תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
שלא כמו בעלי חוליות, חרקים נחשבים כחסרי הורמוני סטרואידים מיניים המוטים לזכרים. ב-Anopheles gambiae, נראה כי הסטרואיד אקדיסון 20-hydroxyecdysone (20E) התפתח כדי לשלוט בהתפתחות הביציות כאשר הן מסונתזות על ידי נקבות2 ולגרום לתקופת עמידות להזדווגות כאשר הן מועברות מינית על ידי זכרים3. מכיוון שהתפתחות ביציות והזדווגות הן תכונות רבייה חיוניות, הבנת האופן שבו יתושי האנופלס הנקביים משלבים אותות הורמונליים אלה עשויה להקל על תכנון תוכניות חדשות לבקרת מלריה. כאן, אנו מגלים שתפקודי רבייה אלה מווסתים על ידי סטרואידים מיניים שונים באמצעות רשת מורכבת של אנזימים המפעילים/מנטרל אקדיסטרואידים. זיהינו אקדיסון מחומצן ספציפי לזכר, 3-dehydro-20E (3D20E), המגן על ההורות על ידי כיבוי הקליטה המינית הנשית לאחר העברה מינית והפעלה על ידי דה-פוספורילציה. ראוי לציין כי העברה ב-3D20E גרמה גם לביטוי של גנים רבייתיים השומרים על התפתחות הביציות במהלך זיהום בפלזמודיום, מה שמבטיח את בריאותן של נקבות נגועות. 20E שמקורו בנקבה אינו מעורר תגובה מינית. אך מאפשר לפרטים שמתבגרים להטיל ביצים לאחר מעיכוב קינאזות מעכבות 20E. זיהוי הורמון סטרואידים ספציפי זה לחרקים ותפקידו בוויסות הקליטה המינית הנשית, הפוריות והאינטראקציה עם פלסמודיום מצביע על פוטנציאל להפחית את הצלחת הרבייה של יתושים מעבירי מלריה.
מקרי מלריה ותמותה נמצאים במגמת עלייה נוספת4 עקב עמידות נרחבת לקוטלי חרקים ביתושי אנופלס, הווקטור היחיד של טפילי מלריה אנושיים. ביולוגיית ההזדווגות של יתושים אלה היא מטרה אטרקטיבית במיוחד להתערבויות חדשות לבקרת מלריה מכיוון שנקבות מזדווגות רק פעם אחת5; הפיכת אירוע הזדווגות יחיד זה לעקר תהיה בעלת פוטנציאל גדול להפחית את אוכלוסיות היתושים בשטח.
נשים הופכות לנכות מינית לאחר קבלת הורמוני סטרואידים בטיטר גבוה מגברים. מחקרים הראו כי הגורם לקושי בהזדווגות נוספת הוא 20-הידרוקסי-אקדיסון (20E), הורמון סטרואידים הידוע יותר כווסת של מחזור ההנשרה בשלב הזחל. יכולתם של זכרים לסנתז ולהעביר 20E התפתחה במיוחד במיני אנופלס שהם חלק מתת-הסוג Cellia7, המופץ באפריקה וכולל את הווקטורים המסוכנים ביותר של מלריה, כולל אנופלס גמביה. זה ראוי לציון במיוחד מכיוון שבמינים אלה נקבות מייצרות גם 20E לאחר כל ארוחת דם, ו-20E מניע את מחזור האואוגנזה (ראה מקור 8). עם זאת, מעט ידוע על האופן שבו נקבות משלבות אותות משני מקורות שונים של אקדיסון (העברת זכר וגרימת הזנה מדם) מבלי לפגוע ביכולתן להזדווג. למעשה, אם ה-20E המיוצר על ידי הנקבות גורם לאי סבילות מינית, הדבר יוביל לאי פוריות אצל פרטים הניזונים מבתולות, התנהגות נפוצה מאוד ביתושים אלה5.
הסבר אפשרי הוא שזכרי A. gambiae מעבירים אקדיזון ספציפי לזכר שעבר שינוי, אשר מפעיל מפל איתות במערכת הרבייה הנקבית, וכתוצאה מכך חוסר יציבות בהזדווגות. עם זאת, למרות שלבעלי חוליות יש מספר הורמוני סטרואידים, כגון אסטרוגן ואנדרוגן (נסקר במקור 9), למיטב ידיעתנו, סטרואידים בעלי מוטה אנדרוגנית לא זוהו בחרקים.
יצאנו לקבוע את רפרטואר הורמוני הסטרואידים בבלוטה הזכרית העזרית (MAG) של A. gambiae בוגרת מינית בחיפוש אחר סטרואידים אפשריים בעלי יכולת שינוי. באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם ספקטרומטריית מסות טנדם (HPLC-MS/MS) במקום השיטה הפחות ספציפית ששימשה בעבר, זיהינו אקדיסון (E) ו-20E ברקמה זו, מה שמאשר את התוצאה הקודמת. עם זאת, הדגימה נשלטה על ידי סטרואידים מחומצנים שעברו זרחון, בהתאם לנוסחה 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (איור 1). צורות אחרות כוללות 3-dehydro-20E (3D20E) ו-20E-22-phosphate (20E22P). עוצמת האות HPLC-MS/MS של 3D20E22P הייתה גבוהה בשני סדרי גודל מצורתו הלא-זרחונית, 3D20E, וגבוהה בשלושה סדרי גודל מזו של E ו-20E (איור 1). למרות שבחלקים אחרים של הגוף וב... מערכת הרבייה התחתונה (LRT; נתונים מורחבים איור 1א). ניתחנו גם אקדיסטרואידים בזכרים ובנקבות שנסגרו לאחרונה (פחות מיום אחד) וזיהינו 3D20E ו-3D20E22P רק ב-MAG; E, 20E ו-20E22P היו נוכחים בשני המינים (נתונים מורחבים איור 1ב). נתונים אלה מצביעים על כך שזכרים בוגרים של A. gambiae מייצרים טיטרים גבוהים של הורמונים משנה ב-MAGs שלהם שאינם מסונתזים על ידי נקבות.
ניתוח MAG ו-LRT נקבה (כולל עלייה, שלפוחיות זרע ופרווריום) נותחו מזכרים בתולים בני 4 ימים ומנקבות בתולות ומזדווגות (0.5, 3 ו-12 נקודות לדקה). אקדיסון ברקמות אלו נותח באמצעות HPLC-MS/MS (ממוצע ± SEM; מבחן t לא מזווג, דו-צדדי, תוקן לשיעור גילוי שגוי (FDR); NS, לא מובהק; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 שעות לעומת 0.5 שעות, P = 0.035; 12 שעות לעומת 3 שעות, P = 0.0015; 12 שעות לעומת 0.5 שעות, P = 0.030. 3D20E22P: 3 שעות לעומת 0.5 שעות, P = 0.25; 12 שעות לעומת 3 שעות, P = 0.0032; 12 שעות לעומת 0.5 שעות, P = 0.015). הנתונים נלקחו משלושה חזרות ביולוגיות. שטח השיא עבור כל אקדיסון שמעניין חושב ונורמל לפי מספר היתושים. אקדיסון מיוצג בצבע כדלקמן: E, ירוק; 20E, כתום; 20E22P, סגול; 3D20E, כחול; 3D20E22P, ורוד. התמונה המוקטנת מגדילה את קנה המידה על ציר ה-y כדי להראות רמות נמוכות יותר של אקדיסון.
כדי לחקור האם 3D20E22P ו-3D20E מועברים במהלך ההזדווגות, ניתחנו את תאי ה-LRT של הנקבות בנקודות זמן שונות לאחר ההזדווגות. למרות שלא נמצא אקדיסון בבתולים, צפינו בכמויות משמעותיות של 3D20E22P ב-LRT מיד לאחר ההזדווגות (0.5 שעות לאחר ההזדווגות, hpm), ירידה עם הזמן, בעוד שרמות 3D20E עלו משמעותית (איור 1). באמצעות שימוש ב-3D20E שסונתז כימית כסטנדרט, קבענו שרמות הורמון סטרואידים זה ב-LRT של ההזדווגות היו גבוהות פי 100 לפחות מ-20E (טבלת נתונים מורחבת 1). לפיכך, 3D20E22P הוא האקדיסון הזכרי העיקרי המועבר ל-LRT הנקבי במהלך ההזדווגות, וצורתו הדה-פוספורילרית, 3D20E, הופכת לשופעת מאוד זמן קצר לאחר ההזדווגות. זה מצביע על תפקיד חשוב לאקדיסון האחרון בביולוגיה של הנקבות לאחר ההזדווגות.
לאחר יצירת מערך נתונים חדש של ריצוף RNA (RNA-seq) (איור 2א'), באמצעות צינור ביואינפורמטיקה שנבנה בהתאמה אישית, חיפשנו אחר אקדיסון קינאז (EcK), אקדיסון אוקסידאז (EO) ואקדיסון המקודדים את הגן פוספטאז 20E-modified. EPP) מתבטא ברקמות רבייה. זיהינו גן EPP מועמד אחד ושני גנים פוטנציאליים של EcK (EcK1 ו- EcK2), אך לא הצלחנו למצוא גן EO מועמד טוב. ראוי לציין שגנים בודדים של EPP באו לידי ביטוי ברמות גבוהות (אחוזון 98.9) ב-MAGs גמביים אך לא ב-LRTs נקביים (איור 2ב'), בניגוד לציפיות שלנו מכיוון שדה-זרחון של 3D20E22P התרחש ברקמה נקבה זו. לכן, אנו מאמינים ש-EPP זכר עשוי להיות מועבר במהלך ההזדווגות. ואכן, השתמשנו בסימון איזוטופי יציב in vivo כדי להסוות את החלבון הנקבי לאחר ההזדווגות, אנזים שזוהה על ידי MS באטריום הנקבי (איור 2ג' וטבלה משלימה 1). נוכחות של EPP ב-MAG וב-LRT נקבי מזווג (אך לא בתולי) אושר גם הוא באמצעות נוגדנים ספציפיים (איור 2ד).
א. צינור ביואינפורמטיקה בהתאמה אישית לחיפוש ברקמות הרבייה של כל מין אחר גנים המקודדים EcKs, EOs ו-EPPs. המספרים שליד החצים מציינים את מספר המועמדים הזכרים והנקבות בכל שלב. ניתוח זה זיהה גן EPP אחד (EPP) וגן EcK אחד (EcK1) המתבטאים בזכרים, וגן EcK אחד (EcK2) המתבטא בשני המינים אך אינו מניב גן EO מועמד. ב. מפת חום המשווה ביטוי גנים מועמדים ברקמות בתולות (V) ומזדווגות (M) של אנופלס גמביה ואנופלס אלביקנס. Spca, הפריה; MAGs, בלוטות נלוות בזכרים; חלקים אחרים בגוף, כולל שדיים, כנפיים, רגליים, גופי שומן ואיברים פנימיים בשני המינים, ושחלות אצל נקבות. EcK2 מתבטא מאוד הן ב-MAG והן בפרוזדורים של גמביה, בעוד ש-EPP נמצא רק ב-MAG.c, ניתוח פרוטאומי של טרנסלוקציה של קבוצת שפיכה זכרית לפרוזדורים נקביים ב-3, 12 ו-24 דקות לדקה, מראה את 67 החלבונים הנפוצים ביותר. נקבות גודלו על דיאטה המכילה 15N כדי לתייג (ולהסוות) את כל החלבונים. זכרים לא מתויגים הזדווגו עם נקבות מתויגות, ו-LRTs נקביים נותחו ב-3, 12 ו-24 דקות לדקה לצורך ניתוח פרוטאומי (ראה טבלה משלימה 1 לרשימה מלאה של חלבוני שפיכה). בתמונה הקטנה, EPP, Eck1 ו-EcK2 זוהו ב-MAG של זכרים בתולים על ידי ניתוח פרוטאומי של רקמות אלו.d, EPP זוהה על ידי כתם מערבי ב-MAG ו-LRT של נקבות מזווגות, אך לא בנקבות או זכרים בתולים או בשאר גוף הנקבה. ממברנות בו זמנית... נבדק באמצעות נוגדנים אנטי-אקטין (בקרת טעינה) ואנטי-EPP. כל הזכרים בתולים. ראה איור משלים 1 לנתוני מקור ג'ל. בדיקות Western blot בוצעו פעמיים עם תוצאות דומות.
פעילות הפוספטאז האקדיסטרואידי של EPP אומתה לאחר דגירה באמצעות HPLC-MS/MS עם 3D20E22P שבודד מ-MAG (איור 2a, נתונים מורחבים). יתר על כן, כאשר השתקנו את EPP באמצעות הפרעה בתיווך RNA (RNAi), זיהינו ירידה חזקה בפעילות הפוספטאז ברקמות הרבייה של זכרים אלה (איור 3a), ונקבות שהזדווגו עם זכרים מושתקים על ידי EPP הראו שיעור נמוך משמעותית של 3D20E שעבר דה-פוספורילציה (איור 3b) למרות השתקה חלקית של גנים (איור 2b,c, נתונים מורחבים). לעומת זאת, לא זיהינו שינויים משמעותיים ביחס 20E22P/20E באותם יתושים, דבר שעשוי לרמוז שהאנזים ספציפי ל-3D20E22P (איור 3b).
א, פעילות פוספטאז מופחתת ב-MAG נגרמת על ידי השתקת EPP באמצעות בקרות EPP RNA דו-גדילי (dsEPP) או GFP RNA דו-גדילי (dsGFP). עשרים מאגרי MAG שימשו בכל חזרת (P = 0.0046, מבחן t מזווג, דו-צדדי), המיוצגים על ידי נקודות נפרדות. ב, נקבות שהזדווגו עם זכרים מושתקי EPP היו בעלים שיעור נמוך משמעותית של 3D20E ללא זרחן ב-3 hpm (P = 0.0043, מבחן t לא מזווג, דו-צדדי), בעוד שרמות 20E לא הושפעו (P = 0.063, לא מזווג). מבחן t, דו-צדדי). הנתונים מוצגים כממוצע ± סידורי ממוצע משלושה מאגרי קבוצות של 13, 16 ו-19 נקבות כל אחת.c, נקבות שהזדווגו עם זכרים שהושתקו על ידי EPP הראו שיעורי הזדווגות חוזרת גבוהים משמעותית (P = 0.0002, מבחן פישר המדויק, דו-צדדי). נקבות אולצו תחילה להזדווג כדי להבטיח את מצב ההזדווגות שלהן; יומיים לאחר מכן, הם נוצרו בקשר עם זכרים אחרים הנושאים זרע טרנסגני כדי להעריך את שיעורי ההזדווגות החוזרת באמצעות זיהוי PCR כמותי של הגן הטרנסגני.d, נקבות שניזונו מדם שהזדווגו עם זכרים מושתקים ב-EPP הדגימו פוריות מופחתת משמעותית (P < 0.0001; מבחן מאן-ויטני, דו-צדדי) ומספר ביצים מופחת מעט (P = 0.088, מבחן מאן-ויטני, דו-צדדי), בעוד ששיעור ההטלה לא הושפע (P = 0.94, מבחן פישר המדויק, דו-צדדי). בכל הפאנלים, n מייצג את מספר דגימות היתושים הבלתי תלויות מבחינה ביולוגית.NS, לא מובהק.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
לאחר מכן, הערכנו האם דה-פוספורילציה של אקדיזון חשובה לגרימת עמידות להזדווגות אצל נקבות. ראוי לציין כי נקבות שהזדווגו עם זכרים מדולדלים ב-EPP הזדווגו מחדש בתדירות גבוהה בהרבה (44.9%) בהשוואה לנקבות ביקורת (10.4%) כאשר נחשפו לזכרים (טרנסגניים) נוספים (איור 3ג). כמו כן, צפינו בירידה משמעותית בפוריות (איור 3ד, משמאל) ובירידה קלה במספר הביצים שהוטלו על ידי נקבות אלו (איור 3ד, אמצע), בעוד שאחוז הביצים שהוטלו על ידי נקבות (תגובה נוספת שנגרמה אצל נקבות במהלך ההזדווגות) לא הושפע (איור 3ד, מימין). בהינתן הספציפיות שנצפתה של EPP עבור 3D20E22P, תוצאות אלו מצביעות על כך שהפעלת 3D20E על ידי EPP המועבר במהלך ההזדווגות עשויה להיות בעלת תפקיד חשוב בכיבוי הפתיחות הנקבית להזדווגות נוספת, התנהגות שיוחסה בעבר להעברה מינית של 20E. לכן, הורמון ספציפי זה לזכר משפיע מאוד גם על פוריות הנקבית.
לאחר מכן, השווינו את הפעילות של 20E ו-3D20E בניסויי הזרקה בבתולים בוגרים מינית באמצעות 3D20E מסונתז כימית (איור 4א'-ג') ו-20E הזמין מסחרית. צפינו ש-3D20E היה יעיל משמעותית יותר מ-20E בכיבוי רגישות הנקבות להזדווגות בשני הריכוזים (איור 4ד'). ראוי לציין כי מחצית מהרמה הפיזיולוגית של 3D20E בבדיקת LRT (1,066 פיקוגרם לאחר הזרקה לעומת 2,022 פיקוגרם לאחר הזדווגות) גרמה לשיעור של נקבות עמידות בפני הזדווגות שהיה גבוה פי 20 מהרמה הפיזיולוגית של 20E (361 פיקוגרם לאחר הזרקה) 24 שעות לאחר ההזרקה בריכוז הגבוה ביותר של 18 פיקוגרם לאחר הזדווגות; טבלת נתונים מורחבת 1). תוצאה זו עולה בקנה אחד עם הרעיון שהעברה מינית של 20E אינה גורמת לתקופות עמידות להזדווגות, ומצביעה עוד יותר על 3D20E כגורם עיקרי בהבטחת קשר הורה-ילד. 3D20E היה גם פעיל משמעותית יותר מ-20E במבחני הטלת ביצים בנקבות בתולות (איור 4e), דבר המצביע על כך שקצב הטלת הביצים הרגיל שראינו לאחר השתקה חלקית של EPP נובע מנוכחות פעילות שיורית של 3D20E שעדיין נוצרה על ידי גורמים נקביים המושרים על ידי הזדווגות.
(א,ב) 3D20E שסונתז כימית מ-20E (א) עם המרה/יעילות גבוהות מאוד (הנתונים מוצגים כממוצע ± ס"מ משלוש תגובות סינתזה בלתי תלויות) (ב).ג, ספקטרום המסה (החצי התחתון) תואם במדויק את האקדיסון שנמצא ב-LRT נקבה מזווגת (החצי העליון).ד, בהשוואה ל-20E (0.63 מיקרוגרם, P = 0.02; 0.21 מיקרוגרם, P < 0.0001; מבחן פישר המדויק, דו-צדדי) ו-10% אתנול (0.63 מיקרוגרם, P < 0.0001; 0.21 מיקרוגרם, P < 0.0001; מבחן פישר המדויק, דו-צדדי), בעוד ש-20E היה גבוה משמעותית מקבוצת הביקורת רק במינונים גבוהים יותר (0.63 מיקרוגרם, P = 0.0002; 0.21 מיקרוגרם, P = 0.54; מבחן פישר המדויק, דו-צדדי).ה, 3D20E הזרקה גרמה לשיעורי הטלה גבוהים משמעותית בנקבות בתולות בהשוואה לקבוצת ביקורת שקיבלו 10% אתנול (0.21 מיקרוגרם, P < 0.0001; 0.13 מיקרוגרם, P = 0.0003; מבחן פישר המדויק, דו-צדדי), בעוד ש-20E הושווה לקבוצת הביקורת רק במינונים גבוהים יותר (0.21 מיקרוגרם, P = 0.022; 0.13 מיקרוגרם, P = 0.0823; מבחן פישר המדויק, דו-צדדי). 3D20E גרמה לשיעורי הטלה גבוהים משמעותית בהשוואה ל-20E במינונים גבוהים יותר (0.21 מיקרוגרם, P = 0.0019; 0.13 מיקרוגרם, P = 0.075; מבחן פישר המדויק, דו-צדדי). בכל הפאנלים, n מייצג את מספר דגימות היתושים הבלתי תלויות ביולוגית. NS, לא מובהק. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. הנתונים הם מ שלושה חזרות.
במחקרים קודמים, קבענו כי העברה מינית של הורמוני סטרואידים גורמת לביטוי של MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), גן רבייה נקבי המגן על נקבות של A. gambiae מפני זיהום ב-P. falciparum. עלויות בריאותיות הנגרמות על ידי 13, טפיל המלריה האנושי הקטלני ביותר. בהתחשב בחשיבותו של MISO לכושר הרבייה של אנופלס באזורים אנדמיים למלריה, החלטנו לקבוע איזה הורמון 3D20E או 20E מפעיל את הביטוי של גן זה. מצאנו שבעוד שהזרקת 20E גרמה באופן ספציפי או חזק יותר לכמה קולטני הורמונים גרעיניים (HR), כגון HR3 ו-HR4, ומטרות סטרואידים אופייניות במורד הזרם, כגון הגנים היולקוגניים Vg14, 15, 16, MISO הושרה בצורה חזקה יותר על ידי 3D20E (איור נתונים מורחבים 3). לפיכך, ההעברה המינית של הורמון סטרואידים אנדרוגני זה נראית כגורמת למנגנונים המגנים על נקבות מהעלויות הכרוכות בזיהום טפילי. יתר על כן, 3D20E משפיע באופן דיפרנציאלי על שני האיזופורמים של ה- קולטן E EcR, מה שמעורר EcR-A ומדכא את EcR-B, ומפעיל בצורה חזקה יותר גנים אחרים המעוררים הזדווגות, כולל HPX15, המשפיע על פוריות הנקבה. דבר זה יכול להסביר את חוסר הפוריות המשמעותי שנצפתה אצל נקבות שהזדווגו עם זכרים מושתקי EPP (איור 3 של נתונים מורחבים). נתונים אלה מצביעים על קיומם של מסלולים במורד הזרם המופעלים באופן מועדף על ידי שני הורמוני אקדיזון שעשויים להיות בבסיס תפקוד ספציפי למין.
לאחר מכן, בדקנו את תפקודם של שני גני EcK שזוהו בצנרת הביואינפורמטיקה שלנו. השתקת EcK1 או EcK2 הביאה לתמותה משמעותית אצל גברים (איור 4a, נתונים מורחבים), דבר המצביע על כך שזרחון של אקדיסון, ולכן אי-אקטיבציה, חשובה להישרדות. מכיוון ש-EcK2 בא לידי ביטוי ברמות גבוהות יותר מ-EcK1 וזוהה ב-MAGs על ידי פרוטאומיקה (איור 2b,c וטבלה משלימה 2), אימתנו את פעילותו של אקדיסטרואיד קינאז על ידי דגירה שלו עם 20E, מה שהביא לזרחון 20E22P (איור 2, נתונים מורחבים).4b). בעת שימוש ב-3D20E כמצע, לא הצלחנו לזהות את התוצר הזרחני 3D20E22P (איור 4c, נתונים מורחבים), דבר המצביע על כך ש-20E ולא 3D20E עשוי להיות המטרה המועדפת של EcK2.
על פי ניתוח ה-RNA-seq שלנו, EcK2 התבטא מאוד גם ב-LRT של נקבות בתולות, שם הוא כובה לאחר ההזדווגות (איור 2ב). אישרנו נתונים אלה וקבענו כי ביטוי EcK2 לא הושפע מהזנה בדם (נתונים מורחבים איור 5א). בהרחבת ניסויי ה-MS הראשוניים שלנו, קבענו כי שיא 20E22P היה קשור קשר הדוק לשיא 20E (22-26 שעות לאחר ארוחת דם; נתונים מורחבים איור 5ב). השתקת EcK2 בנקבות בתולות הביאה לעלייה פי 3 ביחס היחסי בין 20E ל-20E22P 26 שעות לאחר ארוחת הדם (נתונים מורחבים איורים 2ג ו-5ג), מה שמאשר ש-EcK2 גם מבצע זרחון של 20E בנקבות. ראוי לציין כי בתולות מדוללות EcK2 שמרו על פתיחות מינית מלאה (נתונים מורחבים איור 5ד,ה), דבר המצביע עוד על כך שייצור 20E אצל הנקבות אינו גורם לתקופות עמידות להזדווגות. עם זאת, לנקבות אלו הייתה השפעה משמעותית על... שיעורי הטלת ביצים מוגברים בהשוואה לקבוצת הביקורת, כאשר יותר מ-30% מהבתולות מטילות ביצים (איור 5f, נתונים מורחבים). אם בוצעו זריקות של RNA דו-גדילי Eck2 (dsEcK2) לאחר אכילה בדם, ההשרצה לא התרחשה, ובנקודה זו שיא ה-20E עקב בליעת דם ירד. בסך הכל, תוצאות אלו תומכות במודל לפיו 20E המיוצר לאחר מציצת דם יכול לגרום להשרצה, אך רק כאשר חסימת ההשרצה (EcK2 ואולי גורמים אחרים) כבויה על ידי הזדווגות. לא זריקות 20E ולא זריקות 3D20E עיכבו את ביטוי EcK2 בבתולות (איור 5g, נתונים מורחבים), דבר המצביע על כך שגורמים אחרים מתווכים את עיכוב הקינאז הזה. עם זאת, רמות 20E לאחר אכילה בדם לא היו מספיקות כדי לגרום לאי נוחות בהזדווגות, אלא הופעלו ביעילות על ידי טיטרים גבוהים של 3D20E המועבר מינית.
תוצאותינו מספקות תובנות חשובות לגבי המנגנונים המווסתים את הצלחת הרבייה של A. gambiae. התפתח מודל שבו זכרים התפתחו לסינתזה של רמות גבוהות של 3D20E, אקדיסון שעבר שינוי ספציפי לזכר, המבטיח הורות על ידי הפחתת רגישות הנקבות להזדווגות נוספת. במקביל, וקטורי מלריה אלה פיתחו גם מערכת יעילה להפעלת 3D20E בנקבות בתגובה להעברה מינית של EPP ספציפי לזכר. למיטב ידיעתנו, זוהי הדוגמה הראשונה למערכת הורמונים סטרואידים הנשלטת על ידי זכרים ונקבות, המבצעת פונקציה ייחודית וקריטית בחרקים. תפקוד אקדיסון ספציפי לזכר הוצע אך לא הודגם באופן סופי. לדוגמה, השערה שהופרכה במידה רבה היא שתפקודים אלה עשויים להתבצע על ידי קודמן 20E E1. ידוע היטב שבדרוזופילה, מוננדריה מופעלת על ידי העברה מינית של פפטידים קטנים במין המקיימים אינטראקציה עם נוירונים המעצבבים את מערכת הרבייה הנשית דרך קולטני פפטידים ספציפיים במין. נדרשת עבודה נוספת כדי לקבוע את האיתות במורד הזרם. קסדות הנשלטות על ידי 3D20E בנקבות A. gambiae ולקבוע האם ניתן לשמר קסדות אלו בין יתושים לדרוזופילה.
בהינתן התפקיד החשוב של 3D20E על פוריות והתנהגות נשית שזוהו במחקר שלנו, המסלולים המובילים לסינתזה והפעלת 3D20E מציעים הזדמנויות חדשות לאסטרטגיות הדברה עתידיות, כגון יצירת זכרים עקרים תחרותיים באסטרטגיות טכנולוגיות חרקים עקרים לשימוש לשחרור בטבע או לחיקוי ה-3D20E במשחק בתולי. ייתכן שהתפקוד הספציפי לזכר של 3D20E התפתח כאשר A. gambiae ומינים אחרים של Cellia רכשו את היכולת לקריש את הזרע שלהם לפקקי הזדווגות, שכן זה מאפשר העברה יעילה של מספר רב של הורמונים ואנזימים מפעילי הורמונים. בתורו, התפתחות 3D20E המיישמת מוננדריה מספקת מנגנון לנקבות (באמצעות ביטוי גבוה של MISO) לטובת כושר הרבייה שלהן באזורים עם שכיחות גבוהה של מלריה, מה שתורם בעקיפין להעברת פלסמודיום. בהינתן שהוכח של-20E נקבי יש השפעות עמוקות על הישרדותו וגדילתו של P. falciparum ביתושי אנופלס נקביים,24 מסלולי הורמוני סטרואידים זכריים ונקביים כאחד הם כיום היבטים מרכזיים של אינטראקציות בין יתושים לטפילים.
זני A. gambiae G3 גודלו בתנאי חרקים סטנדרטיים (26-28 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 65-80%, תקופת אור/חושך של 12:12 שעות). הזחלים ניזונו מאבקת מזון לדגים (פתיתי טרופיים TetraMin, כדורי קוי ומקלות טטרה בריכת ביחס של 7:7:2). יתושים בוגרים ניזונו כרצונם בתמיסת דקסטרוז 10% ודם אנושי שבועי (מרכיבי דם המחקר). יתושים בתולים הושגו על ידי הפרדת המינים בשלב הגולם לאחר בדיקת הקצוות במיקרוסקופ. זכרים הנושאים את הטרנסגן DsRed תוארו בעבר.
ניסויי הזדווגות כפויה בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שתוארו קודם לכן. עבור הזדווגות טבעית, נקבות בתולות בנות 4 ימים הוחזקו ביחס של 1:3 עם זכרים בתולים בוגרים מינית במשך שני לילות. עבור ניסויים בהם זכרים הוזרקו ל-dsEPP, הכליאה המשותפת בכלוב התרחשה במקביל לימים 3-4 לאחר ההזרקה, כאשר פעילות הפוספטאז הושתקה באופן מקסימלי (איור 2b של נתונים מורחבים).
רקמות יתושים, גופות שנותרו (שאר הגוף), או כל הגוף נותחו לתוך 100% מתנול ועברו הומוגניזציה בעזרת מכונת חרוזים (2 מ"מ חרוזי זכוכית, 2,400 סל"ד, 90 שניות). כמויות הרקמה ונפחי המתנול היו כדלקמן: שאר הגוף, 50 ב-1,000 מיקרוליטר; MAG, 50-100 80 מיקרוליטר; LRT נקבה, 25-50 80 מיקרוליטר. המשקע עבר מיצוי מתנול שני עם אותו נפח של מתנול. שאריות תאים הוסרו באמצעות צנטריפוגה. המתנול משני המיצויים אוחד ויובש תחת זרימת חנקן, ולאחר מכן הושעה מחדש בנפחים הבאים של 80% מתנול במים: שאר הגוף, 50 מיקרוליטר; MAGs ו-LRT נקבה, 30 מיקרוליטר.
הדגימות נותחו בספקטרומטר מסות (ID-X, Thermo Fisher) המחובר למכשיר LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 מיקרוליטר של דגימה הוזרקו לעמודה בגודל 3 מיקרומטר, 100 × 4.6 מ"מ (Inspire C8, Dikma) שנשמרה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. הפאזות הניידות עבור ה-LC היו A (מים, 0.1% חומצה פורמית) ו-B (אצטוניטריל, 0.1% חומצה פורמית). גרדיאנט ה-LC היה כדלקמן: 5% B למשך דקה אחת, ולאחר מכן הוגדל ל-100% B במשך 11 דקות. לאחר 8 דקות ב-100%, איזנו מחדש את העמודה ב-5% B למשך 4 דקות. קצב הזרימה היה 0.3 מ"ל לדקה-1. יינון במקור MS מתבצע על ידי יינון אלקטרוספרייס מחומם במצבים חיוביים ושליליים.
ספקטרומטר המסה מודד נתונים בטווח m/z מ-350 עד 680 ברזולוציה של 60,000 במצב MS מלא. נתוני MS/MS נאספו על [M + H]+ (כל המטרות), [M - H2O + H]+ (כל המטרות), ו-[M - H]- (מטרות זרחניות). נתוני MS/MS שימשו לאישור תכונות האקדיסון של מטרות שלא היה עבורן תקן זמין. כדי לזהות אקדיסטרואידים שאינם ממוקדים, נותחו נתוני MS/MS עבור כל פיקי HPLC עם שפע יחסי של >15%. כימת באמצעות עקומות סטנדרטיות שנוצרו מסטנדרטים טהורים (20E, 3D20E) כדי לחשב כמויות מוחלטות או דילולים של דגימה ספציפית אחת (כל שאר המטרות) כדי לחשב את שקילותן לכמויות שנמצאו בזכר אחד. עבור 3D20E, כימות בוצע באמצעות סכום התוצרים הבאים: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. הנתונים חולצו וכימותו באמצעות Tracefinder (גרסה 4.1). נתוני MS/MS נותחו באמצעות Xcalibur (גרסה 4.4). ספקטרום ה-MS של E, 20E ו-3D20E הושווה לסטנדרטים המתאימים. 3D20E22P נותח על ידי נגזרת עם ריאגנט ג'ירארד. 20E22P נותח לפי יחס m/z.
3D20E22P טוהר מ-MAG. הטיהור בוצע בקנה מידה אנליטי באמצעות כרומטוגרף נוזלי בעל ביצועים גבוהים במיוחד (Acquity, Waters) עם גלאי מבוסס מסה קוואדרופול (QDa, Acquity, Waters) תחת אותם תנאי LC כמו בניתוח HPLC-MS/MS. איסוף השברים הופעל כאשר זוהה m/z המתאים ל-3D20E22P באותו זמן שמירה שנקבע קודם לכן. לאחר מכן נבדק טוהר התרכובות שחולצו באמצעות HPLC-MS/MS כמתואר לעיל.
RNA כולל חולץ מ-10-12 רקמות רבייה או חלקים אחרים בגוף (ללא ראש) באמצעות ריאגנט TRI (Thermo Fisher) בהתאם להוראות היצרן. ה-RNA טופל ב-TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA סונתז באמצעות טרנסקריפטאז הפוך של נגיף לוקמיה עכברי Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) בהתאם להוראות היצרן. פריימרים ל-PCR כמותי לתעתוק הפוך (RT-qPCR; טבלת נתונים מורחבת 2) פורסמו בעבר24 או עוצבו באמצעות Primer-BLAST26, עם עדיפות לתוצרים בגודל 70-150 בסיסים המשתרעים על פני צמתים אקסון-אקסון או פריימרים של זוגות פריימרים מפרידים אקסונים. דגימות cDNA משלושה עד ארבעה רפליקטים ביולוגיים דוללו פי ארבעה במים עבור RT-qPCR. כימות בוצע בתגובות רפליקטיות של 15 מיקרוליטר המכילות 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), פריימרים ו-5 מיקרוליטר של cDNA מדולל. התגובות בוצעו על גבי מכשיר QuantStudio 6 Pro בזמן אמת. מערכת PCR (Thermo Fisher) ונתונים נאספו ונותחו באמצעות Design and Analysis (גרסה 2.4.3). כפי שהודגם במחקר זה, הכמויות היחסיות נורמלו לגן הריבוזומלי RpL19 (AGAP004422), שביטויו לא השתנה באופן משמעותי עם הזנה בדם 27 או הזדווגות 3.
איכות ה-RNA נבדקה באמצעות Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). ספריות Illumina pair-end הוכנו והופעלו במכון Broad של MIT והרווארד. קריאות הריצוף יושרו לגנום של A. gambiae (זן PEST, גרסה 4.12) באמצעות HISAT2 (גרסה 2.0.5) עם פרמטרים ברירת מחדל. קריאות עם ציוני איכות מיפוי (MAPQ) <30 הוסרו באמצעות Samtools (גרסה 1.3.1). מספר הקריאות הממופות לגנים נספר באמצעות htseq-count (גרסה 0.9.1) עם פרמטרים ברירת מחדל. ספירות קריאות מנורמלות חושבו וביטוי גנים דיפרנציאלי נותח באמצעות חבילת DESeq2 (גרסה 1.28.1) ב-R (גרסה 4.0.3).
גנים מועמדים המשנים אקדיסון זוהו על ידי חיפוש תחילה בגנום A. gambiae באמצעות אלגוריתם PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), תוך שימוש בערכי ברירת מחדל של פרמטרים עם רצפי חלבוני השאילתה הבאים: מ-Bombyx mori (מספר גישה NP_001038956.1), Musca domestica (מספר גישה XP_005182020.1, XP_005175332.1 ו-XP_011294434.1) ו-Microplitis demolitor (מספר גישה XP_008552646.1 ו-XP_008552645.1) EcK מ-B. mori (מספר גישה NP_001036900), Drosophila melanogaster (מספר גישה NP_651202), Apis mellifera (מס' גישה XP_394838) ו-Acyrthosiphon pisum (מס' גישה XP_001947166); ו-EPP מ-B. mori (מס' גישה XP_001947166) NP_001177919.1 ו-NP_001243996.1) ו-EO של D. melanogaster (מס' גישה NP_572986.1) (שלב 1). לאחר מכן, סננו את ההישגים המבוססים על ביטוי mRNA גבוה (>100 אקסונים של מקטעים/קילובסיס לכל מיליון קריאות ממופות (FPKM) או >85%) ברקמת רבייה (LRT או MAG נקבי) בגמביה (שלב 2). כדי לשפר את הספציפיות, בחרנו אנזימים מועמדים המתבטאים גם ברקמת הרבייה של A. albimanus, מין אנופלס שאינו מסנתז או מעביר אקדיסון במהלך ההזדווגות. גנים מועמדים סוננו על סמך ביטוי נמוך (<100 FPKM או <85 אחוזון) ברקמת הרבייה של A. albimanus (שלב 3). כמסנן סופי (שלב 4), גנים מועמדים צריכים לעמוד לפחות באחד מהבאים: (1) עלייה משמעותית בוויסות לאחר ההזדווגות (P < 0.05) בהתאם לניתוח של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי ו-(2) ברקמות שאינן רבייתיות (< 85% או <100 FPKM).
שינינו את השיטות שתוארו קודם לכן 28,29,30 כדי להשיג סימון איזוטופי של כל האורגניזם. בקצרה, Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma) מסוג בר נבדק בבסיס חנקן שמרים (BD Difco, DF0335) המכיל (משקל/נפח) 2% גלוקוז (G7528, Sigma), 1.7% מצע תרבית ללא חומצות אמינו ואמוניום סולפט (מצע תרבית) ו-5% 15N אמוניום סולפט (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) כמקור החנקן היחיד. השמרים נאספו באמצעות צנטריפוגה וזחלי היתושים ניזונו באופן חופשי עד להתגלמות. תוספת של קמח דגים (0.5 מ"ג לכל 300 זחלים) כדי למנוע תמותה בשלב הרביעי. לאחר מכן נעשה שימוש רק בנקבות בניסויי הזדווגות עם זכרים לא מסומנים כדי לנתח את הפרוטאום הזכרי שהועבר במהלך ההזדווגות.
נקבות בתולות בנות 4-6 ימים עם תווית 15N אולצו להזדווג עם זכרים בתולות לא מתויגים תואמים בגילם. הזדווגות מוצלחת אומתה על ידי גילוי פקקי הזדווגות תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. ב-3, 12 ו-24 דקות לדקה, עלייה של 45-55 נקבות מזדווגות נותחו ל-50 מיקרוליטר של בופר אמוניום ביקרבונט (pH 7.8) והומוגנו בעזרת עלי. ההומוגנציה נצנטרפה והסופרנטנט עורבב עם 50 מיקרוליטר של 0.1% RapiGest (186001860, Waters) ב-50 mM אמוניום ביקרבונט. הסופרנטנט והגלולה מכל דגימה הוקפאו במהירות על קרח יבש ונשלחו למשך הלילה למעבדת MacCoss באוניברסיטת וושינגטון, שם הושלמה הכנת הדגימה ל-LC-MS/MS. השעיית הגלולה מחדש ב-50 מיקרוליטר של 0.1% RapiGest ב-50 mM אמוניום ביקרבונט וביצוע סוניקציה באמבט מים. ריכוז החלבון של הגלולה והסופרנטנט נמדד על ידי... בבדיקת BCA, דגימות עברו צמצום עם 5 mM דיתיותריטול (DTT; Sigma), אלקילציה עם 15 mM יודואצטמיד (Sigma) והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס (1:0 50) למשך שעה אחת עם טריפסיניזציה: יחס טריפסין:סובסטרט). RapiGest עבר ליזיס על ידי הוספת 200 mM HCl, ולאחר מכן הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות וצנטריפוגה ב-14,000 סל"ד למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להסרת פסולת. הדגימות נשטפו על ידי מיצוי דו-מצבי בפאזה מוצקה (מחסניות Oasis MCX, Waters) והושענו מחדש ב-0.1% חומצה פורמית לריכוז חלבון סופי של 0.33 מיקרוגרם מיקרוליטר-1. פרוטאומים MAG לא מסומנים נותחו באופן דומה מזכרים בתולים. שני חזרות אנליטיות נותחו עבור כל דגימה. לאחר מכן, נותח 1 מיקרוגרם מכל דגימה באמצעות עמודה של סיליקה התמזגה בגודל 25 ס"מ בגודל 75 מיקרומטר עם... מלכודת פריט Kasil1 (PQ) סיליקה התכה בגודל 4 ס"מ ארוזת בשרף Jupiter C12 בעל פאזה הפוכה (Phenomenex) וכרומטוגרפיית נוזלים במשך 180 דקות. עיכולי דגימות – MS/MS בוצעו על ספקטרומטר מסות Q-Exactive HF (Thermo Fisher) עם מערכת nanoACQUITY UPLC (Waters). נתוני רכישה הקשורים לנתונים שנוצרו עבור כל ריצה הומרו לפורמט mzML באמצעות Proteowizard (גרסה 3.0.20287) ובאמצעות Comet31 (גרסה 3.2) כנגד מסד הנתונים FASTA המכיל רצפי חלבונים מ-Anopheles gambiae (גרסה 54 של VectarBase), Anopheles coluzzi. בוצע חיפוש על Mali-NIH (גרסה 54 של VectarBase), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, מרץ 2021), RNA-seq של A. gambiae, ותרגומי שלוש מסגרות של מזהמים אנושיים ידועים. FDRs תואמים למפת פפטידים נקבעו באמצעות Percolator32 (גרסה 3.05) עם סף של 0.01, ופפטידים הורכבו לזיהוי חלבונים באמצעות פרסימוניית חלבונים ב-Limelight33 (גרסה...). 2.2.0). שפע חלבונים יחסי הוערך באמצעות גורם השפע הספקטרלי המנורמל (NSAF) שחושב עבור כל חלבון בכל ריצה כפי שתואר קודם לכן. ממוצע ה-NSAF ביחס לכל חלבון בוצע על פני דגימות משני חזרות ביולוגיות שונות. סימון 15N הסתיר בהצלחה את הפרוטאום הנקבי, אם כי ניתן היה לזהות כמות קטנה של חלבון לא מסומן מהבתולים המסומנים. תיעדנו זיהוי של הפחתת חלבון זכר (ספקטרום 1-5) בדגימות גולמיות של נקבות רק בהרצות טכניות, שבהן דגימות גולמיות נבדקו לאחר דגימות זכרים/הזדווגות, כתוצאה מ"נשיאה" של HPLC. חלבונים מזדמנים שנמצאו כ"מזהמים" מבתולים מסומנים מפורטים בטבלה המשלימה 1.
שני פפטידים אנטיגניים, QTTDRVAPAPDQQQ (בתוך האיזוטיפ PA) ו-MESDGTTPSGDSEQ (בתוך האיזוטיפ PA ו-PB) ב-Genscript. שני הפפטידים אוחדו, לאחר מכן חוברו לחלבון הנשא KLH והוזרקו לארנבים ניו זילנדיים. הארנבים הוקרבו לאחר הזריקה הרביעית, ו-IgG כולל בודד באמצעות טיהור זיקה. IgG מהארנב הספציפי ביותר ל-EPP שימש להמשך ה-Western blotting.
עבור דגימות Western blot, MAG (n = 10, כאשר n מייצג את מספר דגימות היתושים הבלתי תלויות ביולוגית) ו-LRT נקבות (n = 30) מזכרים בתולים בני 4 ימים ונקבות בתולות או נקבות שעברו הזדווגות בכפייה (פחות מ-10 לאחר ההזדווגות), נוסף בנפרד תמיסת מיצוי חלבונים (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% נתרן דאוקסיכלאט; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; קוקטייל מעכב פרוטאז 1× (Roche)). הדגימות עברו הומוגניזציה מיד לאחר הניתוח בעזרת חרוזי זכוכית (2 מ"מ חרוזי זכוכית, 2,400 סל"ד, 90 שניות). שאריות בלתי מסיסות הוסרו באמצעות צנטריפוגה ב-20,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס. החלבונים כימתו באמצעות בדיקת Bradford (Bio-Rad). לאחר מכן, 20 מיקרוגרם של חלבון MAG, 40 מיקרוגרם של חלבון LRT ו-20 מיקרוגרם של חלבון שיורי עברו דנטורציה והופרדו באמצעות... 10% Bis-Tris NuPAGE באמצעות בופר MOPS. חלבונים הועברו לממברנות פוליווינילידן פלואוריד באמצעות מערכת ההעברה iBlot2 (Thermo Fisher). הממברנות נשטפו פעמיים ב-1× PBS-T (0.1% Tween-20 ב-PBS) ולאחר מכן נחסמו בבופר חסימה של Odyssey (Li-Cor) למשך שעה אחת ב-22°C. הממברנות נוערו למשך הלילה ב-4°C עם נוגדן ראשוני פוליקלונאלי אנטי-EPP ארנבת מותאם אישית (1:700 בבופר חסימה) ונוגדן ראשוני חד שבטי אנטי-אקטין חולדה MAC237 (Abeam; 1:4,000). הממברנות נשטפו עם PBS-T ולאחר מכן הודגרו עם נוגדנים משניים (חמור אנטי-ארנבת 800CW ועז אנטי-חולדה 680LT (Li-Cor), שניהם 1:20,000) בבופר חסימה המכיל 0.01% SDS ו-0.2% Tween-20 למשך שעה אחת ב-22... °C. הממברנות נשטפו עם PBS-T וצולמו באמצעות סורק Odyssey CLx. התמונות נאספו ועובדו ב-Image Studio (גרסה 5.2). לא זוהה פס ספציפי התואם לאיזופורם EPP-RA (82 kDa).
אזורי הקידוד של EPP (כאיזופורם AGAP002463-RB המכיל תחום היסטידין פוספטאז, NCBI conserved domain search 34) ו-EcK2 (AGAP002181) שובטו לתוך פלסמיד pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); פריימרים רשומים בטבלת נתונים מורחבת 2. שמונה לינקרים GS4 (בד בבד) הוכנסו לפני תג 6xHis C-טרמינלי של קונסטרקט pET-21a(+)-EcK2. חלבונים רקומביננטיים יוצרו באמצעות תגובת סינתזת חלבון E. coli נטולת תאים של NEBExpress (New England BioLabs). חלבונים רקומביננטיים טוהרו באמצעות עמודות ספין NEBExpress Ni (New England BioLabs). חלבון בקרה דיהידרופולט רדוקטאז (DHFR) יוצר באמצעות תבנית DNA מערכת סינתזת חלבון E. coli נטולת תאים של NEBExpress. חלבונים אוחסנו בגליצרול 50% ב-PBS ב-20°C- למשך עד 3 חודשים.
פעילות פוספטאז של EPP ותמציות רקמות נמדדה באמצעות 4-ניטרופניל פוספט (pNPP; Sigma-Aldrich). בופר התגובה הכיל 25 mM Tris, 50 mM חומצה אצטית, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA ו-1 mM DTT. הרקמה עברה הומוגניזציה בבופר התגובה ושאריות תאים הוסרו באמצעות צנטריפוגה. התחל את התגובה על ידי הוספת אנזים או תמצית רקמה לבופר התגובה המכיל 2.5 מ"ג מ"ל-1 pNPP. תערובת התגובה הודגרה בטמפרטורת החדר בחושך, וכמות ה-pNP שהומרה מ-pNPP נמדדה כמותית על ידי מדידת הספיגה ב-405 ננומטר בזמנים שונים.
לצורך פעילות EcK במבחנה, החלבון הודגר עם 0.2 מ"ג 20E או 3D20E ב-200 מיקרוליטר תמיסת בופר (pH 7.5) המכילה 10 mM HEPES-NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ו-10 mM MgCl2 למשך שעתיים ב-27 מעלות צלזיוס. התגובה הופסקה על ידי הוספת 800 מיקרוליטר מתנול, לאחר מכן מקוררה ב-20 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן צורפה בצנטריפוגה ב-20,000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הנוזל העל-תכליתי נותח באמצעות HPLC-MS/MS. כדי להשבית בחום את החלבונים ששימשו בקבוצת הביקורת, החלבונים הודגרו ב-50% גליצרול ב-PBS למשך 20 דקות ב-95 מעלות צלזיוס.
לצורך פעילות EPP במבחנה, החלבון הודגר עם 3D20E22P (שווה ערך לכמות שנמצאה ב-18 זוגות של MAG, מטוהרים על ידי HPLC-MS/MS) בבופר של 100 מיקרוליטר (pH 7.5) המכיל 25 mM Tris, 50 mM חומצה אצטית, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA ו-1 mM DTT למשך 3 שעות ב-27 מעלות צלזיוס. התגובה הופסקה על ידי הוספת 400 מיקרוליטר מתנול וקוררה ב-20- מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, ולאחר מכן צורפה בצנטריפוגה ב-20,000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הנוזל העל-תכליתי נותח על ידי HPLC-MS/MS.
מקטעי PCR עבור EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ו-EcK2 (556 bp) הוגברו מ-cDNA שהוכן מגופות יתושים חסרי ראש מעורבים. מקטע ה-PCR של בקרת eGFP (495 bp) הוגבר מ-pCR2.1-eGFP שתואר קודם לכן; פריימרים של PCR רשומים בטבלת נתונים מורחבת 2. מקטע ה-PCR הוכנס בין מקדמי T7 הפוכים על פלסמיד pL4440. מבני פלסמיד הוחזרו מ-NEB 5-α competent E. coli (New England Biolabs) ואומתו על ידי ריצוף DNA לפני השימוש (ראה נתונים משלימים 1 עבור רצף הכנס). פריימרים שתואמים לקדם T7 (טבלת נתונים מורחבת 2) שימשו להגברת הכנס מהפלסמיד מבוסס pL4440. גודל מוצר ה-PCR אושר על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. dsRNA תועתק מתבניות PCR באמצעות ערכת התעתוק Megascript T7 (Thermo Fisher) וטוהר לפי הוראות היצרן עם השינויים שתוארו קודם לכן.
לצורך הזרקת dsRNA, הוזרק 1,380 ננוגרם של dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) בריכוז של 10 ננוגרם nl-1 לבית החזה של זכרים או נקבות בוגרים (Nanoject III, Drummond) תוך יום אחד לאחר הסגירה. רמות נוקאאוט גנים נקבעו בשלושה חזרות ביולוגיות לפחות על ידי מיצוי RNA, סינתזת cDNA ו-RT-qPCR. לצורך הזרקת אקדיסון, נקבות בתולות בנות 4 ימים או 6 ימים שניזונו מדם הוזרקו עם 0.13, 0.21 או 0.63 מיקרוגרם של 20E או 3D20E (Nanoject III, Drummond) בריכוזים של 1.3, 2.1, בהתאמה, בהתאם לתכנון הניסוי או 6.3 ננוגרם nl-1. הזרק 100 ננוגרם של אתנול 10% (vol/vol) במים; 100 ננו-ליטר של 3D20E22P ב-10% אתנול (שווה ערך ל-75% מהכמות שנמצאה בזוג MAGs). יתושים חולקו באופן אקראי לקבוצת ההזרקה.
עבור מבחני הטלה, נקבות בנות 3 ימים ניזונו מדם אנושי כרצונן. הוסרו יתושים שניזונו חלקית או שלא ניזונו. בהתאם לטיפול, הנקבות הונחו בכוסות הטלה נפרדות למשך ארבעה לילות לפחות 48 שעות לאחר ארוחת הדם. הביצים נספרו תחת סטריאוסקופ (Stemi 508, Zeiss); עבור נקבות שהזדווגו, ביצים שבקעו לזחלים נחשבו פוריות.
עבור ניסויי הזדווגות, לנקבות ניתנה לפחות יומיים, בהתאם לטיפול, כדי לפתח עמידות להזדווגות, ולאחר מכן הוכנסו זכרים מהסוג הבר, תואמי גיל, לאותו כלוב. שני לילות לאחר מכן, שלפוחיות הנקבות שעברו הפריה נותחו ו-DNA גנומי שוחרר באמצעות הקפאה-הפשרה וסוניקציה בתוך בופר המכיל 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ו-25 mM NaCl (pH 8.2). הדגימות הודגרו עם Proteinase K (0.86 מיקרוגרם מיקרוליטר) למשך 15 דקות ב-55 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס. תכשירי DNA גנומי גולמי דוללו פי 10 ועברו זיהוי qPCR של רצפי כרומוזום Y; הפריימרים רשומים בטבלת נתונים מורחבת 2. היעדר רצף כרומוזום Y מעיד על חוסר הזדווגות.
עבור מבחני הזדווגות חוזרת, נקבות שעברו הזדווגות בכוח נבדקו לנוכחות פקקי הזדווגות כדי לאשר את מצב ההזדווגות ואפשרו יומיים לפתח עמידות להזדווגות בהיעדר זכרים, כפי שתואר קודם לכן 36. זכרים הנושאים זרע טרנסגני DsRed הוכנסו לאחר מכן לכלובים של נקבות. שני לילות לאחר מכן, שלפוחיות ההפרה נותחו מהנקבות, ו-DNA גנומי הוכן כמתואר לעיל ועבר גילוי qPCR של הטרנסגן DsRed; הפריימרים מפורטים בטבלת הנתונים המורחבת 2. היעדר הטרנסגן DsRed הצביע על כך שלא התרחש הזדווגות חוזרת.
3D20E סונתז כפי שתואר קודם לכן 37. בקצרה, 10 מ"ג של 20E (Sigma-Aldrich) הומסו ב-10 מ"ל מים, ולאחר מכן הוסיפו 30 מ"ג של פלטינה שחורה (בצורת אבקה, Sigma-Aldrich). זרם עדין של O2 הוזרם ברציפות לתוך תערובת התגובה, אשר עורבבה בטמפרטורת החדר. לאחר 6 שעות, נוספו 30 מ"ל של מתנול כדי לעצור את התגובה. התערובת סורכזה כדי להסיר חלקיקי זרז. הנוזל העליון התאדה ליובש בוואקום בטמפרטורת החדר. תוצר התגובה היבש הומס באתנול 10% ובמתנול להזרקה לניתוח HPLC-MS/MS. שיעור ההמרה (מ-20E ל-3D20E) היה כ-97% (איור 4b), וספקטרום ה-MS של ה-3D20E המסונתז תאם לזה שנמצא בנקבות מזווגות (איור 4c).
המקרא מכיל פרטים ספציפיים על המבחנים הסטטיסטיים שבוצעו. GraphPad (גרסה 9.0) שימש לביצוע המבחן המדויק של פישר, מבחן מנטל-קוקס ומבחן t של סטודנט. מבחני קוקרן-מנטל-האנזל בוצעו באמצעות סקריפט R מותאם אישית (זמין בכתובת https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). התפלגות הנתונים נבדקה לנורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילק עם סף מובהקות של 0.05. כאשר הנתונים נכשלו במבחן הנורמליות, בוצע מבחן מאן-ויטני. נתוני הישרדות נותחו באמצעות מבחן מנטל-קוקס. חבילת DESeq2 (גרסה 1.28.1) שימשה לביצוע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי ברמת גן RNA-seq. הסרגל האופקי בגרף מייצג את החציון. ערך מובהקות של P = 0.05 שימש כסף עבור כל המבחנים.
למידע נוסף על עיצוב המחקר, עיינו בתקציר של דוח המחקר של Nature המקושר למאמר זה.
נתוני פרוטאומיה של MS הופקדו בקונסורציום ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) דרך מאגר השותפים של PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) עם מזהה מערך הנתונים PXD032157.
מערך הנתונים של RNA-seq מופקד בספרייה המקיפה של ביטוי גנים (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) תחת הרשומה הסידורית GSE198665.
ניתן לקבל מערכי נתונים נוספים שנוצרו ו/או נותחו במהלך המחקר הנוכחי מהמחברים המתאימים על פי בקשה סבירה. מאמר זה מספק את נתוני המקור.
דה לוף, א. אקדיסטרואידים: סטרואידים מיניים של חרקים מוזנחים? זכר: קופסה שחורה. מדע החרקים. 13, 325–338 (2006).
רדפרן, CPF 20-הידרוקסיאקדיסון והתפתחות שחלות ב-Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).