חומצה פרופיונית (PPA), חומר אנטי-פטרייתי ותוסף תזונתי נפוץ, הוכח כגורם להתפתחות עצבית לא תקינה בעכברים המלווה בתפקוד לקוי של מערכת העיכול, שעשוי להיגרם מדיסביוזה של המעי. הוצע קשר בין חשיפה ל-PPA תזונתי לבין דיסביוזה של המיקרוביוטה של המעי, אך לא נחקר ישירות. כאן, חקרנו שינויים בהרכב המיקרוביוטה של המעי הקשורים ל-PPA שעשויים להוביל לדיסביוזה. המיקרוביום של המעי של עכברים שניזונו מתזונה לא מטופלת (n=9) ומתזונה מועשרת ב-PPA (n=13) רוצף באמצעות ריצוף מטאגנומי ארוך טווח כדי להעריך הבדלים בהרכב המיקרוביאלי ובמסלולים מטבוליים של חיידקים. PPA תזונתי נקשר לעלייה בשפע של טקסונים משמעותיים, כולל מספר מינים של Bacteroides, Prevotella ו-Ruminococcus, שחברים שלהם היו קשורים בעבר לייצור PPA. למיקרוביום של עכברים שנחשפו ל-PPA היו גם מסלולים נוספים הקשורים למטבוליזם של שומנים ולביוסינתזה של הורמוני סטרואידים. תוצאותינו מצביעות על כך ש-PPA יכול לשנות את המיקרוביוטה של המעי ואת המסלולים המטבוליים הנלווים אליה. שינויים אלה שנצפו מדגישים כי חומרים משמרים המסווגים כבטוחים לצריכה יכולים להשפיע על הרכב המיקרוביוטה של המעיים, ובתורם, על בריאות האדם. מביניהם, P, G או S נבחרים בהתאם לרמת הסיווג המנותחת. כדי למזער את ההשפעה של סיווגים חיוביים שגויות, אומץ סף שפע יחסי מינימלי של 1e-4 (1/10,000 קריאות). לפני הניתוח הסטטיסטי, השפע היחסי שדווח על ידי Bracken (fraction_total_reads) עברו טרנספורמציה באמצעות טרנספורמציית יחס הלוגריתמים המרכזית (CLR) (Aitchison, 1982). שיטת CLR נבחרה לטרנספורמציית נתונים מכיוון שהיא בלתי משתנה בקנה מידה ומספקת עבור מערכי נתונים שאינם דלילים (Gloor et al., 2017). טרנספורמציית CLR משתמשת בלוגריתם הטבעי. נתוני הספירה שדווחו על ידי Bracken מנורמלים באמצעות ביטוי הלוגריתמים היחסי (RLE) (Anders and Huber, 2010). הנתונים נוצרו באמצעות שילוב של matplotlib גרסה 3.7.1, seaborn גרסה 3.7.2 ולוגריתמים עוקבים (Gloor et al., 2017). 0.12.2 ו-stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). יחס Bacillus/Bacteroidetes חושב עבור כל דגימה באמצעות ספירת חיידקים מנורמלת. הערכים המדווחים בטבלאות מעוגלים ל-4 ספרות אחרי הנקודה העשרונית. מדד הגיוון של סימפסון חושב באמצעות הסקריפט alpha_diversity.py המסופק בחבילת KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). דוח Bracken מסופק בסקריפט ומדד סימפסון "Si" מסופק עבור הפרמטר -an. הבדלים משמעותיים בשפע הוגדרו כהבדלי CLR ממוצעים ≥ 1 או ≤ -1. הפרש CLR ממוצע של ±1 מציין עלייה פי 2.7 בשפע של סוג דגימה. הסימן (+/-) מציין האם הטקסון שופע יותר בדגימת PPA ובדגימת הביקורת, בהתאמה. המובהקות נקבעה באמצעות מבחן Mann-Whitney U (Virtanen et al., 2020). נעשה שימוש ב-Statsmodels v. 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010), והליך Benjamini-Hochberg יושם לתיקון עבור בדיקות מרובות. ערך p מותאם ≤ 0.05 שימש כסף לקביעת מובהקות סטטיסטית.
המיקרוביום האנושי מכונה לעתים קרובות "האיבר האחרון בגוף" והוא ממלא תפקיד חיוני בבריאות האדם (Baquero and Nombela, 2012). בפרט, המיקרוביום של המעי מוכר בזכות השפעתו המערכתית ותפקידו בתפקודים חיוניים רבים. חיידקי קומנסל נמצאים בשפע במעיים, תופסים נישות אקולוגיות מרובות, מנצלים חומרים מזינים ומתחרים עם פתוגנים פוטנציאליים (Jandhyala et al., 2015). רכיבים חיידקיים מגוונים של המיקרוביוטה של המעי מסוגלים לייצר חומרים מזינים חיוניים כגון ויטמינים ולקדם עיכול (Rowland et al., 2018). מטבוליטים חיידקיים הוכחו גם כמשפיעים על התפתחות רקמות ומשפרים מסלולים מטבוליים וחיסוניים (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). הרכב המיקרוביום של המעי האנושי הוא מגוון ביותר ותלוי בגורמים גנטיים וסביבתיים כגון תזונה, מין, תרופות ומצב בריאותי (Kumbhare et al., 2019).
תזונת האם היא מרכיב קריטי בהתפתחות העובר והילודים ומקור משוער לתרכובות שעשויות להשפיע על ההתפתחות (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). תרכובת אחת מעניינת היא חומצה פרופיונית (PPA), תוצר לוואי של חומצת שומן קצרת שרשרת המתקבלת מתסיסה חיידקית ותוסף מזון (den Besten et al., 2013). ל-PPA תכונות אנטיבקטריאליות ואנטי-פטרייתיות ולכן הוא משמש כחומר משמר למזון וביישומים תעשייתיים לעיכוב צמיחת עובש וחיידקים (Wemmenhove et al., 2016). ל-PPA השפעות שונות ברקמות שונות. בכבד, ל-PPA השפעות אנטי דלקתיות על ידי השפעה על ביטוי ציטוקינים במקרופאגים (Kawasoe et al., 2022). השפעה מווסתת זו נצפתה גם בתאי חיסון אחרים, מה שמוביל לירידה בוויסות הדלקת (Haase et al., 2021). עם זאת, ההשפעה ההפוכה נצפתה במוח. מחקרים קודמים הראו שחשיפה ל-PPA גורמת להתנהגות דמוית אוטיזם בעכברים (El-Ansary et al., 2012). מחקרים אחרים הראו כי PPA יכול לגרום לגליוזה ולהפעיל מסלולים מעודדי דלקת במוח (Abdelli et al., 2019). מכיוון ש-PPA הוא חומצה חלשה, הוא יכול לפזר דרך אפיתל המעי לזרם הדם וכך לחצות מחסומים מגבילים, כולל מחסום הדם-מוח וכן את השליה (Stinson et al., 2019), דבר המדגיש את חשיבותו של PPA כמטבוליט רגולטורי המיוצר על ידי חיידקים. למרות שתפקידו הפוטנציאלי של PPA כגורם סיכון לאוטיזם נחקר כעת, השפעותיו על אנשים עם אוטיזם עשויות להרחיק מעבר לגרימת התמיינות עצבית.
תסמינים במערכת העיכול כגון שלשולים ועצירות שכיחים בקרב חולים עם הפרעות נוירו-התפתחותיות (Cao et al., 2021). מחקרים קודמים הראו כי המיקרוביום של חולים עם הפרעות בספקטרום האוטיסטי (ASD) שונה מזה של אנשים בריאים, דבר המצביע על נוכחות של דיסביוזה במיקרוביוטה של המעי (Finegold et al., 2010). באופן דומה, מאפייני המיקרוביום של חולים עם מחלות מעי דלקתיות, השמנת יתר, מחלת אלצהיימר וכו' שונים גם הם מאלה של אנשים בריאים (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). עם זאת, עד כה, לא נקבע קשר סיבתי בין המיקרוביום של המעי לבין מחלות או תסמינים נוירולוגיים (Yap et al., 2021), למרות שכמה מיני חיידקים נחשבים כבעלי תפקיד בחלק ממצבי מחלה אלה. לדוגמה, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio וסוגים אחרים נמצאים בשפע רב יותר במיקרוביוטה של חולים עם אוטיזם (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). ראוי לציין כי ידוע כי מינים החברים בחלק מהסוגים הללו מחזיקים בגנים הקשורים לייצור PPA (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). בהינתן התכונות האנטי-מיקרוביאליות של PPA, הגדלת שכיחותו עשויה להיות מועילה לגדילת חיידקים מייצרי PPA (Jacobson et al., 2018). לפיכך, סביבה עשירה ב-PFA עשויה להוביל לשינויים במיקרוביוטה של המעיים, כולל פתוגנים במערכת העיכול, אשר עשויים להיות גורמים פוטנציאליים המובילים לתסמינים במערכת העיכול.
שאלה מרכזית במחקר המיקרוביום היא האם הבדלים בהרכב המיקרוביאלים הם סיבה או סימפטום של מחלות בסיסיות. הצעד הראשון לקראת הבהרת הקשר המורכב בין תזונה, המיקרוביום של המעי ומחלות נוירולוגיות הוא להעריך את השפעות התזונה על הרכב המיקרוביאלים. לשם כך, השתמשנו בריצוף מטאגנומי ארוך טווח כדי להשוות את המיקרוביום של המעי של צאצאי עכברים שניזונו מתזונה עשירה או מדולדלת ב-PPA. הצאצאים ניזונו מאותה תזונה כמו אמהותיהם. שיערנו שתזונה עשירה ב-PPA תגרום לשינויים בהרכב המיקרוביאלים של המעי ובמסלולים התפקודיים המיקרוביאליים, במיוחד אלה הקשורים למטבוליזם של PPA ו/או ייצור PPA.
מחקר זה השתמש בעכברים טרנסגניים FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (מעבדות ג'קסון) אשר מבטאים ביתר חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטת פרומוטר GFAP ספציפי לגליה, בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מרכז פלורידה (UCF-IACUC) (מספר היתר שימוש בבעלי חיים: PROTO202000002). לאחר הגמילה, עכברים שוכנו בנפרד בכלובים עם 1-5 עכברים מכל מין בכלוב. עכברים ניזונו לפי רצונם בתזונה מטוהרת (תזונה סטנדרטית משופרת בתווית פתוחה, 16 קק"ל% שומן) או בתזונה בתוספת נתרן פרופיונאט (תזונה סטנדרטית משופרת בתווית פתוחה, 16 קק"ל% שומן, המכילה 5,000 ppm נתרן פרופיונאט). כמות הנתרן פרופיונאט ששימשה הייתה שווה ערך ל-5,000 מ"ג PFA/ק"ג משקל מזון כולל. זהו הריכוז הגבוה ביותר של PPA שאושר לשימוש כחומר משמר למזון. כהכנה למחקר זה, עכברי ההורים ניזונו משני סוגי התזונה במשך 4 שבועות לפני ההזדווגות והמשיכו לאורך כל הריון האמהות. עכברי הצאצאים [22 עכברים, 9 עכברי ביקורת (6 זכרים, 3 נקבות) ו-13 עכברי PPA (4 זכרים, 9 נקבות)] נגמלו ולאחר מכן המשיכו באותה תזונה כמו האמהות במשך 5 חודשים. עכברי הצאצאים הוקרבו בגיל 5 חודשים ותכולת צואת המעיים שלהם נאספה ואוחסנה בתחילה במבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -20°C ולאחר מכן הועברה למקפיא בטמפרטורה של -80°C עד שה-DNA המארח התרוקן וחומצות גרעין מיקרוביאליות חולצו.
DNA מארח הוסר בהתאם לפרוטוקול שונה (Charalampous et al., 2019). בקצרה, תוכן הצואה הועבר ל-500 מיקרוליטר InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) ואוחסן בהקפאה. עבדו מקסימום 1-2 כדורי צואה לכל חילוץ. לאחר מכן תוכן הצואה עבר הומוגניזציה מכנית באמצעות עלי פלסטיק בתוך המבחנה ליצירת תרחיף. צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 RCF למשך 5 דקות או עד שהדגימות התגבשו, לאחר מכן שאבו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הכדור ב-250 מיקרוליטר 1× PBS. הוסיפו 250 מיקרוליטר תמיסת ספונין 4.4% (TCI, מספר מוצר S0019) לדגימה כחומר ניקוי לריפוד קרומי תאים אאוקריוטיים. הדגימות עורבבו בעדינות עד לקבלת מרקם חלק והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, כדי לשבש את התאים האיקריוטיים, נוספו 350 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לדגימה, הודגרו במשך 30 שניות, ולאחר מכן נוספו 12 מיקרוליטר של 5 M NaCl. לאחר מכן הדגימות עברו צנטריפוגה ב-6000 RCF למשך 5 דקות. שאבו את הנוזל העל-תכליתי והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר 1X PBS. כדי להסיר את ה-DNA המארח, הוסיפו 100 מיקרוליטר בופר HL-SAN (12.8568 גרם NaCl, 4 מ"ל 1M MgCl2, 36 מ"ל מים נטולי נוקלאז) ו-10 מיקרוליטר אנזים HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). הדגימות עורבבו היטב באמצעות פיפטה והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות במהירות 800 סל"ד במכשיר Eppendorf™ ThermoMixer C. לאחר הדגירה, עברו צנטריפוגה ב-6000 RCF למשך 3 דקות ונשטפו פעמיים עם 800 מיקרוליטר ו-1000 מיקרוליטר PBS X1. לבסוף, השעינו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר PBS X1.
DNA חיידקי כולל בודד באמצעות ערכת טיהור ה-DNA הגנומי Monarch של New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). נוהל ההפעלה הסטנדרטי המצורף לערכה שונה במקצת. יש לדגור ולשמור על מים נטולי נוקלאז בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס לפני הפעולה לצורך שחרור סופי. יש להוסיף 10 מיקרוליטר Proteinase K ו-3 מיקרוליטר RNase A לכל דגימה. לאחר מכן, יש להוסיף 100 מיקרוליטר Cell Lysis Buffer ולערבב בעדינות. לאחר מכן, הדגימות הודגרו ב-Eppendorf™ ThermoMixer C בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס ו-1400 סל"ד למשך שעה לפחות ועד 3 שעות. הדגימות המודגרות עברו צנטריפוגה בקצב של 12,000 RCF למשך 3 דקות והנוזל העליון מכל דגימה הועבר למבחנה נפרדת של 1.5 מ"ל המכילה 400 מיקרוליטר של תמיסת קשירה. לאחר מכן, המבחנים עברו מערבולת בפולסים במשך 5-10 שניות במרווחים של שנייה אחת. העבירו את כל תכולת הנוזל של כל דגימה (כ-600-700 מיקרוליטר) למחסנית סינון שהונחה בצינור איסוף זרימה-דרך. המבחנים עברו צנטריפוגה ב-1,000 RCF למשך 3 דקות כדי לאפשר קישור ראשוני ל-DNA ולאחר מכן עברו צנטריפוגה ב-12,000 RCF למשך דקה אחת כדי להסיר נוזלים שיוריים. עמודת הדגימה הועברה למבחנת איסוף חדשה ולאחר מכן נשטפה פעמיים. בשטיפה הראשונה, הוסיפו 500 מיקרוליטר של בופר שטיפה לכל מבחנה. הפכו את המבחנה 3-5 פעמים ולאחר מכן בצנטריפוגה ב-12,000 RCF למשך דקה אחת. השליכו את הנוזל ממבחנת האיסוף והחזירו את מחסנית הסינון לאותה מבחנת איסוף. בשטיפה השנייה, הוסיפו 500 מיקרוליטר של בופר שטיפה למסנן מבלי להפוך. הדגימות עברו צנטריפוגה ב-12,000 RCF למשך דקה אחת. העבירו את המסנן למבחנת LoBind® בנפח 1.5 מ"ל והוסיפו 100 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז שחוממו מראש. המסננים הודגרו בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת ולאחר מכן עברו צנטריפוגה ב-12,000 RCF למשך דקה אחת. ה-DNA שעבר שחרור אוחסן ב-80°C-.
ריכוז ה-DNA נמדד כמותית באמצעות פלואורומטר Qubit™ 4.0. ה-DNA הוכן באמצעות ערכת Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (מס' קטלוגי Q33231) בהתאם להוראות היצרן. פיזור אורך מקטעי ה-DNA נמדד באמצעות Aglient™ 4150 או 4200 TapeStation. ה-DNA הוכן באמצעות ריאגנטים של Agilent™ Genomic DNA (מס' קטלוגי 5067-5366) ו-Genomic DNA ScreenTape (מס' קטלוגי 5067-5365). הכנת הספרייה בוצעה באמצעות ערכת הברקודים Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR (SQK-RPB004) בהתאם להוראות היצרן. ה-DNA רוצף באמצעות מרצפות ONT GridION™ Mk1 עם תא זרימה Min106D (R 9.4.1). הגדרות הריצוף היו: קריאת בסיס בדיוק גבוה, ערך q מינימלי של 9, הגדרת ברקוד וקיצור ברקוד. הדגימות ריצופו במשך 72 שעות, ולאחר מכן הוגשו נתוני קריאת הבסיס לעיבוד וניתוח נוספים.
עיבוד ביואינפורמטיקה בוצע באמצעות שיטות שתוארו קודם לכן (Greenman et al., 2024). קבצי ה-FASTQ שהתקבלו מהריצוף חולקו לתיקיות עבור כל דגימה. לפני ניתוח הביואינפורמטיקה, הנתונים עובדו באמצעות הצינור הבא: ראשית, קבצי ה-FASTQ של הדגימות אוחדו לקובץ FASTQ יחיד. לאחר מכן, קריאות קצרות מ-1000 bp סוננו באמצעות Filtlong גרסה 0.2.1, כאשר הפרמטר היחיד שהשתנה היה –min_length 1000 (Wick, 2024). לפני סינון נוסף, איכות הקריאה נשלטה באמצעות NanoPlot גרסה 1.41.3 עם הפרמטרים הבאים: –fastq –plots dot –N50 -o
לצורך סיווג טקסונומי, סווגו קריאות וקונטיגים מורכבים באמצעות Kraken2 גרסה 2.1.2 (Wood et al., 2019). צור דוחות וקבצי פלט עבור קריאות ואסמבלים, בהתאמה. השתמש באפשרות –use-names כדי לנתח קריאות ואסמבלים. האפשרויות –gzip-compressed ו-–paired מצוינות עבור מקטעי קריאה. השפע היחסי של טקסונים במטא-גנומים הוערך באמצעות Bracken גרסה 2.8 (Lu et al., 2017). תחילה יצרנו מסד נתונים של kmer המכיל 1000 בסיסים באמצעות bracken-build עם הפרמטרים הבאים: -d
ביאור גנים והערכת שפע יחסי בוצעו באמצעות גרסה שונה של הפרוטוקול שתואר על ידי Maranga et al. (Maranga et al., 2023). ראשית, קונטיגים קצרים מ-500 בסיסים הוסרו מכל המכלולים באמצעות SeqKit גרסה 2.5.1 (Shen et al., 2016). המכלולים שנבחרו שולבו לאחר מכן לפאן-מטגנום. מסגרות קריאה פתוחות (ORFs) זוהו באמצעות Prodigal גרסה 1.0.1 (גרסה מקבילה של Prodigal גרסה 2.6.3) עם הפרמטרים הבאים: -d
הגנים קובצו תחילה לפי מזהי אורתולוגיה (KO) של אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) שהוקצו על ידי eggNOG כדי להשוות את שפע מסלולי הגנים. גנים ללא נוקאאוטים או גנים עם נוקאאוטים מרובים הוסרו לפני הניתוח. לאחר מכן חושב השפע הממוצע של כל KO לדגימה ובוצע ניתוח סטטיסטי. גנים של מטבוליזם של PPA הוגדרו ככל גן שהוקצה לו שורה ko00640 בעמודה KEGG_Pathway, דבר המצביע על תפקיד במטבוליזם של פרופיונאט לפי KEGG. גנים שזוהו כקשורים לייצור PPA מפורטים בטבלה המשלימה 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). בוצעו מבחני תמורה כדי לזהות גנים של מטבוליזם וייצור PPA שהיו נפוצים משמעותית יותר בכל סוג דגימה. בוצעו אלף תמורה עבור כל גן שנותח. ערך p של 0.05 שימש כנקודת סף לקביעת מובהקות סטטיסטית. הערות פונקציונליות הוקצו לגנים בודדים בתוך אשכול בהתבסס על הערות של גנים מייצגים בתוך האשכול. ניתן היה לזהות טקסונים הקשורים למטבוליזם של PPA ו/או ייצור PPA על ידי התאמת מזהי contig בקבצי הפלט של Kraken2 עם אותם מזהי contig שנשמרו במהלך ביאור פונקציונלי באמצעות eggNOG. בדיקת מובהקות בוצעה באמצעות מבחן Mann-Whitney U שתואר קודם לכן. תיקון לבדיקות מרובות בוצע באמצעות הליך Benjamini-Hochberg. ערך p של ≤ 0.05 שימש כנקודת סף לקביעת מובהקות סטטיסטית.
הגיוון של המיקרוביום במעי של עכברים הוערך באמצעות מדד הגיוון של סימפסון. לא נצפו הבדלים משמעותיים בין דגימות הביקורת לדגימות ה-PPA מבחינת גיוון הסוג והמינים (ערך p עבור הסוג: 0.18, ערך p עבור המין: 0.16) (איור 1). לאחר מכן הושווה הרכב המיקרוביאלי באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA). איור 2 מציג את קיבוץ הדגימות לפי המערכות שלהן, דבר המצביע על כך שהיו הבדלים בהרכב המינים של המיקרוביום בין דגימות ה-PPA לדגימות הביקורת. קיבוץ זה היה פחות בולט ברמת הסוג, דבר המצביע על כך ש-PPA משפיע על חיידקים מסוימים (איור משלים 1).
איור 1. גיוון אלפא של סוגים והרכב מינים של מיקרוביום המעיים של עכבר. תרשימי קופסאות המציגים מדדי גיוון סימפסון של סוגים (A) ומינים (B) בדגימות PPA ובקרה. המובהקות נקבעה באמצעות מבחן מאן-ויטני U, ותיקון מרובה בוצע באמצעות הליך בנג'מיני-הוכברג. ns, ערך p לא היה מובהק (p>0.05).
איור 2. תוצאות ניתוח הרכיבים העיקריים של הרכב המיקרוביום במעיים של עכברים ברמת המין. גרף ניתוח הרכיבים העיקריים מציג את התפלגות הדגימות על פני שני הרכיבים העיקריים הראשונים שלהן. הצבעים מציינים את סוג הדגימה: עכברים שנחשפו ל-PPA הם סגולים ועכברי ביקורת הם צהובים. רכיבים עיקריים 1 ו-2 מוצגים על ציר ה-x וה-y, בהתאמה, ומבוטאים כיחס השונות המוסבר שלהם.
באמצעות נתוני ספירה שעברו טרנספורמציה של RLE, נצפתה ירידה משמעותית ביחס החציוני בין בקטרואידים לבעלי חיידקים (Bacteroidetes/Bacilli) בעכברי ביקורת ועכברי PPA (ביקורת: 9.66, PPA: 3.02; ערך p = 0.0011). הבדל זה נבע משכיחות גבוהה יותר של בקטרואידים בעכברי PPA בהשוואה לעכברי ביקורת, אם כי ההבדל לא היה מובהק (רמת CLR ממוצעת של ביקורת: 5.51, רמת CLR ממוצעת של PPA: 6.62; ערך p = 0.054), בעוד שכיחות הבקטרואידים הייתה דומה (רמת CLR ממוצעת של ביקורת: 7.76, רמת CLR ממוצעת של PPA: 7.60; ערך p = 0.18).
ניתוח שפע האיברים הטקסונומיים של המיקרוביום במעיים גילה כי מערכה אחת ו-77 מינים היו שונים באופן משמעותי בין דגימות PPA לדגימות בקרה (טבלה משלימה 2). שפעם של 59 מינים בדגימות PPA היה גבוה משמעותית מזה שבדגימות בקרה, בעוד ששפעם של 16 מינים בלבד בדגימות בקרה היה גבוה מזה שבדגימות PPA (איור 3).
איור 3. שפע דיפרנציאלי של טקסונים במיקרוביום המעי של עכברי PPA ועכברי ביקורת. תרשימי געש מציגים הבדלים בשפע הסוגים (A) או המינים (B) בין דגימות PPA לדגימות ביקורת. נקודות אפורות מצביעות על חוסר הבדל משמעותי בשפע הטקסונים. נקודות צבעוניות מצביעות על הבדלים משמעותיים בשפע (ערך p ≤ 0.05). 20 הטקסונים המובילים עם ההבדלים הגדולים ביותר בשפע בין סוגי הדגימות מוצגים באדום וכחול בהיר (דגימות ביקורת ו-PPA), בהתאמה. נקודות צהובות וסגולות היו שופעות פי 2.7 לפחות בדגימות ביקורת או PPA מאשר בדגימות ביקורת. נקודות שחורות מייצגות טקסונים עם שפע שונה משמעותית, עם הבדלי CLR ממוצעים בין -1 ל-1. ערכי P חושבו באמצעות מבחן Mann-Whitney U ותוקנו לבדיקות מרובות באמצעות הליך Benjamini-Hochberg. הבדלי CLR ממוצעים מודגשים מצביעים על הבדלים משמעותיים בשפע.
לאחר ניתוח הרכב המיקרוביאלים במעיים, ביצענו אנוטציה פונקציונלית של המיקרוביום. לאחר סינון גנים באיכות נמוכה, זוהו סך של 378,355 גנים ייחודיים בכל הדגימות. שפע הגנים הללו שעברו טרנספורמציה שימש לניתוח רכיבים עיקריים (PCA), והתוצאות הראו רמה גבוהה של קיבוץ סוגי דגימות בהתבסס על הפרופילים הפונקציונליים שלהם (איור 4).
איור 4. תוצאות PCA באמצעות הפרופיל התפקודי של מיקרוביום המעי של העכבר. גרף ה-PCA מציג את התפלגות הדגימות על פני שני המרכיבים העיקריים הראשונים שלהן. הצבעים מציינים את סוג הדגימה: עכברים שנחשפו ל-PPA הם סגולים ועכברי ביקורת הם צהובים. מרכיבים עיקריים 1 ו-2 מוצגים על ציר ה-x וציר ה-y, בהתאמה, ומבוטאים כיחס השונות המוסבר שלהם.
לאחר מכן בדקנו את שפע הנוקאאוטים של KEGG בסוגי דגימות שונים. סך של 3648 נוקאאוטים ייחודיים זוהו, מתוכם 196 היו נפוצים יותר באופן משמעותי בדגימות הבקרה ו-106 היו נפוצים יותר בדגימות PPA (איור 5). סך של 145 גנים זוהו בדגימות הבקרה ו-61 גנים בדגימות PPA, עם שפע שונה באופן משמעותי. מסלולים הקשורים למטבוליזם של שומנים ואמינוסוכרים היו מועשרים יותר באופן משמעותי בדגימות PPA (טבלה משלימה 3). מסלולים הקשורים למטבוליזם של חנקן ומערכות ממסר גופרית היו מועשרים יותר באופן משמעותי בדגימות הבקרה (טבלה משלימה 3). שפע הגנים הקשורים למטבוליזם של אמינוסוכרים/נוקלאוטידים (ko:K21279) ומטבוליזם של אינוזיטול פוספט (ko:K07291) היה גבוה משמעותית בדגימות PPA (איור 5). בדגימות הבקרה היו יותר גנים הקשורים באופן משמעותי למטבוליזם של בנזואטים (ko:K22270), מטבוליזם של חנקן (ko:K00368) וגליקוליזה/גלוקונאוגנזה (ko:K00131) (איור 5).
איור 5. שפע דיפרנציאלי של KOs במיקרוביום המעיים של עכברי PPA ועכברי ביקורת. גרף הר הגעש מתאר את ההבדלים בשפע הקבוצות הפונקציונליות (KOs). נקודות אפורות מצביעות על KOs ששפעם לא היה שונה באופן מובהק בין סוגי הדגימות (ערך p > 0.05). נקודות צבעוניות מצביעות על הבדלים משמעותיים בשפע (ערך p ≤ 0.05). 20 KOs עם ההבדלים הגדולים ביותר בשפע בין סוגי הדגימות מוצגים באדום וכחול בהיר, התואמים לדגימות ביקורת ו-PPA, בהתאמה. נקודות צהובות וסגולות מצביעות על KOs שהיו לפחות פי 2.7 יותר בדגימות ביקורת ו-PPA, בהתאמה. נקודות שחורות מצביעות על KOs עם שפע שונה באופן מובהק, עם הבדלי CLR ממוצעים בין -1 ל-1. ערכי P חושבו באמצעות מבחן Mann-Whitney U ותוקנו להשוואות מרובות באמצעות הליך Benjamini-Hochberg. NaN מציין ש-KO אינו שייך למסלול ב-KEGG. ערכי הבדל CLR ממוצעים מודגשים מצביעים על הבדלים משמעותיים בשפע. למידע מפורט על המסלולים שאליהם שייכים KOs המפורטים, ראה טבלה משלימה 3.
מבין הגנים המסומנים, ל-1601 גנים היה שפע שונה משמעותית בין סוגי הדגימות (p ≤ 0.05), כאשר כל גן היה שופע פי 2.7 לפחות. מבין גנים אלה, 4 גנים היו שופעים יותר בדגימות בקרה ו-1597 גנים היו שופעים יותר בדגימות PPA. מכיוון של-PPA יש תכונות אנטי-מיקרוביאליות, בדקנו את שפע הגנים של מטבוליזם וייצור PPA בין סוגי הדגימות. מבין 1332 הגנים הקשורים למטבוליזם של PPA, 27 גנים היו שופעים יותר משמעותית בדגימות בקרה ו-12 גנים היו שופעים יותר בדגימות PPA. מבין 223 הגנים הקשורים לייצור PPA, גן אחד היה שופע יותר משמעותית בדגימות PPA. איור 6A מדגים עוד את השפע הגבוה יותר של גנים המעורבים במטבוליזם של PPA, עם שפע גבוה משמעותית בדגימות בקרה וגדלי אפקט גדולים, בעוד שאיור 6B מדגיש גנים בודדים עם שפע גבוה משמעותית שנצפתה בדגימות PPA.
איור 6. שפע דיפרנציאלי של גנים הקשורים ל-PPA במיקרוביום המעיים של עכבר. תרשימי געש מתארים את ההבדלים בשפע הגנים הקשורים למטבוליזם של PPA (A) וייצור PPA (B). נקודות אפורות מציינות גנים ששפעם לא היה שונה באופן מובהק בין סוגי הדגימות (ערך p > 0.05). נקודות צבעוניות מציינות הבדלים משמעותיים בשפע (ערך p ≤ 0.05). 20 הגנים עם ההבדלים הגדולים ביותר בשפע מוצגים באדום ובכחול בהיר (דגימות בקרה ו-PPA), בהתאמה. שפע הנקודות הצהובות והסגולות היה גדול פי 2.7 לפחות בדגימות בקרה ו-PPA מאשר בדגימות בקרה. נקודות שחורות מייצגות גנים עם שפע שונה באופן מובהק, עם הבדלי CLR ממוצעים בין -1 ל-1. ערכי P חושבו באמצעות מבחן Mann-Whitney U ותוקנו להשוואות מרובות באמצעות הליך Benjamini-Hochberg. גנים תואמים לגנים מייצגים בקטלוג הגנים הלא-יתיר. שמות הגנים מורכבים מסמל KEGG המציין גן KO. הבדלי CLR ממוצעים מודגשים מציינים שפע שונה באופן מובהק. מקף (-) מציין שאין סמל לגן במסד הנתונים של KEGG.
טקסונים עם גנים הקשורים למטבוליזם ו/או ייצור של PPA זוהו על ידי התאמת הזהות הטקסונומית של הקונטיגים עם מזהה הקונטיג של הגן. ברמת הסוג, נמצאו 130 סוגים עם גנים הקשורים למטבוליזם של PPA ו-61 סוגים עם גנים הקשורים לייצור PPA (טבלה משלימה 4). עם זאת, אף סוג לא הראה הבדלים משמעותיים בשפע (p > 0.05).
ברמת המין, נמצאו 144 מיני חיידקים בעלי גנים הקשורים למטבוליזם של PPA ו-68 מיני חיידקים נמצאו בעלי גנים הקשורים לייצור PPA (טבלה משלימה 5). מבין מטבוליזם ה-PPA, שמונה חיידקים הראו עלייה משמעותית בשפע בין סוגי הדגימות, וכולם הראו שינויים משמעותיים בהשפעה (טבלה משלימה 6). כל מטבוליזם ה-PPA שזוהו עם הבדלים משמעותיים בשפע היו נפוצים יותר בדגימות PPA. סיווג ברמת המין גילה נציגים של סוגים שלא נבדלו באופן משמעותי בין סוגי הדגימות, כולל מספר מיני Bacteroides ו-Ruminococcus, כמו גם Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus ו-Alcaligenes polymorpha. מבין החיידקים מייצרי PPA, ארבעה חיידקים הראו הבדלים משמעותיים בשפע בין סוגי הדגימות. מינים עם הבדלים משמעותיים בשפע כללו את Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis ו-Ruminococcus bovis.
במחקר זה, בדקנו את השפעות החשיפה ל-PPA על המיקרוביוטה של המעיים של עכברים. PPA יכול לעורר תגובות שונות בחיידקים מכיוון שהוא מיוצר על ידי מינים מסוימים, משמש כמקור מזון על ידי מינים אחרים, או בעל השפעות אנטי-מיקרוביאליות. לכן, הוספתו לסביבת המעיים באמצעות תוספי תזונה עשויה להיות בעלת השפעות שונות בהתאם לסבילות, רגישות ויכולת להשתמש בו כמקור מזון. מיני חיידקים רגישים עשויים להיות מסולקים ומוחלפים באלו העמידים יותר ל-PPA או המסוגלים להשתמש בו כמקור מזון, מה שמוביל לשינויים בהרכב המיקרוביוטה של המעיים. תוצאותינו גילו הבדלים משמעותיים בהרכב המיקרוביאלי אך ללא השפעה על המגוון המיקרוביאלי הכולל. ההשפעות הגדולות ביותר נצפו ברמת המין, כאשר למעלה מ-70 טקסונים שונים באופן משמעותי בשפע בין דגימות PPA לדגימות בקרה (טבלה משלימה 2). הערכה נוספת של הרכב הדגימות שנחשפו ל-PPA גילתה הטרוגניות גדולה יותר של מיני מיקרוביאלים בהשוואה לדגימות שלא נחשפו, דבר המצביע על כך ש-PPA עשוי לשפר את מאפייני צמיחת החיידקים ולהגביל אוכלוסיות חיידקים שיכולות לשרוד בסביבות עשירות ב-PPA. לפיכך, PPA עשוי לגרום באופן סלקטיבי לשינויים במקום לגרום לשיבוש נרחב של מגוון המיקרוביוטה של המעיים.
חומרים משמרים למזון כמו PPA הוכחו בעבר כמשנים את שפע רכיבי המיקרוביום במעיים מבלי להשפיע על המגוון הכולל (Nagpal et al., 2021). כאן, צפינו בהבדלים הבולטים ביותר בין מיני Bacteroidetes בתוך מערכה Bacteroidetes (שנקראו בעבר Bacteroidetes), אשר הועשרו באופן משמעותי בעכברים שנחשפו ל-PPA. שפע מוגבר של מיני Bacteroides קשור לפירוק מוגבר של ריר, מה שעשוי להגביר את הסיכון לזיהום ולקדם דלקת (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). מחקר אחד מצא כי עכברים זכרים יילודים שטופלו ב-Bacteroides fragilis הפגינו התנהגויות חברתיות המזכירות הפרעת ספקטרום אוטיסטי (ASD) (Carmel et al., 2023), ומחקרים אחרים הראו כי מיני Bacteroides יכולים לשנות את פעילות החיסון ולהוביל לקרדיומיופתיה דלקתית אוטואימונית (Gil-Cruz et al., 2019). מינים השייכים לסוגים Ruminococcus, Prevotella ו-Parabacteroides נמצאו גם הם בעלייה משמעותית בעכברים שנחשפו ל-PPA (Coretti et al., 2018). מינים מסוימים של Ruminococcus קשורים למחלות כמו מחלת קרוהן באמצעות ייצור ציטוקינים מעודדי דלקת (Henke et al., 2019), בעוד שמיני Prevotella כמו Prevotella humani קשורים למחלות מטבוליות כמו יתר לחץ דם ורגישות לאינסולין (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). לבסוף, מצאנו כי היחס בין Bacteroidetes (שנקראו בעבר Firmicutes) לבקטערואידטים היה נמוך משמעותית בעכברים שנחשפו ל-PPA בהשוואה לעכברי ביקורת עקב שפע כולל גבוה יותר של מיני Bacteroidetes. יחס זה הוכח בעבר כאינדיקטור חשוב להומאוסטזיס של המעי, והפרעות ביחס זה נקשרו למצבי מחלה שונים (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), כולל מחלות מעי דלקתיות (Stojanov et al., 2020). יחד, מינים מהמערכה Bacteroidetes נראים כמושפעים ביותר מרמות גבוהות של PPA בתזונה. ייתכן שזה נובע מסבילות גבוהה יותר ל-PPA או מהיכולת להשתמש ב-PPA כמקור אנרגיה, דבר שהוכח כנכון עבור לפחות מין אחד, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). לחלופין, חשיפה אימהית ל-PPA עשויה לשפר את התפתחות העובר על ידי הפיכת מעי צאצאי העכברים רגישים יותר להתיישבות Bacteroidetes; עם זאת, תכנון המחקר שלנו לא אפשר הערכה כזו.
הערכת תוכן מטאגנומי גילתה הבדלים משמעותיים בשפע הגנים הקשורים למטבוליזם וייצור של PPA, כאשר עכברים שנחשפו ל-PPA הציגו שפע גבוה יותר של גנים האחראים לייצור PPA, בעוד שעכברים שלא נחשפו ל-PPA הציגו שפע גבוה יותר של גנים האחראים למטבוליזם של PAA (איור 6). תוצאות אלו מצביעות על כך שהשפעת PPA על הרכב המיקרוביאלים עשויה לא להיות נובעת אך ורק משימושו, אחרת שפע הגנים הקשורים למטבוליזם של PPA היה אמור להראות שפע גבוה יותר במיקרוביום המעיים של עכברים שנחשפו ל-PPA. הסבר אחד הוא ש-PPA מתווך שפע חיידקים בעיקר באמצעות השפעותיו האנטי-מיקרוביאליות ולא באמצעות שימושו על ידי חיידקים כחומר מזין. מחקרים קודמים הראו ש-PPA מעכב את צמיחת סלמונלה טיפימוריום באופן תלוי מינון (Jacobson et al., 2018). חשיפה לריכוזים גבוהים יותר של PPA עשויה לסלק חיידקים עמידים לתכונותיו האנטי-מיקרוביאליות ולא בהכרח להיות מסוגלים לעכל אותו או לייצר אותו. לדוגמה, מספר מיני Parabacteroides הראו שפע גבוה משמעותית בדגימות PPA, אך לא זוהו גנים הקשורים למטבוליזם או ייצור של PPA (טבלאות משלימות 2, 4 ו-5). יתר על כן, ייצור PPA כתוצר לוואי של תסיסה מופץ באופן נרחב בין חיידקים שונים (Gonzalez-Garcia et al., 2017). מגוון חיידקי גבוה יותר עשוי להיות הסיבה לשפע הגבוה יותר של גנים הקשורים למטבוליזם של PPA בדגימות בקרה (Averina et al., 2020). יתר על כן, רק 27 (2.14%) מתוך 1332 גנים ניבאו כגנים הקשורים באופן בלעדי למטבוליזם של PPA. גנים רבים הקשורים למטבוליזם של PPA מעורבים גם במסלולים מטבוליים אחרים. זה מדגים עוד יותר ששפע הגנים המעורבים במטבוליזם של PPA היה גבוה יותר בדגימות הבקרה; גנים אלה עשויים לתפקד במסלולים שאינם גורמים לניצול או היווצרות של PPA כתוצר לוואי. במקרה זה, רק גן אחד הקשור ליצירת PPA הראה הבדלים משמעותיים בשפע בין סוגי הדגימות. בניגוד לגנים הקשורים למטבוליזם של PPA, גנים סמנים לייצור PPA נבחרו מכיוון שהם מעורבים ישירות במסלול החיידקי לייצור PPA. בעכברים שנחשפו ל-PPA, נמצא כי לכל המינים שפע ויכולת ייצור PPA מוגברים משמעותית. ממצא זה תומך בתחזית ש-PPAs יבחרו ביצרני PPA ולכן צופים כי כושר ייצור ה-PPA יגדל. עם זאת, שפע גנים אינו בהכרח קשור לביטוי גנים; לכן, למרות ששפע הגנים הקשורים למטבוליזם של PPA גבוה יותר בדגימות בקרה, קצב הביטוי עשוי להיות שונה (Shi et al., 2014). כדי לאשר את הקשר בין שכיחות הגנים המייצרים PPA לבין ייצור PPA, יש צורך במחקרים על ביטוי גנים המעורבים בייצור PPA.
ביאור פונקציונלי של המטא-גנומים של PPA ובקרה גילה כמה הבדלים. ניתוח PCA של תוכן הגנים גילה אשכולות נפרדים בין דגימות PPA לדגימות בקרה (איור 5). קיבוץ בתוך הדגימה גילה שתכולת גן הבקרה הייתה מגוונת יותר, בעוד שדגימות PPA התקבצו יחד. קיבוץ לפי תוכן גנים היה דומה לקיבוץ לפי הרכב מינים. לפיכך, הבדלים בשפע המסלולים עולים בקנה אחד עם שינויים בשפע של מינים וזנים ספציפיים בתוכם. בדגימות PPA, שני מסלולים עם שפע גבוה משמעותית היו קשורים למטבוליזם של סוכר אמינו/נוקלאוטיד סוכר (ko:K21279) ולמסלולי מטבוליזם מרובים של שומנים (ko:K00647, ko:K03801; טבלה משלימה 3). ידוע שגנים הקשורים ל-ko:K21279 קשורים לסוג Bacteroides, אחד הסוגים עם מספר גבוה משמעותית של מינים בדגימות PPA. אנזים זה יכול להתחמק מהתגובה החיסונית על ידי ביטוי פוליסכרידים קפסולריים (Wang et al., 2008). זה עשוי להסביר את העלייה בבקטרואידים שנצפתה בעכברים שנחשפו ל-PPA. זה משלים את הסינתזה המוגברת של חומצות שומן שנצפתה במיקרוביום PPA. חיידקים משתמשים במסלול FASIIko:K00647 (fabB) כדי לייצר חומצות שומן, אשר עשויות להשפיע על מסלולי חילוף החומרים של הפונדקאי (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), ושינויים בחילוף החומרים של שומנים עשויים למלא תפקיד בהתפתחות העצבית (Yu et al., 2020). מסלול נוסף המציג שפע מוגבר בדגימות PPA היה ביוסינתזה של הורמוני סטרואידים (ko:K12343). ישנן עדויות הולכות וגדלות לכך שקיים קשר הפוך בין יכולתה של המיקרוביוטה של המעיים להשפיע על רמות ההורמונים לבין יכולתה להיות מושפעת מהורמונים, כך שרמות סטרואידים גבוהות עשויות להיות בעלות השלכות בריאותיות במורד הזרם (Tetel et al., 2018).
מחקר זה אינו נטול מגבלות ושיקולים. הבחנה חשובה היא שלא ביצענו הערכות פיזיולוגיות של בעלי החיים. לכן, לא ניתן להסיק ישירות האם שינויים במיקרוביום קשורים למחלה כלשהי. שיקול נוסף הוא שהעכברים במחקר זה ניזונו מאותה תזונה כמו אמהותיהם. מחקרים עתידיים עשויים לקבוע האם המעבר מתזונה עשירה ב-PPA לתזונה ללא PPA משפר את השפעותיה על המיקרוביום. מגבלה אחת של מחקרנו, כמו רבים אחרים, היא גודל המדגם המוגבל. למרות שניתן להסיק מסקנות תקפות, גודל מדגם גדול יותר יספק כוח סטטיסטי גדול יותר בעת ניתוח התוצאות. אנו נזהרים גם מהסקת מסקנות לגבי קשר בין שינויים במיקרוביום המעי לבין כל מחלה (Yap et al., 2021). גורמים מבלבלים, כולל גיל, מין ותזונה, יכולים להשפיע באופן משמעותי על הרכב המיקרואורגניזמים. גורמים אלה עשויים להסביר את חוסר העקביות שנצפה בספרות בנוגע לקשר של המיקרוביום המעי למחלות מורכבות (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). לדוגמה, נמצא כי מספר החברים בסוג Bacteroidetes מוגבר או מופחת בבעלי חיים ובני אדם עם ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). באופן דומה, מחקרים על הרכב המעיים בחולים עם מחלות מעי דלקתיות מצאו גם עליות וגם ירידות באותם טקסונים (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). כדי להגביל את ההשפעה של הטיה מגדרית, ניסינו להבטיח ייצוג שווה של המינים כך שההבדלים נובעים ככל הנראה מתזונה. אתגר אחד של ביאור פונקציונלי הוא הסרת רצפי גנים מיותרים. שיטת אשכול הגנים שלנו דורשת זהות רצף של 95% ודמיון אורך של 85%, כמו גם כיסוי יישור של 90% כדי למנוע אשכול שגוי. עם זאת, במקרים מסוימים, צפינו ברצפי גנים (COGs) עם אותם ביאורים (למשל, MUT) (איור 6). יש צורך במחקרים נוספים כדי לקבוע האם אורתולוגים אלה שונים, קשורים לסוגים ספציפיים, או שמא זוהי מגבלה של גישת קיבוץ הגנים. מגבלה נוספת של ביאור פונקציונלי היא סיווג שגוי אפשרי; הגן החיידקי mmdA הוא אנזים ידוע המעורב בסינתזת פרופיונט, אך KEGG אינו מקשר אותו למסלול המטבולי של פרופיונט. לעומת זאת, האורתולוגים scpB ו-mmcD קשורים. המספר הגדול של גנים ללא נוקאאוטים ייעודיים עלול לגרום לחוסר יכולת לזהות גנים הקשורים ל-PPA בעת הערכת שפע הגנים. מחקרים עתידיים ייהנו מניתוח מטא-טרנסקריפטומים, שיכול לספק הבנה מעמיקה יותר של המאפיינים התפקודיים של המיקרוביוטה של המעי ולקשר ביטוי גנים להשפעות פוטנציאליות במורד הזרם. עבור מחקרים הכוללים הפרעות נוירו-התפתחותיות ספציפיות או מחלות מעי דלקתיות, יש צורך בהערכות פיזיולוגיות והתנהגותיות של בעלי חיים כדי לקשר שינויים בהרכב המיקרוביום להפרעות אלו. מחקרים נוספים להשתלת המיקרוביום של המעי בעכברים נקיים מחיידקים יהיו שימושיים גם הם כדי לקבוע האם המיקרוביום הוא גורם מניע או מאפיין של מחלה.
לסיכום, הראינו כי PPA תזונתי פועל כגורם בשינוי הרכב המיקרוביוטה של המעי. PPA הוא חומר משמר שאושר על ידי ה-FDA ונמצא באופן נרחב במזונות שונים, אשר בחשיפה ארוכת טווח עלול להוביל לשיבוש פלורת המעי הרגילה. מצאנו שינויים בשפע של מספר חיידקים, דבר המצביע על כך ש-PPA יכול להשפיע על הרכב המיקרוביוטה של המעי. שינויים במיקרוביוטה יכולים להוביל לשינויים ברמות של מסלולים מטבוליים מסוימים, אשר יכולים להוביל לשינויים פיזיולוגיים הרלוונטיים לבריאות הפונדקאי. יש צורך במחקרים נוספים כדי לקבוע האם השפעות ה-PPA התזונתי על הרכב המיקרוביאלים יכולות להוביל לדיסביוזה או למחלות אחרות. מחקר זה מניח את היסודות למחקרים עתידיים על האופן שבו השפעות PPA על הרכב המעי עשויות להשפיע על בריאות האדם.
מערכי הנתונים המוצגים במחקר זה זמינים במאגרים מקוונים. שם המאגר ומספר הגישה הם: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
מחקר זה בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מרכז פלורידה (UCF-IACUC) (מספר היתר שימוש בבעלי חיים: PROTO202000002). מחקר זה עומד בחוקים, בתקנות ובדרישות המוסדיות המקומיות.
NG: קונספטואליזציה, אוצרות נתונים, ניתוח פורמלי, חקירה, מתודולוגיה, תוכנה, ויזואליזציה, כתיבה (טיוטה מקורית), כתיבה (סקירה ועריכה). LA: קונספטואליזציה, אוצרות נתונים, מתודולוגיה, משאבים, כתיבה (סקירה ועריכה). SH: ניתוח פורמלי, תוכנה, כתיבה (סקירה ועריכה). SA: חקירה, כתיבה (סקירה ועריכה). שופט ראשי: חקירה, כתיבה (סקירה ועריכה). SN: קונספטואליזציה, ניהול פרויקט, משאבים, פיקוח, כתיבה (סקירה ועריכה). TA: קונספטואליזציה, ניהול פרויקט, פיקוח, כתיבה (סקירה ועריכה).
המחברים הצהירו כי לא קיבלו כל תמיכה כספית למחקר, לכתיבה ו/או לפרסום מאמר זה.
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר כל קשר מסחרי או פיננסי שעלול להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי. לא רלוונטי.
כל הדעות המובעות במאמר זה הן אך ורק של המחברים ואינן משקפות בהכרח את עמדותיהם של המוסדות, המו"לים, העורכים או הסוקרים. כל מוצר המוערך במאמר זה, או כל טענה המועלית על ידי יצרניהם, אינו מובטח או מאושר על ידי המו"ל.
ניתן למצוא חומר משלים למאמר זה באינטרנט: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). חומצה פרופיונית גורמת לגליוזיס ודלקת עצבית על ידי ויסות מסלול PTEN/AKT בהפרעות על הספקטרום האוטיסטי. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
אייצ'יסון, ג'. (1982). ניתוח סטטיסטי של נתוני הרכב. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). יחס Firmicutes/Bacteroidetes כגורם סיכון לסרטן השד. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
אנדרס ש., הובר וו. (2010). ניתוח ביטוי דיפרנציאלי של נתוני ספירת רצפים. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
אנג'ליס, MD, פיקולו, M., וניני, L., סירגוסה, S., ג'אקומו, AD, סראזאנטי, DI, ואחרים (2013). מיקרוביוטה צואה ומטבולום בילדים עם אוטיזם והפרעה התפתחותית נרחבת שלא צוין אחרת. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). מאפיינים נוירומטבוליים חיידקיים של המיקרוביוטה במעי אצל ילדים צעירים עם הפרעות על הספקטרום האוטיסטי. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
בקרו פ., נומבלה ק. (2012). המיקרוביום כאיבר אנושי. מיקרוביולוגיה קלינית וזיהומים 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
באור ט., דיר פ. (2023). תובנות חדשות לגבי הפיזיולוגיה של חיידקים המייצרים חומצה פרופיונית: אנאארוטיגנום פרופיוניקום ואנאארוטיגנום ניאופרופיוניקום (לשעבר קלוסטרידיום פרופיוניקום וקלוסטרידיום ניאופרופיוניקום). מיקרואורגניזמים 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). תזונה אימהית והתפתחות העובר. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
בנימיני, י., והוכברג, י. (1995). שליטה בשיעור התוצאות החיוביות השגויות: גישה מעשית ויעילה לבדיקות מרובות. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
זמן פרסום: 18 באפריל 2025