאי T דווח בהרחבה בסרטן השחלות (8). זה נובע בחלקו מהמאפיינים המטבוליים הטבועים בהיפוקסיה ובמערכת כלי דם לא תקינה של הגידול (9), מה שמביא להמרת גלוקוז וטריפטופן לתוצרי לוואי כמו חומצה לקטית וקינורנין. עודף לקטט חוץ-תאי מפחית את ייצור האינטרפרון-γ (IFN-γ) ומניע את ההתמיינות של תת-קבוצות מדכאות מח עצם (10, 11). צריכת טריפטופן מעכבת ישירות את התפשטות תאי T ומעכבת איתות קולטני תאי T (12-14). למרות תצפיות אלו, עבודה רבה סביב מטבוליזם חיסוני בוצעה בתרבית תאי T in vitro תוך שימוש במדיום אופטימלי, או הוגבלה למודלים הומולוגיים של עכברים in vivo, שאף אחד מהם לא משקף במלואה את ההטרוגניות של סרטן אנושי ואת הסביבה הפיזיולוגית של מאקרו ומיקרו.
מאפיין נפוץ של סרטן השחלות הוא התפשטות הצפק והופעת מיימת. הצטברות נוזל תאי במיימת קשורה למחלה מתקדמת ופרוגנוזה גרועה (15). על פי דיווחים, תא ייחודי זה הוא היפוקסי, בעל רמות גבוהות של גורם גדילה אנדותליאלי וסקולרי (VEGF) ואינדולאמין 2,3-דיאוקסיגנאז (IDO), והוא חודר על ידי תאי T רגולטוריים ותאים מעכבים מיאלואידים (15-18). הסביבה המטבולית של מיימת עשויה להיות שונה מזו של הגידול עצמו, ולכן התכנות מחדש של תאי T בחלל הצפק אינו ברור. בנוסף, ההבדלים העיקריים וההטרוגניות בין מיימת למטבוליטים הקיימים בסביבת הגידול עשויים לעכב את חדירת תאי החיסון ואת תפקודם לגידולים, ויש צורך במחקר נוסף.
על מנת לפתור בעיות אלו, עיצבנו שיטה רגישה להפרדת תאים וכרומטוגרפיית נוזלים (LC-MS/MS) לחקר סוגי תאים שונים (כולל תאי T מסוג CD4+ ו-CD8+) וכן בתוך גידולים וביניהם. המטבוליטים שלה משתרעים על פני תאים באותה סביבת מיימת וגידול של המטופל. אנו משתמשים בשיטה זו בשילוב עם ציטומטריית זרימה גבוהה-ממדית וריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq) כדי לספק תמונה ברזולוציה גבוהה של המצב המטבולי של אוכלוסיות מפתח אלו. שיטה זו חשפה עלייה משמעותית ברמת ה-1-מתילניקוטינאמיד (MNA) בתאי T של הגידול, וניסויים במבחנה הראו כי ההשפעה האימונומודולטורית של MNA על תפקוד תאי T לא הייתה ידועה בעבר. באופן כללי, שיטה זו חושפת את האינטראקציות המטבוליות ההדדיות בין גידולים לתאי חיסון, ומספקת תובנות ייחודיות לגבי מטבוליטים של ויסות מערכת החיסון, אשר עשויים להיות שימושיים לטיפול באימונותרפיה לסרטן השחלות המבוססת על תאי T.
השתמשנו בציטומטריית זרימה גבוהה-ממדית כדי לכמת בו זמנית את צריכת הגלוקוז [2-(N-(7-ניטרופניל-2-אוקסה-1,3-דיאזה-4-יל)אמינו)-2-דאוקסיגלוקוז (2-NBDG) ופעילות מיטוכונדריאלית [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) הם סמנים אופייניים זה לצד זה המבדילים בין תאי חיסון לאוכלוסיות תאי גידול (טבלה S2 ואיור S1A). ניתוח זה הראה כי בהשוואה לתאי T, מיימת ותאי גידול בעלי רמות צריכת גלוקוז גבוהות יותר, אך יש הבדלים קטנים יותר בפעילות המיטוכונדריאלית. צריכת הגלוקוז הממוצעת של תאי גידול [CD45-EpCAM (EpCAM)+] היא פי שלושה עד ארבעה מזו של תאי T, וקליטת הגלוקוז הממוצעת של תאי T CD4+ היא פי 1.2 מזו של תאי T CD8+, דבר המצביע על כך שללימפוציטים חודרים לגידול (TIL) יש דרישות מטבוליות שונות אפילו באותו TME (איור 1A). לעומת זאת, הפעילות המיטוכונדריאלית בתאי הגידול דומה לזו של תאי T מסוג CD4+, ופעילות המיטוכונדריאלית של שני סוגי התאים גבוהה מזו של תאי T מסוג CD8+ (איור 1B). באופן כללי, תוצאות אלו חושפות את הרמה המטבולית. הפעילות המטבולית של תאי הגידול גבוהה מזו של תאי T מסוג CD4+, והפעילות המטבולית של תאי T מסוג CD4+ גבוהה מזו של תאי T מסוג CD8+. למרות השפעות אלו בין סוגי התאים השונים, אין הבדל עקבי במצב המטבולי של תאי T מסוג CD4+ ו-CD8+ או ביחסים היחסיים שלהם במיימת בהשוואה לגידולים (איור 1C). לעומת זאת, בחלק של תאי CD45, שיעור תאי EpCAM+ בגידול גדל בהשוואה למיימת (איור 1D). כמו כן, ראינו הבדל מטבולי ברור בין רכיבי תאי EpCAM+ ו-EpCAM-. לתאי EpCAM+ (גידול) יש ספיגת גלוקוז ופעילות מיטוכונדריאלית גבוהות יותר מאשר לתאי EpCAM-, שהיא גבוהה בהרבה מהפעילות המטבולית של פיברובלסטים בתאי גידול ב-TME (איור 1, E ו-F).
(A ו-B) חציון עוצמת פלואורסצנציה (MFI) של קליטת גלוקוז (2-NBDG) (A) ופעילות מיטוכונדריאלית של תאי CD4 + T (אדום כהה MitoTracker) (B) גרפים מייצגים (שמאל) ונתונים בטבלה (מימין), תאי CD8 + T ותאי EpCAM + CD45-גידול ממיימת וגידול. (C) היחס בין תאי CD4 + ו-CD8 + (מתוך תאי CD3 + T) במיימת ובגידול. (D) שיעור תאי הגידול EpCAM + במיימת ובגידול (CD45−). (E ו-F) קליטת גלוקוז EpCAM + CD45-גידול ומטריצת EpCAM-CD45 (2-NBDG) (E) ופעילות מיטוכונדריאלית (אדום כהה MitoTracker) (F) גרפים מייצגים (שמאל) ונתונים בטבלה (מימין) תאי מיימת ותאי גידול. (G) גרפים מייצגים של ביטוי CD25, CD137 ו-PD1 על ידי ציטומטריית זרימה. (H ו-I) ביטוי CD25, CD137 ו-PD1 על תאי CD4+ T (H) ותאי CD8+ T (I). (J ו-K) פנוטיפים נאיביים, זיכרון מרכזי (Tcm), אפקטור (Teff) וזיכרון אפקטור (Tem) המבוססים על ביטוי של CCR7 ו-CD45RO. תמונות מייצגות (שמאל) ונתונים טבלאיים (מימין) של תאי CD4+ T (J) ותאי CD8+ T (K) במיימת ובגידולים. ערכי P נקבעו על ידי מבחן t מזווג (*P<0.05, **P<0.01 ו-***P<0.001). הקו מייצג חולים תואמים (n = 6). FMO, פלואורסצנציה מינוס אחת; MFI, עוצמת פלואורסצנציה חציונית.
ניתוח נוסף גילה הבדלים משמעותיים נוספים בין הסטטוס הפנוטיפי של תאי T בעלי רזולוציה גבוהה. זיכרון פעיל (איור 1, G עד I) וזיכרון אפקטור (איור 1, J ו-K) בגידולים שכיחים הרבה יותר מאשר מיימת (פרופורציה של תאי T מסוג CD3+). באופן דומה, ניתוח הפנוטיפ לפי ביטוי סמני הפעלה (CD25 ו-CD137) וסמני דלדול [חלבון מוות תאי מתוכנת 1 (PD1)] הראה שלמרות שהמאפיינים המטבוליים של אוכלוסיות אלו שונים (איור S1, B עד E), לא נצפו באופן עקבי הבדלים מטבוליים משמעותיים בין תת-קבוצות נאיביות, אפקטוריות או זיכרון (איור S1, F עד I). תוצאות אלו אושרו באמצעות שיטות למידת מכונה להקצאה אוטומטית של פנוטיפים של תאים (21), מה שחשף עוד יותר את נוכחותם של מספר רב של תאי מח עצם (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) במיימת של המטופל (איור S2A). מבין כל סוגי התאים שזוהו, אוכלוסיית תאים מיאלואידים זו הראתה את ספיגת הגלוקוז והפעילות המיטוכונדריאלית הגבוהות ביותר (איור S2, B עד G). תוצאות אלו מדגישות את ההבדלים המטבוליים החזקים בין סוגי התאים המרובים שנמצאו במיימת ובגידולים בחולי HGSC.
האתגר העיקרי בהבנת המאפיינים המטבונומיים של TIL הוא הצורך לבודד דגימות תאי T בטוהר, איכות וכמות מספקים מגידולים. מחקרים אחרונים הראו ששיטות מיון והעשרת חרוזים המבוססות על ציטומטריית זרימה עשויות להוביל לשינויים בפרופילי מטבוליטים תאיים (22-24). כדי להתגבר על בעיה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת העשרת החרוזים כדי לבודד ולבודד TIL מסרטן שחלות אנושי שנכרת בניתוח לפני ניתוח באמצעות LC-MS/MS (ראה חומרים ושיטות; איור 2A). על מנת להעריך את ההשפעה הכוללת של פרוטוקול זה על שינויים במטבוליטים, השווינו את פרופילי המטבוליטים של תאי T שהופעלו על ידי תורמות בריאות לאחר שלב הפרדת החרוזים הנ"ל עם תאים שלא הופרדו באמצעות חרוזים אך נותרו על קרח. ניתוח בקרת איכות זה מצא כי קיים מתאם גבוה בין שני תנאים אלה (r = 0.77), וחזרתיות הטכנית של קבוצת 86 המטבוליטים היא בעלת חזרתיות גבוהה (איור 2B). לכן, שיטות אלו יכולות לבצע ניתוח מטבוליטים מדויק בתאים שעוברים העשרה בסוגי תאים, ובכך לספק את הפלטפורמה הראשונה ברזולוציה גבוהה לזיהוי מטבוליטים ספציפיים ב-HGSC, ובכך לאפשר לאנשים להשיג הבנה מעמיקה יותר של תוכנית המטבוליזם המיני הספציפיות של התא.
(א) תרשים סכמטי של העשרה בחרוזים מגנטיים. לפני הניתוח באמצעות LC-MS/MS, התאים יעברו שלושה סבבים רצופים של העשרה בחרוזים מגנטיים או יישארו על קרח. (ב) השפעת סוג ההעשרה על שפע המטבוליטים. ממוצע של שלוש מדידות עבור כל סוג העשרה ± SE. הקו האפור מייצג קשר 1:1. המתאם התוך-מחלקתי (ICC) של מדידות חוזרות מוצג בתווית הציר. NAD, ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד. (ג) תרשים סכמטי של תהליך העבודה של ניתוח מטבוליטים של המטופל. מיימת או גידולים נאספים ממטופלים ומשומרים בהקפאה. חלק קטן מכל דגימה נותח באמצעות ציטומטריית זרימה, בעוד שהדגימות הנותרות עברו שלושה סבבי העשרה לתאי CD4+, CD8+ ו-CD45-. שברי תאים אלה נותחו באמצעות LC-MS/MS. (ד) מפת חום של שפע מטבוליטים סטנדרטי. הדנדרוגרמה מייצגת את קיבוץ המרחקים האוקלידיים של וורד בין דגימות. (ה) ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של מפת מטבוליטים של הדגימה, המציג שלושה חזרות של כל דגימה, דגימות מאותו מטופל מחוברות באמצעות קו. (ו) PCA של פרופיל המטבוליטים של הדגימה מותנה במטופל (כלומר, באמצעות יתירות חלקית); סוג הדגימה מוגבל על ידי הקליפה הקמורה. PC1, רכיב ראשי 1; PC2, רכיב ראשי 2.
לאחר מכן, יישמנו שיטת העשרה זו כדי לנתח 99 מטבוליטים בשברים של תאי CD4+, CD8+ ו-CD45 במיימת ראשונית ובגידולים של שישה חולי HGSC (איור 2C, איור S3A וטבלה S3 ו-S4). אוכלוסיית העניין מהווה 2% עד 70% מהמדגם המקורי הגדול של תאים חיים, ושיעור התאים משתנה מאוד בין חולים. לאחר הפרדת החרוזים, השבר המועשר (CD4+, CD8+ או CD45-) מהווה בממוצע יותר מ-85% מכלל התאים החיים בדגימה. שיטת העשרה זו מאפשרת לנו לנתח אוכלוסיות תאים מחילוף החומרים של רקמת גידול אנושית, דבר שבלתי אפשרי לעשות מדגימות גדולות. באמצעות פרוטוקול זה, קבענו כי l-kynurenine ואדנוזין, שני מטבוליטים מדכאי חיסון מאופיינים היטב, היו מוגברים בתאי T סרטניים או בתאי גידול (איור S3, B ו-C). לכן, תוצאות אלו מדגימות את הנאמנות והיכולת של טכנולוגיית הפרדת התאים וספקטרומטריית המסה שלנו למצוא מטבוליטים חשובים מבחינה ביולוגית ברקמות החולים.
הניתוח שלנו גילה גם הפרדה מטבולית חזקה של סוגי תאים בתוך ובין חולים (איור 2D ואיור S4A). בפרט, בהשוואה לחולים אחרים, מטופל 70 הראה מאפיינים מטבוליים שונים (איור 2E ואיור S4B), דבר המצביע על כך שייתכן שיש הטרוגניות מטבולית משמעותית בין חולים. ראוי לציין כי בהשוואה לחולים אחרים (1.2 עד 2 ליטר; טבלה S1), הכמות הכוללת של מיימת שנאספה בחולה 70 (80 מ"ל) הייתה קטנה יותר. הבקרה על ההטרוגניות בין חולים במהלך ניתוח רכיבים עיקריים (לדוגמה, באמצעות ניתוח יתירות חלקית) מראה שינויים עקביים בין סוגי תאים, וסוגי התאים ו/או המיקרו-סביבה מקובצים בבירור בהתאם לפרופיל המטבוליטים (איור 2F). ניתוח מטבוליטים בודדים הדגיש השפעות אלו וחשף הבדלים משמעותיים בין סוגי תאים למיקרו-סביבה. ראוי לציין כי ההבדל הקיצוני ביותר שנצפה הוא MNA, שבדרך כלל מועשר בתאי CD45- ובתאי CD4+ ו-CD8+ שחודרים לגידול (איור 3A). עבור תאי CD4+, השפעה זו בולטת ביותר, ונראה כי גם ה-MNA בתאי CD8+ מושפע מאוד מהסביבה. עם זאת, אין בכך חשיבות, מכיוון שרק שלושה מתוך ששת החולים ניתנים להערכה עבור ציוני CD8+ בגידול. בנוסף ל-MNA, בסוגים שונים של תאים במיימת ובגידולים, מטבוליטים אחרים המאופיינים בצורה גרועה ב-TIL עשירים גם הם באופן דיפרנציאלי (איורים S3 ו-S4). לכן, נתונים אלה חושפים קבוצה מבטיחה של מטבוליטים אימונומודולטוריים למחקר נוסף.
(א) תכולה מנורמלת של MNA בתאי CD4+, CD8+ ו-CD45- ממיימת וגידול. תרשים הקופסאות מציג את החציון (קו), טווח בין-רבעוני (ציר המסגרת) וטווח הנתונים, עד פי 1.5 מהטווח הבין-רבעוני (ציר המסגרת). כמתואר בחומרי ושיטות המטופל, השתמש בערך הלימה של המטופל כדי לקבוע את ערך ה-P (*P<0.05 ו-**P<0.01). (ב) תרשים סכמטי של מטבוליזם של MNA (60). מטבוליטים: S-אדנוזיל-1-מתיונין; SAH, S-אדנוזין-1-הומוציסטאין; NA, ניקוטינאמיד; MNA, 1-מתילניקוטינאמיד; 2-PY, 1-מתיל-2-פירידון-5-קרבוקסמיד; 4-PY, 1-מתיל-4-פירידון-5-קרבוקסמיד; NR, ניקוטינאמיד ריבוז; NMN, מונונוקלאוטיד ניקוטינאמיד. אנזימים (ירוק): NNMT, ניקוטינאמיד N-מתילטרנספראז; SIRT, סירטואינים; NAMPT, ניקוטינאמיד פוספוריבוזיל טרנספראז; AOX1, אלדהיד אוקסידאז 1; NRK, ניקוטינאמיד ריבוזיד קינאז; NMNAT, ניקוטינאמיד מונו נוקלאוטיד אדנילט טרנספראז; Pnp1, פורין נוקלאוזיד פוספורילאז. (C) t-SNE של scRNA-seq של מיימת (אפור) וגידול (אדום; n = 3 חולים). (D) ביטוי NNMT באוכלוסיות תאים שונות שזוהו באמצעות scRNA-seq. (E) ביטוי של NNMT ו-AOX1 בתאי T מסוג SK-OV-3, כליה עוברית אנושית (HEK) 293T, ותאי T שטופלו ב-MNA. הביטוי המקופל מוצג ביחס ל-SK-OV-3. דפוס הביטוי עם SEM מוצג (n = 6 תורמים בריאים). ערכי Ct גדולים מ-35 נחשבים כבלתי ניתנים לגילוי (UD). (ו) ביטוי של SLC22A1 ו-SLC22A2 בתאי T של SK-OV-3, HEK293T ותאי T שטופלו ב-8mM MNA. מוצג הביטוי המקופל יחסית ל-SK-OV-3. מוצג דפוס הביטוי עם SEM (n = 6 תורמים בריאים). ערכי Ct גדולים מ-35 נחשבים בלתי ניתנים לגילוי (UD). (ז) תכולת MNA בתאי T של תורמים בריאים שהופעלו לאחר 72 שעות של דגירה עם MNA. מוצג דפוס הביטוי עם SEM (n = 4 תורמים בריאים).
MNA מיוצר על ידי העברת קבוצת המתיל מ-S-אדנוזיל-1-מתיונין (SAM) לניקוטינאמיד (NA) על ידי ניקוטינאמיד N-מתילטרנספראז (NNMT; איור 3B). NNMT מתבטא ביתר במגוון סוגי סרטן אנושיים והוא קשור לריבוי, פלישה וגרורות (25-27). כדי להבין טוב יותר את מקור ה-MNA בתאי T ב-TME, השתמשנו ב-scRNA-seq כדי לאפיין את הביטוי של NNMT על פני סוגי תאים במיימת ובגידולים של שלושה חולי HGSC (טבלה S5). ניתוח של כ-6,500 תאים הראה שבסביבות מיימת וגידול, ביטוי NNMT הוגבל לאוכלוסיות תאי פיברובלסט וגידול משוערות (איור 3, C ו-D). ראוי לציין כי אין ביטוי NNMT ברור באף אוכלוסייה המבטאת PTPRC (CD45 +) (איור 3D ואיור S5A), דבר המצביע על כך שה-MNA שזוהה בספקטרום המטבוליטים הוכנס לתאי T. הביטוי של אלדהיד אוקסידאז 1 (AOX1) ממיר MNA ל-1-מתיל-2-פירידון-5-קרבוקסמיד (2-PYR) או 1-מתיל-4-פירידון-5-קרבוקסמיד (4-PYR); איור 3B) מוגבל גם לאוכלוסיית הפיברובלסטים המבטאים COL1A1 (איור S5A), אשר יחד מצביעים על כך שתאי T חסרים את היכולת לבצע מטבוליזם קונבנציונלי של MNA. דפוס הביטוי של גנים אלה הקשורים ל-MNA אומת באמצעות מערך נתונים תאים עצמאי שני ממיימת מחולות HGSC (איור S5B; n = 6) (16). בנוסף, ניתוח כמותי של תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) של תאי T בריאים של תורמים שטופלו ב-MNA הראה כי בהשוואה לתאי גידול שחלות SK-OV-3 בקבוצת הביקורת, NNMT או AOX1 כמעט ולא באו לידי ביטוי (איור 3E). תוצאות בלתי צפויות אלו מצביעות על כך ש-MNA עשוי להיות מופרש מפיברובלסטים או מגידולים לתאי T סמוכים ב-TME.
למרות שמועמדים כוללים את משפחת טרנספורטי הקטיונים האורגניים 1 עד 3 (OCT1, OCT2 ו-OCT3) המקודדים על ידי משפחת הנשאים המסיסים 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ו-SLC22A3), טרנספורטי MNA הפוטנציאליים עדיין אינם מוגדרים (28). QPCR של mRNA מתאי T בריאים של תורמים הראה רמות ביטוי נמוכות של SLC22A1 אך רמות בלתי ניתנות לגילוי של SLC22A2, מה שאישר כי דווח בעבר בספרות (איור 3F) (29). לעומת זאת, קו תאי הגידול בשחלות SK-OV-3 ביטא רמות גבוהות של שני טרנספורטי ה- (איור 3F).
על מנת לבחון את האפשרות שלתאי T יש את היכולת לספוג MNA זר, תאי T בריאים מתורמים גודלו במשך 72 שעות בנוכחות ריכוזים שונים של MNA. בהיעדר MNA אקסוגני, לא ניתן לזהות את תכולת ה-MNA התאית (איור 3G). עם זאת, תאי T מופעלים שטופלו ב-MNA אקסוגני הראו עלייה תלוית מינון בתכולת ה-MNA בתאים, עד 6 mM MNA (איור 3G). תוצאה זו מצביעה על כך שלמרות רמת הביטוי הנמוכה של טרנספורטרים וחוסר האנזים העיקרי האחראי על מטבוליזם תוך-תאי של MNA, TIL עדיין יכול לספוג MNA.
ספקטרום המטבוליטים בתאי T של חולים וניסויי ספיגת MNA במבחנה מגבירים את האפשרות שפיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAF) מפרישים MNA ותאי גידול עשויים לווסת את הפנוטיפ והתפקוד של TIL. כדי לקבוע את השפעת MNA על תאי T, תאי T בריאים מתורמים הופעלו במבחנה בנוכחות או בהיעדר MNA, והוערכו התפשטותם וייצור הציטוקינים שלהם. לאחר 7 ימים של הוספת MNA במינון הגבוה ביותר, מספר הכפלת האוכלוסייה ירד במידה בינונית, בעוד שהחיוניות נשמרה בכל המינונים (איור 4A). בנוסף, טיפול ב-MNA אקסוגני הביא לעלייה בשיעור תאי T CD4+ ו-CD8+ המבטאים גורם נמק הגידול-α (TNFα; איור 4B). לעומת זאת, הייצור התוך תאי של IFN-γ ירד משמעותית בתאי T CD4+, אך לא בתאי T CD8+, ולא היה שינוי משמעותי באינטרלוקין 2 (IL-2; איור 4, C ו-D). לכן, בדיקת ELISA (אנזים-קושר אימונוסורבנט) של סופרנטנטים מתרביות תאי T שטופלו ב-MNA הראתה עלייה משמעותית ב-TNFα, ירידה ב-IFN-γ, וללא שינוי ב-IL-2 (איור 4, E עד G). הירידה ב-IFN-γ מצביעה על כך ש-MNA עשוי למלא תפקיד בעיכוב הפעילות האנטי-גידולית של תאי T. על מנת לדמות את השפעת MNA על ציטוטוקסיות בתיווך תאי T, תאי קולטן אנטיגן כימרי T (FRα-CAR-T) המכוונים לקולטן חומצה פולית α ותאי CAR-T (GFP) המווסתים על ידי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -CAR-T מיוצרים על ידי תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC) בריאים מתורם. תאי CAR-T גודלו במשך 24 שעות בנוכחות MNA, ולאחר מכן גודלו יחד עם תאי גידול שחלות אנושיים SK-OV-3 המבטאים קולטן חומצה פולית α ביחס אפקטור למטרה של 10:1. טיפול ב-MNA הביא לירידה משמעותית בפעילות ההרג של תאי FRα-CAR-T, שהייתה דומה לתאי FRα-CAR-T שטופלו באדנוזין (איור 4H).
(א) ספירת תאים חיים כוללת והכפלת אוכלוסייה (PD) ישירות מהתרבית ביום 7. גרף העמודות מייצג את הממוצע + SEM של שישה תורמים בריאים. מייצג נתונים מלפחות n = 3 ניסויים בלתי תלויים. (ב' עד ד') CD3/CD28 ו-IL-2 שימשו להפעלת תאי T בריכוזי ה-MNA שלהם במשך 7 ימים. לפני הניתוח, התאים עברו גירוי עם PMA/יונומיצין עם GolgiStop במשך 4 שעות. ביטוי TNFα (ב') בתאי T. תמונה לדוגמה (משמאל) ונתונים טבלאיים (מימין) של ביטוי TNFα בתאים חיים. ביטוי IFN-γ (ג') ו-IL-2 (ד') בתאי T. ביטוי הציטוקינים נמדד על ידי ציטומטריית זרימה. גרף העמודות מייצג את הממוצע (n = 6 תורמים בריאים) + SEM. השתמש בניתוח שונות חד כיווני ובמדידות חוזרות (*P<0.05 ו-**P<0.01) כדי לקבוע את ערך ה-P. מייצג נתונים מלפחות n = 3 ניסויים בלתי תלויים. (E עד G) CD3/CD28 ו-IL-2 שימשו להפעלת תאי T בריכוזי ה-MNA שלהם במשך 7 ימים. המדיום נאסף לפני ואחרי 4 שעות של גירוי PMA/יונומיצין. ריכוזי TNFα (E), IFN-γ (F) ו-IL-2 (G) נמדדו באמצעות ELISA. גרף העמודות מייצג את הממוצע (n = 5 תורמים בריאים) + SEM. ערך P נקבע באמצעות ניתוח שונות חד כיווני ומדידות חוזרות (*P<0.05). הקו המקווקו מציין את גבול הגילוי של הגילוי. (H) מבחן ליזיס תאים. תאי FRα-CAR-T או GFP-CAR-T הותאמו עם אדנוזין (250μM) או MNA (10 mM) למשך 24 שעות, או נותרו ללא טיפול (Ctrl). אחוז ההרג של תאי SK-OV-3 נמדד. ערך P נקבע על ידי מבחן t של וולץ' (*P<0.5 ו- **P<0.01).
על מנת להבין את הביטוי של TNFα התלוי ב-MNA, הוערכו השינויים ב-mRNA של TNFα בתאי T שטופלו ב-MNA (איור 5A). תאי T בריאים מתורמים שטופלו ב-MNA הראו עלייה כפולה ברמות שעתוק TNFα, דבר המצביע על כך ש-MNA תלוי בוויסות שעתוק של TNFα. כדי לחקור מנגנון בקרה אפשרי זה, הוערכו שני גורמי שעתוק ידועים המווסתים את TNFα, כלומר גורם גרעיני של תאי T פעיל (NFAT) וחלבון ספציפי 1 (Sp1), בתגובה לקשירת MNA לפרומוטר TNFα הפרוקסימלי (30). פרומוטר TNFα מכיל 6 אתרי קישור NFAT מזוהים ו-2 אתרי קישור Sp1, החופפים באתר אחד [-55 זוגות בסיסים (bp) מהקאפ 5'] (30). אימונופרסיפיטציה של כרומטין (ChIP) הראתה שכאשר טופלו ב-MNA, קישור Sp1 לפרומוטר TNFα גדל פי שלושה. שילוב NFAT גם הוא גדל והתקרב לחשיבותו (איור 5B). נתונים אלה מצביעים על כך ש-MNA מווסת את הביטוי של TNFα דרך תעתוק Sp1, ובמידה פחותה את הביטוי של NFAT.
(א) בהשוואה לתאי T שגודלו ללא MNA, שינוי קיפול הביטוי של TNFα בתאי T שטופלו ב-MNA. דפוס הביטוי עם SEM מוצג (n = 5 תורמים בריאים). מייצג נתונים מלפחות n = 3 ניסויים בלתי תלויים. (ב) פרומוטר TNFα של תאי T שטופלו עם או בלי 8 mM MNA לאחר NFAT ו-Sp1 שולבו עם (Ctrl) וגירוי PMA/יונומיצין למשך 4 שעות. אימונוגלובולין G (IgG) ו-H3 שימשו כבקרות שליליות וחיוביות לאימונופרציפיטציה, בהתאמה. כימות ה-ChIP הראה כי קישור Sp1 ו-NFAT לפרומוטר TNFα בתאים שטופלו ב-MNA גדל פי מספר בהשוואה לביקורת. מייצג נתונים מלפחות n = 3 ניסויים בלתי תלויים. ערך P נקבע על ידי מבחני t מרובים (*** P <0.01). (ג) בהשוואה למיימת של HGSC, תאי T (לא ציטוטוקסיים) הראו ביטוי מוגבר של TNF בגידול. הצבעים מייצגים חולים שונים. התאים המוצגים נדגמו באופן אקראי ל-300 ועברו ריצוד כדי להגביל את תהליך השרטוט (** Padj = 0.0076). (ד) מודל מוצע של MNA לסרטן השחלות. MNA מיוצר בתאי גידול ופיברובלסטים ב-TME ונספג על ידי תאי T. MNA מגביר את הקישור של Sp1 לפרומוטר TNFα, מה שמוביל לעלייה בתעתוק TNFα ולייצור ציטוקינים של TNFα. MNA גורם גם לירידה ב-IFN-γ. עיכוב תפקוד תאי T מוביל ליכולת ההרג מופחתת ולצמיחה מואצת של הגידול.
על פי דיווחים, ל-TNFα יש השפעות אנטי-גידוליות ואנטי-גידוליות תלויות קדמית ואחורית, אך יש לו תפקיד ידוע בקידום הצמיחה והגרורות של סרטן השחלות (31-33). על פי דיווחים, ריכוז ה-TNFα במיימת וברקמות גידול בחולות סרטן השחלות גבוה יותר מזה שברקמות שפירות (34-36). מבחינת מנגנון, TNFα יכול לווסת את ההפעלה, התפקוד וההתרבות של תאי דם לבנים, ולשנות את הפנוטיפ של תאי סרטן (37, 38). בהתאם לממצאים אלה, ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי הראה כי TNF היה מווסת באופן משמעותי כלפי מעלה בתאי T ברקמות גידול בהשוואה למיימת (איור 5C). העלייה בביטוי TNF ניכרה רק באוכלוסיות תאי T עם פנוטיפ לא ציטוטוקסי (איור S5A). לסיכום, נתונים אלה תומכים בדעה של-MNA יש השפעות כפולות מדכאות חיסון ומקדמות גידול בסרטן שחלות (HGSC).
סימון פלואורסצנטי המבוסס על ציטומטריית זרימה הפך לשיטה העיקרית לחקר מטבוליזם של TIL. מחקרים אלה הראו כי בהשוואה ללימפוציטים בדם היקפי או לתאי T מאיברי לימפואידים משניים, ל-TIL עכברי ואנושי יש נטייה גבוהה יותר לקלוט גלוקוז (4, 39) ואובדן הדרגתי של תפקוד המיטוכונדריה (19, 40). למרות שראינו תוצאות דומות במחקר זה, הפיתוח המרכזי הוא להשוות את מטבוליזם תאי הגידול ו-TIL מאותה רקמת גידול שנכרתה. בהתאם לחלק מהדיווחים הקודמים הללו, לתאי גידול (CD45-EpCAM +) ממיימת וגידולים יש ספיגת גלוקוז גבוהה יותר מאשר לתאי T CD8 + ו-CD4 +, דבר התומך בכך שניתן להשוות את ספיגת הגלוקוז הגבוהה של תאי גידול לתאי T. מושג התחרות בתאי T. TME. עם זאת, הפעילות המיטוכונדריאלית של תאי גידול גבוהה יותר מזו של תאי T CD8 +, אך הפעילות המיטוכונדריאלית דומה לזו של תאי T CD4 +. תוצאות אלה מחזקות את הנושא המתהווה שמטבוליזם חמצוני חשוב לתאי גידול (41, 42). הם גם מציעים שתאי T מסוג CD8+ עשויים להיות רגישים יותר לתפקוד לקוי חמצוני מאשר תאי T מסוג CD4+, או שתאי T מסוג CD4+ עשויים להשתמש במקורות פחמן שאינם גלוקוז כדי לשמור על פעילות מיטוכונדריאלית (43, 44). יש לציין שלא ראינו הבדל בספיגת גלוקוז או בפעילות מיטוכונדריאלית בין תאי אפקטור T מסוג CD4+, תאי זיכרון אפקטור T ותאי זיכרון מרכזיים מסוג T במיימת. באופן דומה, למצב ההתמיינות של תאי T מסוג CD8+ בגידולים אין שום קשר לשינויים בספיגת גלוקוז, דבר המדגיש את ההבדל המשמעותי בין תאי T שגודלו במבחנה לבין תאי TIL אנושיים in vivo (22). תצפיות אלו אושרו גם על ידי שימוש בהקצאת אוכלוסיית תאים אוטומטית ובלתי מוטה, אשר גילתה עוד שתאי CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ עם ספיגת גלוקוז ופעילות מיטוכונדריאלית גבוהה יותר מאשר תאי גידול נפוצים אך בעלי אוכלוסיית תאים פעילים מטבולית. אוכלוסייה זו עשויה לייצג את תת-האוכלוסייה המשוערת של תאי מדכאי מיאלואידים או תאים דנדריטים פלסמציטואידים שזוהו בניתוח scRNA-seq. למרות ששני אלה דווחו בגידולי שחלות אנושיים [45], עדיין נדרשת עבודה נוספת כדי לתאר את תת-אוכלוסיית המיאלואידים הזו.
למרות ששיטות מבוססות ציטומטריית זרימה יכולות להבהיר את ההבדלים הכלליים בחילוף החומרים של גלוקוז וחמצון בין סוגי תאים, המטבוליטים המדויקים המיוצרים על ידי גלוקוז או מקורות פחמן אחרים עבור חילוף החומרים המיטוכונדריאלי ב-TME טרם נקבעו. שיוך נוכחות או היעדרות של מטבוליטים לתת-קבוצה נתונה של TIL דורש טיהור של אוכלוסיית התאים מהרקמה שנכרתה. לכן, שיטת העשרת התאים שלנו בשילוב עם ספקטרומטריית מסות יכולה לספק תובנות לגבי המטבוליטים המועשרים באופן דיפרנציאלי בתאי T ובאוכלוסיות תאי גידול בדגימות מטופלים תואמות. למרות שלשיטה זו יתרונות על פני מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה, ספריות מטבוליטים מסוימות עשויות להיות מושפעות עקב יציבות מובנית ו/או קצב תחלופה מהיר (22). אף על פי כן, השיטה שלנו הצליחה לזהות שני מטבוליטים מדכאי חיסון מוכרים, אדנוזין וקינורנין, מכיוון שהם משתנים מאוד בין סוגי הדגימות.
הניתוח המטבונומי שלנו של גידולים ותת-סוגי TIL מספק תובנות נוספות לגבי תפקיד המטבוליטים בתאי TME שחלתיים. ראשית, באמצעות ציטומטריית זרימה, קבענו כי לא היה הבדל בפעילות המיטוכונדריה בין גידולים לתאי T CD4 +. עם זאת, ניתוח LC-MS/MS גילה שינויים משמעותיים בשפע המטבוליטים בקרב אוכלוסיות אלו, דבר המצביע על כך שמסקנות לגבי מטבוליזם של TIL ופעילותו המטבולית הכוללת דורשות פרשנות זהירה. שנית, MNA הוא המטבוליט עם ההבדל הגדול ביותר בין תאי CD45 לתאי T במיימת, ולא בגידולים. לכן, חלוקה למידור ומיקום הגידול עשויות להיות בעלות השפעות שונות על מטבוליזם של TIL, דבר המדגיש את ההטרוגניות האפשרית בסביבה מיקרוסקופית נתונה. שלישית, הביטוי של האנזים NNMT המייצר MNA מוגבל בעיקר ל-CAF, שהוא תאי גידול במידה פחותה, אך רמות MNA ניתנות לזיהוי נצפות בתאי T שמקורם בגידול. לביטוי יתר של NNMT ב-CAF שחלתי יש השפעה ידועה המקדמת סרטן, בין היתר בשל קידום מטבוליזם של CAF, פלישת גידול וגרורות (27). למרות שרמת ה-TIL הכוללת בינונית, הביטוי של NNMT בתאי CAF קשור קשר הדוק לתת-סוג המזנכימלי של אטלס הגנום של הסרטן (TCGA), המקושר לפרוגנוזה גרועה (27, 46, 47). לבסוף, הביטוי של האנזים AOX1 האחראי על פירוק MNA מוגבל גם לאוכלוסיית ה-CAF, דבר המצביע על כך שתאי T חסרים את היכולת לעכל MNA. תוצאות אלו תומכות ברעיון שלמרות שנדרשת עבודה נוספת כדי לאמת ממצא זה, רמות גבוהות של MNA בתאי T עשויות להצביע על נוכחות של מיקרו-סביבה מדכאת חיסון של CAF.
בהינתן רמת הביטוי הנמוכה של טרנספורטי MNA והרמות הבלתי ניתנות לגילוי של חלבונים מרכזיים המעורבים במטבוליזם של MNA, נוכחותו של MNA בתאי T אינה צפויה. לא ניתן היה לזהות NNMT ולא AOX1 באמצעות ניתוח scRNA-seq ו-qPCR ממוקד של שתי קבוצות בלתי תלויות. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-MNA אינו מסונתז על ידי תאי T, אלא נספג מתאי TME שמסביב. ניסויים חוץ גופיים מראים שתאי T נוטים לצבור MNA אקסוגניים.
מחקרים חוץ גופיים שלנו הראו כי MNA אקסוגני גורם לביטוי של TNFα בתאי T ומשפר את הקישור של Sp1 לפרומוטר TNFα. למרות של-TNFα יש גם פונקציות אנטי-גידוליות וגם אנטי-גידוליות, בסרטן השחלות, TNFα יכול לקדם את הצמיחה של סרטן השחלות (31-33). ניטרול TNFα בתרבית תאי גידול בשחלות או חיסול אות TNFα במודלים של עכברים יכולים לשפר את ייצור הציטוקינים הדלקתיים בתיווך TNFα ולעכב את צמיחת הגידול (32, 35). לכן, במקרה זה, MNA שמקורו ב-TME יכול לפעול כמטבוליט פרו-דלקתי דרך מנגנון תלוי TNFα דרך הלולאה האוטוקרינית, ובכך לקדם את הופעת הסרטן וההתפשטות של סרטן השחלות (31). בהתבסס על אפשרות זו, חסימת TNFα נחקרת כגורם טיפולי פוטנציאלי לסרטן השחלות (37, 48, 49). בנוסף, MNA פוגע בציטוטוקסיות של תאי CAR-T לתאי גידול בשחלות, ומספק ראיות נוספות לדיכוי חיסוני בתיווך MNA. יחד, תוצאות אלו מצביעות על מודל שבו גידולים ותאי CAF מפרישים MNA לתוך TME חוץ-תאי. באמצעות (i) גירוי צמיחת סרטן השחלות המושרה על ידי TNF ו-(ii) עיכוב פעילות ציטוטוקסית המושרה על ידי MNA, ייתכן שיש לכך השפעה כפולה על הגידול (איור 5D).
לסיכום, על ידי שילוב של העשרה מהירה של תאים, ריצוף תאים בודדים ויצירת פרופיל מטבולי, מחקר זה חשף את ההבדלים האימונו-מטבולומיים העצומים בין גידולים ותאי מיימת בחולי HGSC. ניתוח מקיף זה הראה כי קיימים הבדלים בקליטת גלוקוז ובפעילות המיטוכונדריה בין תאי T, וזיהה MNA כמטבוליט מווסת חיסוני אוטונומי שאינו תאי. לנתונים אלה יש השפעה על האופן שבו TME משפיע על חילוף החומרים של תאי T בסרטן אנושי. למרות שדווח על תחרות ישירה על חומרים מזינים בין תאי T לתאי סרטן, מטבוליטים יכולים לשמש גם כווסתים עקיפים כדי לקדם את התקדמות הגידול ואולי לדכא תגובות חיסוניות אנדוגניות. תיאור נוסף של התפקיד התפקודי של מטבוליטים מווסתים אלה עשוי לפתוח אסטרטגיות חלופיות לשיפור התגובה החיסונית נגד גידולים.
דגימות ונתונים קליניים של מטופלים הושגו דרך מאגר רקמות הגידול הסרטני של קולומביה הבריטית, המאושר על ידי רשת מאגרי הרקמות הקנדית. בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לחקר הסרטן של קולומביה הבריטית ואוניברסיטת קולומביה הבריטית (H07-00463), כל הדגימות והנתונים הקליניים של המטופלים קיבלו הסכמה מדעת בכתב או ויתרו רשמית על הסכמתם. הדגימות מאוחסנות בביו-בנק המאושר (BRC-00290). מאפייני מטופלים מפורטים מוצגים בטבלאות S1 ו-S5. לצורך שימור קריוגני, משתמשים בסכין מנתחים לפירוק מכני של דגימת הגידול של המטופל ולאחר מכן דחיפתה דרך פילטר של 100 מיקרון לקבלת תרחיף תא בודד. מיימת המטופל סורכזה ב-1500 סל"ד למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי ליצור גלולות של התאים ולהסיר את הסופרנטנט. תאים שהתקבלו מגידול ומיימת עברו הקפאה ב-50% סרום אנושי AB מומת בחום (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ו-10% דימתיל סולפוקסיד. תרחיפים אלו של תאים בודדים שהוחמצו הופשרו ושימשו לקביעת מטבולומיקה ומטבוליטים המתוארים להלן.
המדיום המלא מורכב מ-0.22 מיקרומטר מסונן 50:50 בתוספת RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-גלוטמין (Thermo Fisher Scientific) בתוספת 10% סרום אנושי AB מומת בחום (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-גלוטמין (Thermo Fisher Scientific), תמיסת פניצילין סטרפטומיצין אחת (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) ו-50 מיקרו-MB מרקפטואתנול. ל-AimV (Invitrogen) בתוספת 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) ו-2 mM l-גלוטמין (Thermo Fisher Scientific). בופר הצביעה של ציטומטר הזרימה כלל 0.22 מיקרומטר תמיסת מלח פוספט מסוננת (PBS; Invitrogen) בתוספת 3% סרום אנושי AB מומת בחום (Sigma). בופר העשרת התאים מורכב מ-PBS מסונן בריכוז 0.22 מיקרומטר בתוספת 0.5% סרום אנושי AB מומת בחום (Sigma-Aldrich).
במדיום מלא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, התאים נצבעו ב-10 ננומטר MT DR ו-100 מיקרומטר 2-NBDG למשך 30 דקות. לאחר מכן, התאים נצבעו בצבע הכדאיות eF506 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. יש להשעות מחדש את התאים ב-FC Block (eBioscience) וב-Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), לדלל אותם בבופר צביעה באמצעות ציטומטריית זרימה (בהתאם להוראות היצרן), ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לצבוע את התאים בקבוצת נוגדנים (טבלה S2) בבופר צביעה באמצעות ציטומטריית זרימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. יש להשעות מחדש את התאים בבופר צביעה באמצעות ציטומטריית זרימה (Cytek Aurora; תצורת 3L-16V-14B-8R) לפני הניתוח. יש להשתמש ב-SpectroFlo וב-FlowJo V10 כדי לנתח נתוני ספירת תאים, ולהשתמש ב-GraphPad Prism 8 כדי ליצור את הנתונים. עוצמת הפלואורסצנציה החציונית (MFI) של 2-NBDG ו-MT DR עברה מנורמל לוגריתמי, ולאחר מכן נעשה שימוש במבחן t מזווג לניתוח סטטיסטי כדי להתחשב בחולים תואמים. יש להסיר מהניתוח את כל האוכלוסיות עם פחות מ-40 אירועים; יש להזין ערך MFI של 1 עבור כל ערך שלילי לפני ביצוע ניתוח סטטיסטי והדמיה של הנתונים.
כדי להשלים את אסטרטגיית ה-gating הידנית של לוח התהליך הנ"ל, השתמשנו בביאור המלא של עץ הגבלת הצורה (FAUST) (21) כדי להקצות תאים באופן אוטומטי לאוכלוסייה לאחר סילוק תאים מתים ב-FlowJo. אנו מנהלים ידנית את הפלט כדי למזג אוכלוסיות שנראות כאילו הוקצו בצורה שגויה (שילוב תאי PD1+ עם תאי PD1-גידול) ואוכלוסיות שנשמרו. כל דגימה מכילה בממוצע יותר מ-2% תאים, עבור סך של 11 אוכלוסיות.
צנטריפוגה בצפיפות גרדיאנט Ficoll שימשה להפרדת PBMC מתוצרי הפרדת לויקוציטים (STEMCELL Technologies). תאי T מסוג CD8+ בודדו מ-PBMC באמצעות CD8 MicroBeads (Miltenyi) והורחבו במדיום מלא באמצעות TransAct (Miltenyi) למשך שבועיים בהתאם להוראות היצרן. התאים הותירו לעמוד למשך 5 ימים במדיום מלא המכיל IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), ולאחר מכן עברו גירוי חוזר באמצעות TransAct. ביום 7, בהתאם להוראות היצרן, נעשה שימוש ב-CD45 MicroBeads אנושיים (Miltenyi) להעשרת תאים בשלושה סבבים רצופים. התאים חולקו לניתוח ציטומטריית זרימה (כמתואר לעיל), ומיליון תאים חולקו שלוש פעמים לניתוח LC-MS/MS. הדגימות עובדו באמצעות LC-MS/MS כמתואר להלן. הערכנו את ערך המטבוליט החסר עם מספר יונים של 1,000. כל דגימה מנורמלת לפי מספר היונים הכולל (TIC), מומרת לוגריתמית ומנורמלת אוטומטית ב-MetaboAnalystR לפני הניתוח.
תרחיף התאים הבודדים של כל מטופל הופשר וסונן דרך פילטר של 40 מיקרומטר לתוך מצע מלא (כמתואר לעיל). בהתאם לפרוטוקול של היצרן, שלושה סבבים רצופים של סלקציה חיובית על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים באמצעות MicroBeads (Miltenyi) שימשו להעשרת הדגימות לתאי CD8+, CD4+ ו-CD45- (על קרח). בקצרה, התאים מושעים מחדש בבופר העשרת תאים (כמתואר לעיל) ונספרו. התאים הודגרו עם חרוזי CD8 אנושיים, חרוזי CD4 אנושיים או חרוזי CD45 אנושיים (Miltenyi) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן נשטפו עם בופר העשרת תאים. הדגימה מועברת דרך עמודת LS (Miltenyi), והמקטעים החיוביים והשליליים נאספים. על מנת להפחית את משך הזמן ולמקסם את שלב שחזור התאים, מקטע CD8 משמש לאחר מכן לסבב השני של העשרת CD4+, ומקטע CD4 משמש להעשרת CD45 לאחר מכן. יש לשמור את התמיסה על קרח לאורך כל תהליך ההפרדה.
כדי להכין דגימות לניתוח מטבוליטים, התאים נשטפו פעם אחת בתמיסת מלח קרה כקרח, ולכל דגימה נוסף 1 מ"ל של מתנול 80%, לאחר מכן עורבבו בוורטקס והוקפאו במהירות בחנקן נוזלי. הדגימות עברו שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה ועברו צנטריפוגה במהירות של 14,000 סל"ד למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הנוזל העליון המכיל את המטבוליטים התאדה עד לייבוש. המטבוליטים הומסו מחדש ב-50 מיקרוליטר של חומצה פורמית 0.03%, עורבבו בוורטקס לערבוב, ולאחר מכן עברו צנטריפוגה להסרת פסולת.
חילצו מטבוליטים כמתואר לעיל. העבירו את הנוזל העליון לבקבוק כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים למחקר מטבולומיקה. השתמשו בפרוטוקול טיפול אקראי כדי לטפל בכל דגימה במספר דומה של תאים כדי למנוע אפקטים של אצווה. ביצענו הערכה איכותית של מטבוליטים גלובליים שפורסמו בעבר בספקטרומטר מסות AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole (50). ניתוח כרומטוגרפי ואינטגרציה של שטח שיא בוצעו באמצעות תוכנת MultiQuant גרסה 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
ספירת יונים של 1000 שימשה להערכת ערך המטבוליט החסר, וה-TIC של כל דגימה שימשה לחישוב שטח השיא המנורמל של כל מטבוליט שזוהה כדי לתקן שינויים שהוכנסו על ידי הניתוח האינסטרומנטלי מעיבוד הדגימה. לאחר הנורמל של ה-TIC, MetaboAnalystR(51) (פרמטר ברירת מחדל) משמש להמרה לוגריתמית וקנה מידה אוטומטי של קו נורמה. השתמשנו ב-PCA עם חבילת vegan R כדי לבצע ניתוח חקרני של הבדלי מטבולים בין סוגי דגימות, והשתמשנו בניתוח יתירות חלקי כדי לנתח מטופלים. השתמשנו בשיטת Ward כדי לבנות דנדרוגרמה של מפת חום כדי לאשכול את המרחק האוקלידי בין דגימות. השתמשנו בלימה (52) על שפע מטבוליטים סטנדרטי כדי לזהות מטבוליטים בשפע דיפרנציאלי על פני כל סוג התא והמיקרו-סביבה. על מנת לפשט את ההסבר, אנו משתמשים בפרמטר ממוצע הקבוצה כדי לציין את המודל, ורואים את סוגי התאים במיקרו-סביבה כקבוצה (n = 6 קבוצות); עבור מבחן המובהקות, ביצענו שלוש מדידות חוזרות עבור כל מטבוליט. על מנת למנוע שכפול שגוי, המטופל נכלל כמכשול בתכנון הלימה. על מנת לבדוק את ההבדלים במטבוליטים בין מטופלים שונים, התאמנו את מודל הלימה כך שיכלל את המטופלים באופן קבוע. אנו מדווחים על המובהקות של הניגוד שנקבע מראש בין סוג התא למיקרו-סביבה של Padj <0.05 (תיקון בנג'מיני-הוכברג).
לאחר העשרת מרץ באמצעות ערכת Miltenyi Dead Cell Removal Kit (כדאיות >80%), בוצע ריצוף טרנסקריפטום של תאים בודדים על סך דגימות מיימת וגידול קפואים חיים באמצעות פרוטוקול ביטוי גנים 10x 5′. חמישה מקרים עם גידולים ומיימת תואמים נותחו, אם כי הכדאיות הנמוכה מדגימת גידול אחת מנעה את הכללתה. על מנת להשיג סלקציות מרובות של חולים, שילבנו את הדגימות של כל מטופל בנתיבי בקר כרום 10x, וניתחנו את אתרי המיימת והגידול בנפרד. לאחר ריצוף [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp קצה מזווג (PE), גנום קוויבק; ממוצע של 73,488 ו-41,378 קריאות לתא עבור גידול ומיימת בהתאמה]], השתמשנו ב-CellSNP וב-Vireo (53) (מבוסס על CellSNP כ-. ה-SNP האנושי הנפוץ (VCF) המסופק על ידי GRCh38 מקבל זהות תורם. אנו משתמשים ב-SNPRelate כדי להסיק את הזהות הקרובה ביותר (IBS) של סטטוס הגנוטיפ (IBS) של המטופל, לא כולל תאים שלא הוקצו ותאים שזוהו כדופלקסים ותורמים תואמים בין דגימות מיימת לדגימות גידול (54). על סמך משימה זו, שמרנו שלושה מקרים עם ייצוג תאים עשיר בגידול ובמיימת לניתוח במורד הזרם. לאחר ביצוע שלב סינון המוני באריזת ה-Scater (55) וה-Scran (56) של BioConductor, זה הניב 6975 תאים (2792 ו-4183 תאים מהגידול וממיימת, בהתאמה) לניתוח. אנו משתמשים באשכול Louvain של רשת שכנים קרובה משותפת (SNN) של igraph (57) בהתבסס על מרחק Jaccard לתאי אשכול לפי ביטוי. ה- אשכולות סומנו ידנית לסוגי תאים משוערים בהתבסס על ביטוי גנים של סמנים והוצגו באמצעות t-SNE. תאי T ציטוטוקסיים מוגדרים על ידי ביטוי של CD8A ו-GZMA, למעט תת-אשכולות עם ביטוי נמוך של חלבון ריבוזומלי. ניגשנו לנתונים שפורסמו על ידי איזאר ואחרים (16), כולל הטמעת t-SNE שלהם, שיכולה לשלוט בחפיפת הביטוי בין סמני תאי חיסון לביטוי NNMT.
תאי PBMC הופרדו מתוצרי הפרדת לויקוציטים (STEMCELL Technologies) באמצעות צנטריפוגה בצפיפות גרדיאנט של Ficoll. תאי CD3+ בודדו מ-PBMC באמצעות חרוזי CD3 (Miltenyi). בנוכחות או בהיעדר MNA, תאי CD3+ הופעלו באמצעות CD3 קשור לצלחת (5μg/ml), CD28 מסיס (3μg/ml) ו-IL-2 (300 U/ml; Proleukin). ביום האחרון של ההתפשטות, הכדאיות (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) והפרוליפרציה (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) הוערכו באמצעות ציטומטריית זרימה. יש להעריך את תפקוד האפקטור על ידי גירוי תאים עם PMA (20 ננוגרם/מ"ל) ויונומיצין (1 מיקרוגרם/מ"ל) עם GolgiStop למשך 4 שעות, ולנטר CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ו-TNFα-פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) (MAb11, BD). יש לגירוי תאי qPCR ו-ChIP עם PMA (20 ננוגרם/מ"ל) ויונומיצין (1 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 4 שעות. נוזל העל-תמציתי של ELISA נאסף לפני ואחרי גירוי עם PMA (20 ננוגרם/מ"ל) ויונומיצין (1 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 4 שעות.
יש לפעול לפי הפרוטוקול של היצרן כדי לבודד RNA באמצעות ערכת RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). יש להשתמש ב-QIAshredder (QIAGEN) כדי לבצע הומוגניזציה של הדגימה. יש להשתמש בערכת RNA ל-cDNA בעלת קיבולת גבוהה (Thermo Fisher Scientific) כדי לסנתז DNA משלים (cDNA). יש להשתמש ב-TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) כדי לכמת את ביטוי הגנים (בהתאם לפרוטוקול של היצרן) עם הגששים הבאים: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [גליצראלדהיד-3-פוספט מחוץ למימן (GAPDH)] ו-Hs01010726_m1 (SLC22A2). הדגימות נערכו במערכת StepOnePlus PCR בזמן אמת (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) בצלחת תגובה אופטית מהירה של MicroAmp בעלת 96 בארות (Applied Biosystems) עם סרט אופטי של MicroAmp. כל ערך Ct העולה על 35 נחשב מעל סף הגילוי ומסומן כבלתי ניתן לגילוי.
בצעו את תהליך ה-ChIP כפי שתואר קודם לכן (58). בקצרה, התאים טופלו בפורמלדהיד (ריכוז סופי 1.42%) והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. השתמשו בבופר נפיחות מוגבר (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl ו-0.1% NP-40) על קרח למשך 10 דקות, ולאחר מכן השעיו מחדש בבופר אימונופרסיפיטציה כמתואר (58). לאחר מכן הדגימה עברה סוניקציה במחזורים הבאים: 10 מחזורים (20 פולסים של שנייה אחת) וזמן סטטי של 40 שניות. הדגרו נוגדנים של אימונוגלובולין G בדרגת ChIP (Cell Signaling Technology; 1μl), היסטון H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ו-SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) עם הדגימה ב-4°CC ונערו למשך הלילה. דגירה של חרוזי חלבון A (Thermo Fisher Scientific) עם הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך ניעור עדין במשך שעה, לאחר מכן שימוש בחרוזי צ'לקס (Bio-Rad) להעשרת ה-DNA, והשתמש בפרוטאינאז K (Thermo Fisher) לעיכול חלבונים. פרומוטר TNFα זוהה על ידי PCR: קדימה, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; לעומת זאת, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (תוצר של 207 בסיסים). התמונות הופקו על ידי Image Lab (Bio-Rad) וכימותו באמצעות תוכנת ImageJ.
נוזל העל-תאי של תרבית התאים נאסף כמתואר לעיל. הקביעה בוצעה בהתאם להליכי היצרן של ערכת ELISA של TNFα אנושי (Invitrogen), ערכת ELISA של IL-2 אנושי (Invitrogen) וערכת ELISA של IFN-γ אנושי (Abcam). בהתאם לפרוטוקול היצרן, נוזל העל-תאי דולל ביחס של 1:100 לגילוי TNFα ו-IL-2, וביחס של 1:3 לגילוי IFN-γ. השתמש ב-EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) למדידת ספיגה ב-450 ננומטר.
תאי PBMC הופרדו מתוצרי הפרדת לויקוציטים (STEMCELL Technologies) באמצעות צנטריפוגה בצפיפות גרדיאנט של Ficoll. תאי CD3+ בודדו מ-PBMC באמצעות חרוזי CD3 (Miltenyi). בנוכחות או בהיעדר MNA, תאי CD3+ הופעלו באמצעות CD3 קשור לצלחת (5 מיקרוגרם/מ"ל), CD28 מסיס (3 מיקרוגרם/מ"ל) ו-IL-2 (300 יחידות/מ"ל; Proleukin) למשך 3 ימים. לאחר 3 ימים, התאים נאספו ונשטפו עם תמיסת מלח 0.9%, והגלולה הוקפאה במהירות. ספירת תאים בוצעה באמצעות ציטומטריית זרימה (Cytek Aurora; תצורת 3L-16V-14B-8R) באמצעות חרוזי אלקטרוניים של 123 ספירות.
מטבוליטים של התמצית כמתואר לעיל. התמצית היבשה שוחזרה בריכוז של 4000 אקוויוולנטים תאים/מיקרוליטר. נתחו את הדגימה באמצעות כרומטוגרפיית פאזה הפוכה (1290 Infinity II, Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה) ועמודת CORTECS T3 (2.1×150 מ"מ, גודל חלקיקים 1.6 מיקרומטר, גודל נקבוביות 120Å; #186008500, Waters). ספקטרומטר מסות פולארי (6470, Agilent), שבו יינון אלקטרוספריי פועל במצב חיובי. פאזה ניידת A היא 0.1% חומצה פורמית (ב-H2O), פאזה ניידת B היא 90% אצטוניטריל, 0.1% חומצה פורמית. גרדיאנט ה-LC הוא 0 עד 2 דקות עבור 100% A, 2 עד 7.1 דקות עבור 99% B, ו-7.1 עד 8 דקות עבור 99% B. לאחר מכן, יש לאזן מחדש את העמודה עם פאזה ניידת A בקצב זרימה של 0.6 מ"ל/דקה למשך 3 דקות. קצב הזרימה הוא 0.4 מ"ל/דקה, ותא העמודה מחומם ל-50 מעלות צלזיוס. יש להשתמש בתקן הכימי הטהור של MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, צפון יורק, אונטריו, קנדה) כדי לקבוע את זמן השמירה (RT) והטרנספורמציה (RT = 0.882 דקות, טרנספורמציה 1 = 137→94.1, טרנספורמציה 2 = 137→92, המרה 3 = 137→78). כאשר כל שלושת המעברים מתרחשים בזמן השמירה הנכון, מעבר 1 משמש לכימות כדי להבטיח ספציפיות. עקומת הסטנדרט של MNA (חברת Toronto Research Chemical) נוצרה על ידי שש דילולים סדרתיים של תמיסת הבסיס (1 מ"ג/מ"ל) כדי לקבל סטנדרטים של 0.1, 1.0, 10 ו-100 ננוגרם/מ"ל ו-1.0 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל בהתאמה. גבול הגילוי הוא 1 ננוגרם/מ"ל, והתגובה הליניארית היא בין 10 ננוגרם/מ"ל ל-10 מיקרוגרם/מ"ל. כל הזרקה של שני מיקרוליטר של דגימה וסטנדרט משמשת לניתוח LC/MS, ודגימת בקרת איכות מעורבת מופעלת כל שמונה הזרקות כדי להבטיח את יציבות פלטפורמת הניתוח. תגובות ה-MNA של כל דגימות התאים שטופלו ב-MNA היו בטווח הליניארי של הבדיקה. ניתוח הנתונים בוצע באמצעות תוכנת ניתוח כמותי MassHunter (גרסה 9.0, Agilent).
מבנה הדור השני של αFR-CAR נלקח מ-Song ואחרים (59). בקצרה, המבנה מכיל את התכנים הבאים: רצף מוביל של CD8a, מקטע משתנה חד-שרשרתי ספציפי ל-αFR אנושי, אזור ציר ואזור טרנסממברנלי של CD8a, תחום תוך-תאי של CD27 ודומיין תוך-תאי של CD3z. רצף ה-CAR המלא סונתז על ידי GenScript, ולאחר מכן שובט לתוך וקטור ביטוי לנטי-ויראלי מהדור השני במעלה הזרם של קסטה של ​​ביטוי GFP ששימשה להערכת יעילות ההעברה.
נגיף הלנטי מיוצר על ידי טרנספקציה של תאי HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); גודל במדיום Dulbecco's Modified Eagle המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% PenStrep, תוך שימוש בוקטור CAR-GFP ופלסמידי האריזה (psPAX2 ו-pMD2.G, Addgene) משתמשים בליפופקשן אמין (Sigma-Aldrich). הנוזל העליון המכיל את הנגיף נאסף 48 ו-72 שעות לאחר הטרנספקציה, סונן ורוכז באולטרה-צנטריפוגה. יש לאחסן את הנוזל העליון הנגיף המרוכז ב-80°C- עד להטרנסדוקציה.
PBMC מופרדים מתוצרי הפרדת לויקוציטים מתורמים בריאים (STEMCELL Technologies) על ידי צנטריפוגה בצפיפות גרדיאנט Ficoll. השתמשו במיקרו-חרוזי CD8 של סלקציה חיובית (Miltenyi) כדי לבודד תאי CD8+ מ-PBMC. גירוי תאי T עם TransAct (Miltenyi) ובמדיום TexMACS [Miltenyi; בתוספת 3% סרום אנושי מומת בחום, 1% PenStrep ו-IL-2 (300 U/ml)]. עשרים וארבע שעות לאחר הגירוי, תאי T עברו טרנסדוקציה עם lentivirus (10 מיקרוליטר סופרנטאנט וירוס מרוכז לכל 106 תאים). 1 עד 3 ימים לאחר הטרנסדוקציה על Cytek Aurora (על FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), העריכו את ביטוי ה-GFP של התאים כדי להדגים יעילות טרנסדוקציה של לפחות 30%.
תאי CAR-T גודלו במשך 24 שעות במדיום Immunocult (STEMCELL Technologies; בתוספת 1% PenStrep) בתנאים הבאים: ללא טיפול, טיפול ב-250 מיקרומולר אדנוזין או 10 mM MNA. לאחר טיפול מקדים, תאי CAR-T נשטפו עם PBS ושולבו עם 20,000 תאי SK-OV-3 [ATCC; במדיום McCoy 5A (Sigma-Aldrich) בתוספת 10% FBS ו-1% PenStrep ב-10: יחס האפקטור למטרה של 1 הוגבר בשלושה עותקים במדיום Immunocult בתוספת. תאי SK-OV-3 ותאי SK-OV-3 שעברו ליזיס עם דיגיטליס ספונין (0.5 מ"ג/מ"ל; Sigma-Aldrich) שימשו כביקורות שליליות וחיוביות, בהתאמה. לאחר 24 שעות של גידול משותף, נאסף הנוזל העלה-על ונמדד לקטט דהידרוגנאז (LDH) בהתאם להוראות היצרן (ערכת בדיקת ציטוטוקסיות LDH Glo, Promega). נוזל העל-תמציתי של LDH דולל ביחס של 1:50 בבופר LDH. אחוז ההרג נמדד באמצעות הנוסחה הבאה: אחוז ההרג = אחוז תיקון / שיעור הרג מקסימלי x 100%, כאשר אחוז התיקון = תרבית משותפת של תאי T בלבד, ושיעור הרג מקסימלי = בקרה חיובית-בקרה שלילית.
כפי שמתואר בטקסט או בחומרים ובשיטות, יש להשתמש ב-GraphPad Prism 8, Microsoft Excel או R v3.6.0 לניתוח סטטיסטי. אם נאספים מספר דגימות מאותו מטופל (כגון מיימת וגידול), נשתמש במבחן t זוגי או נכלול את המטופל כאפקט אקראי במודל ליניארי או כללי, לפי הצורך. לצורך ניתוח מטבולומיקה, מבחן החשיבות מבוצע בשלושה עותקים.
לחומרים משלימים למאמר זה, אנא עיינו בכתובת http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
זהו מאמר גישה פתוחה המופץ תחת תנאי רישיון Creative Commons Attribution-Non-Commercial, המאפשר שימוש, הפצה ורבייה בכל מדיום, כל עוד השימוש הסופי אינו למטרות רווח מסחרי וההנחה היא שהיצירה המקורית נכונה. הפניה.
הערה: אנו מבקשים שתספקו את כתובת הדוא"ל שלכם רק כדי שהאדם שאתם ממליצים עליו לדף ידע שאתם רוצים שהוא יראה את האימייל ושזה אינו ספאם. לא נאסוף כתובות דוא"ל.
שאלה זו משמשת לבדיקת האם אתה מבקר ולמניעת שליחת דואר זבל אוטומטי.
מריסה ק. קילגור (מריסה ק. קילגור), שרה מקפירסון (שרה מקפרסון), לורן ג'י זכריאס (לורן ג'י זכאריאס), אביגיל אלי אריס ג'י ווטסון (ה. ווטסון), ג'ון סטאג (ג'ון סטאג), בראד ה. נלסון (בראד ה. נלסון), ראלף ג'יי דה בלרדיני (ראלף ג'ונס ג'ונס), ראסל ג'ונס (ראסל ג'ונס) פיניאס טי המילטון (Phineas T.
MNA תורם לדיכוי החיסוני של תאי T ומהווה מטרה אימונותרפית פוטנציאלית לטיפול בסרטן בבני אדם.
מריסה ק. קילגור (מריסה ק. קילגור), שרה מקפירסון (שרה מקפרסון), לורן ג'י זכריאס (לורן ג'י זכאריאס), אביגיל אלי אריס ג'י ווטסון (ה. ווטסון), ג'ון סטאג (ג'ון סטאג), בראד ה. נלסון (בראד ה. נלסון), ראלף ג'יי דה בלרדיני (ראלף ג'ונס ג'ונס), ראסל ג'ונס (ראסל ג'ונס) פיניאס טי המילטון (Phineas T.
MNA תורם לדיכוי החיסוני של תאי T ומהווה מטרה אימונותרפית פוטנציאלית לטיפול בסרטן בבני אדם.
©2021 האגודה האמריקאית לקידום המדע. כֹּל הַזְכוּיוֹת שְׁמוּרוֹת. AAAS הוא שותף של HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ו-COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.