Javascript מושבת כעת בדפדפן שלך. חלק מהתכונות של אתר זה לא יפעלו כאשר Javascript מושבת.
הירשמו עם הפרטים הספציפיים שלכם והתרופה הספציפית שמעניינת אתכם, ואנחנו נתאים את המידע שתספקו למאמרים במאגר הנתונים הנרחב שלנו ונשלח לכם עותק PDF בדוא"ל באופן מיידי.
גרגירי Ban-Lan-Gen מחלישים קוליטיס כרונית התקפית הנגרמת על ידי דקסטרן נתרן גופרתי בעכברים על ידי ויסות המיקרוביוטה של ​​המעי ושיקום ייצור SCFA Derived-GLP-1 במעי.
ג'יאו פנג, 1-3, *לי שי, 4, *ג'נג לין, 3, 5 דואן ליפאנג, 1 גאו ז'נגשיאן, 2, 5 דיהו, 1 לי ג'יה, 6 לי שיאופנג, 6 שן שיאנגצ'ון, 5 שיאו האיטאו 21מחלקת רוקחות בבית החולים של אוניברסיטת פקינג בשנג'ן, שנזן, הרפובליקה העממית של סין; 2בית הספר לרוקחות במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת שנזן, שנזן, הרפובליקה העממית של סין; 3מרכז המחקר לטכנולוגיות הנדסיות של אוניברסיטת גוויג'ואו לפיתוח ויישום של רפואה אתנית ורפואה סינית מסורתית, משרד החינוך, מעבדת הרוקחות של מחוז גוויג'ואו, אוניברסיטת גוויג'ואו לרפואה, גויאנג, הרפובליקה העממית של סין; 4מחלקת גסטרואנטרולוגיה, בית החולים של אוניברסיטת פקינג בשנג'ן, שנזן, הרפובליקה העממית של סין; 5בית הספר לרוקחות, אוניברסיטת גוויג'ואו לרפואה, מעבדת הרוקחות הממלכתית לתפקוד ויישום של צמחי מרפא, גויאנג; 6 המחלקה לרפואה מעבדתית, בית החולים של אוניברסיטת פקינג, שנזן, סין [email protected] שן שיאנגצ'ון, בית הספר לרוקחות, אוניברסיטת גוויג'ואו לרפואה, גוויג'ואו, הרפובליקה העממית של סין, 550004, דוא"ל [email protected] מטרה: טיפול מבוסס GLP-1 הוא אפשרות טיפול חדשה למחלות מעי דלקתיות. גרגירי Ban-Lan-Gen (BLG) הם פורמולציה אנטי-ויראלית ידועה של TCM המציגה פעילות אנטי-דלקתית פוטנציאלית בטיפול במצבים דלקתיים שונים. עם זאת, השפעתם האנטי-דלקתית על קוליטיס ומנגנון הפעולה שלהם עדיין אינם ברורים. שיטות: לקבוע קוליטיס כרונית התקפית הנגרמת על ידי דקסטרן נתרן גופרתי (DSS) בעכברים. מדדי פעילות מחלה, סמנים היסטולוגיים של פגיעה ורמות ציטוקינים פרו-דלקתיים בוצעו כדי להעריך את ההשפעה המגנה של BLG. השפעות BLG על המיקרוביוטה של ​​המעי והמעיים אופיינו על ידי רמות GLP-1 בסרום וביטוי Gcg, GPR41 ו-GRP43 במעי הגס, הרכב המיקרוביוטה של ​​המעי, רמות SCFAs בצואה ושחרור GLP-1 מ... ייצור GLP-1 של תאי אפיתל מעי גס ראשוניים בעכברים שמקורם ב-SCFA. תוצאות: טיפול ב-BLG הפחית משמעותית את ירידה במשקל הגוף, את הירידה במשקל הדם (DAI), את קיצור המעי הגס, את הנזק לרקמת המעי הגס ואת רמות הציטוקינים הפרו-דלקתיים של TNF-α, IL-1β ו-IL-6 ברקמת המעי הגס. בנוסף, טיפול ב-BLG יכול לשקם משמעותית את הביטוי של Gcg, GPR41 ו-GRP43 במעי הגס ואת רמות GLP-1 בסרום בעכברי קוליטיס, ועל ידי הגדלת חיידקים מייצרי SCFA כגון Akkermansia ו-Prevotellaceae_UCG-001, והפחתת שפע החיידקים כגון Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas ו-Oscillibacter. בנוסף, טיפול ב-BLG יכול להגביר משמעותית את רמת ה-SCFA בצואה של עכברי קוליטיס. במקביל, ניסויים חוץ גופיים הראו גם שתמצית הצואה של עכברים שטופלו ב-BLG יכולה לעורר מאוד את תאי האפיתל המעי הגס הקטנים הראשוניים של עכברים המפרישים GLP-1. מסקנות: ממצאים אלה מצביעים על כך של-BLG יש השפעה אנטי-קוליטיס. ל-BLG יש פוטנציאל לפתח כטיפול, לפחות בחלקו על ידי ויסות המיקרוביוטה של ​​המעי ושיקום ייצור GLP-1 שמקורו ב-SCFA במעי. תרופות מבטיחות לקוליטיס כרונית התקפית. מילות מפתח: קוליטיס, גרנולות Ban-Lan-Gen, מיקרוביוטת מעי, חומצות שומן קצרות שרשרת, GLP-1
קוליטיס כיבית (UC) היא מחלה דלקתית ארוכת טווח של המעי הגס והרקטום המאופיינת בשלשולים חוזרים, כאבי בטן, ירידה במשקל וצואה דמית מוגלתית.1 לאחרונה, שכיחות קוליטיס כיבית נמצאת במגמת עלייה במדינות עם שכיחות נמוכה בעבר, כולל סין, עם הפופולריות הגוברת של אורח חיים מערבי.2 עלייה זו מציבה בעיות משמעותיות לבריאות הציבור ויש לה השלכות חמורות על יכולתם של החולים לעבוד ואיכות חייהם. ראוי לציין כי הפתוגנזה של קוליטיס כיבית נותרה לא ברורה ברובה, אך מקובל בדרך כלל כי גנטיקה, גורמים סביבתיים, המיקרוביוטה של ​​המעי ומערכת החיסון תורמים כולם להתפתחות קוליטיס כיבית.3 גם כיום, אין תרופה לקוליטיס כיבית, ומטרת הטיפול היא לשלוט קלינית בתסמינים קליניים, לגרום ולשמור על הפוגה, לקדם ריפוי רירי ולהפחית הישנות. טיפולים קלאסיים כוללים אמינוסליצילטים, קורטיקוסטרואידים, מדכאי חיסון ותרופות ביולוגיות. עם זאת, תרופות אלו אינן יכולות להשיג את האפקט הרצוי עקב תופעות הלוואי השונות שלהן.4 לאחרונה, מחקרי מקרה רבים הראו כי הרפואה הסינית המסורתית (TCM) הראתה פוטנציאל גדול בסיוע... להקלה על אולטרה סאונד (UC) ברעילות נמוכה, דבר המצביע על כך שפיתוח טיפולים חדשים ברפואה הסינית (TCM) הוא אסטרטגיית טיפול מבטיחה עבור אולטרה סאונד.5-7
גרגירי בנלנגן (BLG) הם תכשיר רפואה סינית מסורתית העשוי מתמצית מימית של שורש בנלנגן.8 בנוסף ליעילותו האנטי-ויראלית, BLG מציג פעילות אנטי-דלקתית פוטנציאלית בטיפול במצבים דלקתיים שונים.9,10 בנוסף, גלוקוזינולטים (R,S-גויטרין, פרוגויטרין, אפיפרורובין וגלוקוזיד בודדו וזוהו מתמציות מימיות של Radix isatidis) ונוקלאוזידים (היפוקסנטין, אדנוזין, אורידין וגואנוזין) ואלקלואידים של אינדיגו כגון אינדיגו ואינדירובין.11,12 מחקרים קודמים תיעדו היטב כי התרכובות אדנוזין, אורידין ואינדירובין מציגות השפעות חזקות נגד קוליטיס במודלים שונים של בעלי חיים של קוליטיס.13-17 עם זאת, לא נערכו מחקרים מבוססי ראיות כדי להעריך את יעילות BLG בקוליטיס. במחקר הנוכחי, חקרנו את ההשפעה המגנה של BLG על קוליטיס כרונית התקפית הנגרמת על ידי דקסטרן נתרן סולפט (DSS) בעכברי C57BL/6. ומצא כי מתן פומי של BLG החליש משמעותית דלקת כרונית התקפית במעי הגס הנגרמת על ידי DSS בעכברים, מנגנוני הרגולציה שלה קשורים לוויסות המיקרוביוטה של ​​המעי ושיקום ייצור פפטיד דמוי גלוקגון 1 (GLP-1) שמקורו במעי.
גרגירי BLG (ללא סוכר, מאושר על ידי NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., בייג'ינג, סין; מספר אצווה: 20110966) נרכשו מבתי מרקחת. DSS (משקל מולקולרי: 36,000–50,000 דלטון) נרכש מ-MP Biologicals (סנטה אנה, ארה"ב). סולפאסלזין (SASP) (טוהר ≥ 98%), המטוקסילין ואאוזין נרכשו מסיגמא-אלדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב). ערכות בדיקת עכבר TNF-α, IL-1β ו-IL-6 luminex Elisa נרכשו ממערכות R&D (מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"ב). חומצה אצטית, חומצה פרופיונית וחומצה בוטירית נרכשו מאלאדין תעשיות (שנחאי, סין). חומצה 2-אתילבוטירית נרכשה מ-Merck KGaA (דרמשטט, גרמניה).
עכברי C57BL/6 זכרים בני 6-8 שבועות (משקל גוף 18-22 גרם) נרכשו מחברת Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (בייג'ינג, סין) ושוכנו בסביבה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות. עכברים ניזונו מתזונה סטנדרטית של מכרסמים עם גישה חופשית למי שתייה למשך שבוע אחד כדי להסתגל לסביבה החדשה. לאחר מכן חולקו העכברים באופן אקראי לארבע קבוצות: קבוצת ביקורת, קבוצת מודל DSS, קבוצת טיפול ב-SASP (200 מ"ג/ק"ג, דרך הפה) וקבוצת טיפול ב-BLG (1 גרם/ק"ג, דרך הפה). כפי שמוצג באיור 1A, על פי המחקר הקודם שלנו, קוליטיס כרונית התקפית ניסיונית הושרה בעכברים על ידי שלושה מחזורים של 1.8% DSS למשך 5 ימים, ולאחר מכן מים מזוקקים למשך 7 ימים, על פי המחקר הקודם שלנו.18 עכברים בקבוצות הטיפול ב-SASP וב-BLG טופלו ב-SASP וב-BLG, בהתאמה, מדי יום החל מיום 0. על פי ניסויים ראשוניים, המינון של BLG נקבע על 1 גרם/ק"ג. בינתיים, מינון ה-SASP נקבע על 200 מ"ג/ק"ג בהתאם לספרות.4 קבוצות המודל של הביקורת וקבוצת המודל של DSS קיבלו את אותה נפח מים לאורך כל הניסוי.
איור 1: BLG משפר את מצב המעי הגס התקפי הכרוני הנגרמת על ידי DSS בעכברים. (א) תכנון ניסויי של קוליטיס כרונית חוזרת וטיפול, (ב) שינוי במשקל הגוף, (ג) ציון מדד פעילות המחלה (DAI), (ד) אורך המעי הגס, (ה) תמונה מייצגת של המעי הגס, (ו) צביעת H&E של המעי הגס (הגדלה, ×100) ו-(ז) ציון היסטולוגי. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 6). ##p < 0.01 או ###p < 0.001 לעומת קבוצת הביקורת (Con); *p < 0.05 או **p < 0.01 או ***p < 0.001 לעומת קבוצת DSS.
משקל גוף, עקביות צואה ודימום רקטלי נרשמו מדי יום. מדד פעילות המחלה (DAI) נקבע על ידי שילוב ציוני משקל גוף, עקביות צואה ודימום רקטלי כמתואר קודם לכן.19 בסוף הניסוי, כל העכברים הורדמו ודם, צואה ומעי גס נאספו לניסויים נוספים.
רקמת המעי הגס קובעה בפורמלין והוטמעה בפרפין. חתכים של 5 מיקרון נוצרו ונצבעו בהמטוקסילין-אאוזין (H&E), לאחר מכן עברו סינוור וניקוד כמתואר קודם לכן.19
RNA כולל של רקמת המעי הגס חולץ באמצעות ריאגנט Trizol (Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה), ולאחר מכן בוצע מיצוי cDNA באמצעות רוורס טרנסקריפטאז (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, יפן). PCR כמותי בוצע באמצעות מערכת PCR בזמן אמת עם SYBR Green Master (Roche, באזל, שוויץ). תמלילי גן המטרה מנורמלו ל-β-אקטין והנתונים נותחו באמצעות שיטת 2-ΔΔCT. רצפי הפריימרים של הגנים מוצגים בטבלה 1.
בידוד ותרבית של תאי אפיתל מעי גס ראשוניים של עכברים בוצעו כפי שתואר קודם לכן.20 בקצרה, מעיים של עכברים בני 6-8 שבועות נכרתו תחילה לאחר הקרבה על ידי פריקה צווארית, לאחר מכן נפתחו לאורכם, טופלו בתמיסת מלח מאוזנת של Hanks (HBSS, ללא סידן ומגנזיום) ונחתכו לחתיכות קטנות של 0.5-1 מ"מ. לאחר מכן, הרקמות עוכלו עם 0.4 מ"ג/מ"ל קולגנאז XI (Sigma, Poole, UK) במדיום DMEM חופשי וצנטריפוגה ב-300 xg למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השעיית הגלולה מחדש במדיום DMEM (בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 יחידות/מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) ב-37 מעלות צלזיוס והעברה דרך רשת ניילון (גודל נקבוביות ~250 מיקרומטר). מנות של תאי אפיתל מעי גס הונחו בצלחות בעלות תחתית זכוכית והודגרו עם חומצה אצטית, חומצה פרופיונית, חומצה בוטירית ו-עכבר. תמציות צואה למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
רקמת המעי הגס עברה הומוגניזציה באמצעות PBS, ורמות הציטוקינים IL-6, TNF-α ו-IL-1β ברקמת המעי הגס זוהו באמצעות ערכות בדיקת ELISA של luminex (R&D systems, מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"ב). באופן דומה, רמות GLP-1 בסרום ובמדיום תרבית של תאי אפיתל מעי גס ראשוניים של עכברים נקבעו באמצעות ערכת ELISA (Bioswamp, ווהאן, סין) בהתאם להוראות היצרן.
DNA כולל מהצואה חולץ באמצעות ערכת מיצוי DNA (Tiangen, סין). איכות וכמות ה-DNA נמדדו ביחסים של 260 ננומטר/280 ננומטר ו-260 ננומטר/230 ננומטר, בהתאמה. לאחר מכן, תוך שימוש בכל DNA שחולץ כתבנית, נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים 338F (ACTCCTACGGGAGGCAG) ו-806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) כדי להגביר את אזורי V3-V4 של גן 16S rRNA באזורים שונים. תוצרי PCR טוהרו באמצעות ערכת מיצוי ג'ל QIAquick (QIAGEN, גרמניה), כומתו על ידי PCR בזמן אמת, ורוצפו באמצעות פלטפורמת הריצוף IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., קליפורניה, ארה"ב). לצורך ניתוח ביואינפורמטיקה, עיבוד הנתונים בוצע בהתאם לפרוטוקולים שדווחו בעבר.21,22 בקיצור, השתמשו ב-Cutadapt (V1.9.1) כדי לסנן קבצי אקספרס גולמיים. יחידות OTU אוגדו באמצעות UPARSE (גרסה 7.0.1001) עם סף דמיון של 97%, ו-UCHIME שימש להסרת רצפים כימריים. ניתוח וסיווג הרכב הקהילה בוצעו באמצעות מסווג RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) המבוסס על מסד הנתונים של גנים של RNA ריבוזומלי של SILVA.
רמות חומצות שומן קצרות שרשרת (חומצה אצטית, חומצה פרופיונית וחומצה בוטירית) נמדדו כפי שתואר קודם לכן על ידי טאו ואחרים, עם כמה שינויים.23 בקצרה, 100 מ"ג של צואה הושעו תחילה ב-0.4 מ"ל של מים מזוקקים, ולאחר מכן 0.1 מ"ל של חומצה גופרתית 50% ו-0.5 מ"ל של חומצה 2-אתילבוטירית (סטנדרט פנימי), לאחר מכן הומוגנו וחוממו ב-4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה במהירות של 12,000 סל"ד למשך 15 דקות בטמפרטורה של מעלות צלזיוס (C). הנוזל העליון חולץ עם 0.5 מ"ל של אתר והוזרק לתוך כרומטוגרפיית גז לצורך ניתוח. לצורך ניתוח כרומטוגרפיית גז (GC), דגימות נותחו באמצעות כרומטוגרף גז GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) המצויד בגלאי יינון להבה (FID). ההפרדה הושגה באמצעות עמודה ZKAT-624, 30 מטר × 0.53 מ"מ × 0.3 מיקרומטר (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., סין). הנתונים נאספו באמצעות תוכנת פתרון GC (Shimadzu, Inc.). יחס הפיצול היה 10:1, גז הנשא היה חנקן, וקצב הזרימה היה 6 מ"ל/דקה. נפח ההזרקה היה 1 מיקרוליטר. טמפרטורת המזרק והגלאי הייתה 300 מעלות צלזיוס. טמפרטורת התנור נשמרה על 140 מעלות צלזיוס למשך 13.5 דקות, ולאחר מכן הועלתה ל-250 מעלות צלזיוס בקצב של 120 מעלות צלזיוס/דקה; הטמפרטורה נשמרה למשך 5 דקות.
הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן של הממוצע (SEM). משמעות הנתונים הוערכה באמצעות ANOVA חד-כיווני ולאחר מכן מבחן טווחים מרובה של דאנקן. תוכנת GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב) שימשה לכל החישובים ו-p < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.
ידוע היטב כי קוליטיס כרונית התקפית היא מחלת קוליטיס כרונית התקפית עם כאבי בטן עזים, שלשולים ודימום. לכן, נקבע כי קוליטיס כרונית התקפית הנגרמת על ידי DSS בעכברים כדי להעריך את היעילות של BLG נגד קוליטיס (איור 1A). בהשוואה לקבוצת הביקורת, עכברים בקבוצת המודל DSS הראו ירידה משמעותית במשקל הגוף ו-DAI גבוה יותר, ושינויים אלה התהפכו משמעותית לאחר 24 ימים של טיפול ב-BLG (איור 1B ו-C). קיצור המעי הגס הוא סימן היכר חשוב של קוליטיס כרונית. כפי שמוצג באיורים 1D ו-E, אורכי המעי הגס של עכברים שקיבלו DSS התקצרו משמעותית, אך טיפול ב-BLG הקל בהם. לאחר מכן, בוצע ניתוח היסטופתולוגי כדי להעריך דלקת במעי הגס. תמונות צבועות H&E וציוני פתולוגיה הראו כי מתן DSS שיבש באופן משמעותי את הארכיטקטורה של המעי הגס והביא להרס קריפטה, בעוד שטיפול ב-BLG הפחית משמעותית את הרס הקריפטה ואת הציונים הפתולוגיים (איור 1F ו-G). ראוי לציין כי ההשפעה המגנה של BLG במינון של 1 גרם/ק"ג הייתה דומה לזו של SASP במינון של 200 מ"ג/ק"ג. יחד, ממצאים אלה מצביעים על כך ש-BLG יעיל בהפחתת חומרת קוליטיס כרונית התקפית הנגרמת על ידי DSS בעכברים.
TNF-α, IL-1β ו-IL-6 הם סמנים דלקתיים חשובים של דלקת במעי הגס. כפי שמוצג באיור 2A, DSS גרם לעלייה משמעותית בביטוי הגנים של TNF-α, IL-1β ו-IL-6 במעי הגס בהשוואה לקבוצת הביקורת. מתן BLG יכול להפוך באופן משמעותי את השינויים הללו בתיווך DSS. לאחר מכן, השתמשנו ב-ELISA כדי לקבוע את רמות הציטוקינים הדלקתיים TNF-α, IL-1β ו-IL-6 ברקמת המעי הגס. התוצאות הראו גם שרמות TNF-α, IL-1β ו-IL-6 במעי הגס עלו משמעותית בעכברים שטופלו ב-DSS, בעוד שטיפול ב-BLG הקל על עליות אלו (איור 2B).
איור 2: BLG מעכב ביטוי גנים וייצור של ציטוקינים מעודדי דלקת TNF-α, IL-1β ו-IL-6 במעי הגס של עכברים שטופלו ב-DSS. (א) ביטוי גנים במעי הגס של TNF-α, IL-1β ו-IL-6; (ב) רמות חלבון במעי הגס של TNF-α, IL-1β ו-IL-6. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 4–6). #p < 0.05 או ##p < 0.01 או ###p < 0.001 לעומת קבוצת הביקורת (Con); *p < 0.05 או **p < 0.01 לעומת קבוצת DSS.
דיסביוזה של המעיים היא קריטית בפתוגנזה של קוליטיס כיבית.24 כדי לחקור האם BLG מווסת את המיקרוביוטה של ​​המעי של עכברים שטופלו ב-DSS, בוצע ריצוף 16S rRNA כדי לנתח את קהילת החיידקים של תוכן המעי. דיאגרמת ון מראה כי שלוש הקבוצות חולקות 385 OTUs. במקביל, לכל קבוצה היו OTUs ייחודיים (איור 3A). יתר על כן, מדד Chao1 ומדד שאנון המוצגים באיור 3B ו-C הראו כי גיוון הקהילות של המיקרוביוטה של ​​המעי הופחת בעכברים שטופלו ב-BLG, כאשר מדד שאנון ירד משמעותית בקבוצה שטופלה ב-BLG. ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וניתוח קואורדינטות עיקריות (PCoA) שימשו לקביעת דפוסי אשכול בין שלוש הקבוצות והראו כי מבנה הקהילה של עכברים שטופלו ב-DSS היה מופרד בבירור לאחר טיפול ב-BLG (איור 3D ו-E). נתונים אלה מצביעים על כך שטיפול ב-BLG השפיע משמעותית על מבנה הקהילה של עכברים עם קוליטיס הנגרמת על ידי DSS.
איור 3: BLG משנה את מגוון המיקרוביוטה של ​​המעיים בעכברים עם קוליטיס הנגרמת על ידי DSS. (א) דיאגרמת ון של OTU, (ב) מדד Chao1, (ג) מדד העושר של שאנון, (ד) עלילת ציון ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של OTU, (ה) איור ציון ניתוח קואורדינטות עיקריות (PCoA) של OTU. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 6). **p < 0.01 לעומת קבוצת DSS.
כדי להעריך שינויים ספציפיים במיקרוביוטה הצואה, ניתחנו את הרכב המיקרוביוטה של ​​המעיים בכל הרמות הטקסונומיות. כפי שמוצג באיור 4A, המערכות העיקריות בכל הקבוצות היו Firmicutes ו-Bacteroidetes, ואחריהן Verrucomicrobia. השפע היחסי של Firmicutes ויחס Firmicutes/Bacteroidetes גדל משמעותית בקהילות המיקרוביאליות הצואה של עכברים שטופלו ב-DSS בהשוואה לעכברי ביקורת, ושינויים אלה התהפכו משמעותית לאחר טיפול BLG. בפרט, טיפול BLG הגביר משמעותית את השפע היחסי של Verrucobacterium בצואה של עכברים עם קוליטיס הנגרמת על ידי DSS. ברמת משק הבית, קהילות המיקרוביאליות הצואה היו תפוסות על ידי Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae ו-Prevotellaceae (איור 4B). בהשוואה לקבוצת DSS, דלדול BLG הגביר את שפע Akkermansiaceae, אך הפחית את שפע Lachnospiraceae ו-Ruminococcaceae. ראוי לציין, שברמת הסוג, המיקרוביוטה הצואה הייתה תפוסה על ידי קבוצת Lachnospira_NK4A136,‏ Akkermansia ו-Prevotellaceae_UCG-001 (איור 4C). ממצא זה גם הראה כי טיפול ב-BLG הפך ביעילות את חוסר האיזון במיקרוביוטה בתגובה לאתגר DSS, המאופיין בירידה בקבוצת Eubacterium_xylanophilum,‏ Ruminococcaceae_UCG-014,‏ Intestinimonas ו-Oscillibacter, ועלייה בקבוצת Akkermansia ו-Prevotellaceae_UCG-001.
איור 4: BLG משנה את שפע המיקרוביוטה במעי בעכברים עם קוליטיס מושרה על ידי DSS. (א) שפע המיקרוביוטה במעי ברמת המערכה; (ב) שפע המיקרוביוטה במעי ברמת המשפחה; (ג) שפע המיקרוביוטה במעי ברמת הסוג. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 6). #p < 0.05 או ###p < 0.001 לעומת קבוצת הביקורת (Con); *p < 0.05 או **p < 0.01 או ***p < 0.001 לעומת קבוצת DSS.
בהתחשב בכך שחומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) הן המטבוליטים העיקריים של Akkermansia ו-Prevotellaceae_UCG-001, בעוד אצטט, פרופיונט ובוטיראט הם חומצות השומן הקצרות הנפוצות ביותר בלומן המעי,25-27 אנו עדיין במחקר שלנו. כפי שמוצג באיור 5, ריכוזי אצטט, פרופיונט ובוטיראט בצואה הופחתו משמעותית בקבוצה שטופלה ב-DSS, בעוד שטיפול ב-BLG הצליח לדכא במידה רבה ירידה זו.
איור 5. BLG מגביר את רמות חומצות השומן הקשות (SCFAs) בצואה של עכברים עם קוליטיס הנגרמת על ידי DSS. (א) תכולת חומצה אצטית בצואה; (ב) תכולת חומצה פרופיונית בצואה; (ג) תכולת חומצה בוטירית בצואה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 6). #p < 0.05 או ##p < 0.01 לעומת קבוצת הביקורת (Con); *p < 0.05 או **p < 0.01 לעומת קבוצת DSS.
חישבנו בנוסף את מקדם המתאם של פירסון בין SCFA דיפרנציאלי ברמת הסוג לבין המיקרוביוטה הצואה. כפי שמוצג באיור 6, אקרמנסיה נמצאה בקורלציה חיובית עם ייצור חומצה פרופיונית (פירסון = 0.4866) וחומצה בוטירית (פירסון = 0.6192). לעומת זאת, גם אנטרומונס וגם אוסילובקטר נמצאו בקורלציה שלילית עם ייצור אצטט, עם מקדמי פירסון של 0.4709 ו-0.5104, בהתאמה. באופן דומה, Ruminococcaceae_UCG-014 נמצא בקורלציה שלילית עם ייצור חומצה פרופיונית (פירסון = 0.4508) וחומצה בוטירית (פירסון = 0.5842), בהתאמה.
איור 6 ניתוח קורלציה של פירסון בין חומצות שומן קצרות טווח דיפרנציאליות (SCFAs) לבין חיידקים במעי הגס. (א) אנטרומונס עם חומצה אצטית; (ב) חיידק זעזוע מוח עם חומצה אצטית; (ג) אקרמנסיה לעומת חומצה פרופיונית; (ד) רומינוקוקוס_UCG-014 עם חומצה פרופיונית; (ה) אקרמנסיה עם חומצה בוטירית; (ו) רומינוקוקוס _UCG-014 עם חומצה בוטירית.
פפטיד דמוי גלוקגון 1 (GLP-1) הוא תוצר פוסט-טרנסלציוני ספציפי לסוג תא של פרוגלוקגון (Gcg) בעל תכונות אנטי-דלקתיות.28 כפי שמוצג באיור 7, DSS גרם לירידה משמעותית בביטוי mRNA של Gcg. טיפול במעי הגס וב-BLG יכול להפוך באופן משמעותי את הירידה ב-Gcg הנגרמת על ידי DSS בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 7A). במקביל, רמת GLP-1 בסרום ירדה משמעותית בקבוצה שטופלה ב-DSS, וטיפול ב-BLG יכול למנוע במידה רבה ירידה זו (איור 7B). מכיוון שחומצות שומן קצרות שרשרת יכולות לעורר הפרשת GLP-1 באמצעות הפעלת קולטן מצומד לחלבון G 43 (GRP43) וקולטן מצומד לחלבון G 41 (GRP41), בדקנו גם GPR41 ו-GRP43 במעי הגס של עכברי קוליטיס ומצאנו שביטוי mRNA במעי הגס של GRP43 ו-GPR41 ירד משמעותית לאחר אתגר DSS, וטיפול ב-BLG יכול להציל ביעילות את הירידות הללו (איור 7C ו-7C). ד).
איור 7: BLG מגביר את רמות GLP-1 בסרום ואת ביטוי ה-mRNA של Gcg, GPR41 ו-GRP43 במעי הגס בעכברים שטופלו ב-DSS. (א) ביטוי mRNA של Gcg ברקמת המעי הגס; (ב) רמת GLP-1 בסרום; (ג) ביטוי mRNA של GPR41 ברקמת המעי הגס; (ד) ביטוי mRNA של GPR43 ברקמת המעי הגס. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 5–6). #p < 0.05 או ##p < 0.01 לעומת קבוצת הביקורת (Con); *p < 0.05 לעומת קבוצת DSS.
מאחר שטיפול ב-BLG יכול להגביר את רמות GLP-1 בסרום, ביטוי mRNA של Gcg במעי הגס, ורמות SCFA בצואה בעכברים שטופלו ב-DSS, בדקנו עוד יותר את שחרור GLP-1 מתאי אפיתל מעי גס ראשוניים של עכברים בעכברים שטופלו ב-DSS, כמו גם את שחרור ה-GLP-1 מעכברי אפיתל מעי גס ראשוניים של עכברים בעכברים שטופלו ב-2 mM חומצה אצטית, חומצה פרופיונית וחומצה בוטירית, בהתאמה.29,30 באופן דומה, כל ה-F-Con, F-DSS ו-F-BLG (שווה ערך ל-0.25 גרם של צואה) עוררו מאוד את שחרור ה-GLP-1 מתאי אפיתל מעי גס ראשוניים של עכברים. ראוי לציין כי כמות ה-GLP-1 ששוחררה על ידי תאי אפיתל מעי גס ראשוניים של עכברים שטופלו ב-F-DSS הייתה נמוכה בהרבה מזו של F-Con. ותאי אפיתל מעי גס עכברים ראשוניים שטופלו ב-F-BLG (איור 8B). נתונים אלה מצביעים על כך שטיפול ב-BLG שיפץ באופן משמעותי את ייצור GLP-1 שמקורו ב-SCFA במעי.
איור 8. חומצה שומנית SCFA שמקורה ב-BLG מגרה את שחרור GLP-1 מתאי אפיתל המעי הגס הראשוניים של עכברים. (א) חומצה אצטית, חומצה פרופיונית וחומצה בוטירית מגרות את שחרור GLP-1 מתאי אפיתל המעי הגס הראשוניים של עכברים; (ב) תמציות צואה F-Con, F-DSS ו-F-BLG מגרות תאי אפיתל המעי הגס הראשוניים של עכברים. כמות GLP-1 ששוחררה. מנות של תאי אפיתל המעי הגס הונחו בצלחות פטרי בעלות תחתית זכוכית וטופלו ב-2 mM חומצה אצטית, חומצה פרופיונית, חומצה בוטירית ותמציות צואה F-Con, F-DSS ו-F-BLG (שווה ערך ל-0.25 גרם צואה), בהתאמה. שעתיים ב-37°C, 5% CO2, בהתאמה. כמות ה-GLP-1 ששוחררה מתאי אפיתל מעי גס ראשוניים של עכבר זוהתה באמצעות ELISA. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). #p < 0.05 או ##p < 0.01 לעומת ריק או F-Con; *p < 0.05 לעומת F-DSS.
קיצורים: Ace, חומצה אצטית; Pro, חומצה פרופיונית; לעומת זאת, חומצה בוטירית; F-Con, תמצית צואה מעכברי ביקורת; F-DSS, תמצית צואה מעכברי קוליטיס; F-BLG, ממעי גס שטופלו ב-BLG. תמציות צואה מעכברים דלקתיים.
אולטרה סאונד, המחלה הקשה והמסוכנת ביותר ברשימה של ארגון הבריאות העולמי, הופכת לסכנה עולמית; עם זאת, שיטות יעילות לחיזוי, מניעה וטיפול במחלה עדיין מוגבלות. לכן, קיים צורך דחוף לחקור ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות ובטוחות עבור כימותרפיה. תכשירים מרפואה סינית מסורתית הם אופציה מבטיחה מכיוון שתכשירים רבים מרפואה סינית מסורתית הוכחו כיעילים בטיפול בכימית אולטרה סקוטית באוכלוסייה הסינית במשך מאות שנים, וכולם חומרים אורגניים ביולוגיים וחומרים טבעיים שברובם אינם מזיקים לבני אדם ולבעלי חיים.31,32 מחקר זה נועד לחפש תכשיר בטוח ויעיל מרפואה סינית מסורתית לטיפול בכימית אולטרה סקוטית ולחקור את מנגנון הפעולה שלו. BLG הוא פורמולת צמחים סינית ידועה המשמשת לטיפול בשפעת.8,33 עבודה במעבדה שלנו ובאחרים הראתה כי אינדיגו, מוצר מעובד מרפואה סינית מסורתית מאותו חומר גלם כמו BLG, מפגין יעילות משמעותית בטיפול בכימית אולטרה סקוטית בבני אדם ובבעלי חיים.4,34 עם זאת, ההשפעות האנטי-קוליטיס של BLG והמנגנון שלו אינם ברורים. במחקר הנוכחי, תוצאותינו מראות כי BLG מחליש ביעילות דלקת במעי הגס הנגרמת על ידי DSS, הקשורה לוויסות של מערכת העיכול. מיקרוביוטה ושיקום ייצור GLP-1 שמקורו במעי.
ידוע היטב כי קוליטיס כרונית התקפית מאופיינת בתקופות התקפיות עם מאפיינים קליניים אופייניים, כגון ירידה במשקל, שלשולים, דימום רקטלי ונזק נרחב לרירית המעי הגס.35 לפיכך, קוליטיס כרונית התקפית ניתנה על ידי מתן שלושה מחזורים של 1.8% DSS במשך חמישה ימים, ולאחר מכן שבעה ימים של שתיית מים. כפי שמוצג באיור 1B, ירידה במשקל משתנה וציוני DAI הצביעו על גרימת מוצלחת של קוליטיס כרונית התקפית. עכברים בקבוצה שטופלה ב-BLG הראו התאוששות מוגברת מיום 8, שהייתה שונה משמעותית מיום 24. אותם שינויים נצפו גם בציון DAI, דבר המצביע על שיפור בשיפור הקליני של קוליטיס. מבחינת פגיעה במעי הגס ומצב דלקתי, אורך המעי הגס, נזק לרקמת המעי הגס וביטוי גנים וייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים TNF-α, IL-1β ו-IL-6 ברקמת המעי הגס השתפרו משמעותית גם הם לאחר טיפול ב-BLG. יחד, תוצאות אלו מראות בבירור כי BLG יעיל בטיפול בקוליטיס כרונית התקפית בעכברים.
כיצד מפעילה BLG את השפעותיה הפרמקולוגיות? מחקרים קודמים רבים הראו כי למיקרוביוטה של ​​המעי תפקיד מפתח בפתוגנזה של קוליטיס כיבית, וטיפולים מבוססי מיקרוביום וממוקדי מיקרוביום צצו כאסטרטגיה אטרקטיבית מאוד לטיפול ב-UC. במחקר הנוכחי, הדגמנו כי טיפול ב-BLG הביא לשינויים משמעותיים בהרכב המיקרוביוטה של ​​המעי, דבר המצביע על כך שההשפעה המגנה של BLG כנגד קוליטיס הנגרמת על ידי DSS קשורה לוויסות המיקרוביוטה של ​​המעי. תצפית זו עולה בקנה אחד עם הרעיון שתכנות מחדש של ההומאוסטזיס של המיקרוביוטה של ​​המעי הוא גישה חשובה להבנת יעילותם של תכשירים רפואיים קליניים.36,37 ראוי לציין כי אקרמנסיה היא חיידק גראם-שלילי ואנאירובי לחלוטין שחי בשכבת הריר של המעי, אשר מפרקת מוקינים, מייצרת חומצה פרופיונית, מגרה התמיינות תאי גביע ושומרת על תפקוד שלמות המחסום הרירי.26 נתונים קליניים ובעלי חיים מרובים מצביעים על כך שאקרמנסיה קשורה קשר הדוק לרירית בריאה,38 ולמתן פומי של מינים מסוג Akkermansia. יכול לשפר משמעותית את הדלקת ברירית.39 הנתונים הנוכחיים שלנו מצביעים על כך שהשפע היחסי של Akkermansia עולה משמעותית לאחר טיפול ב-BLG. בנוסף, Prevotellaceae_UCG-001 הוא חיידק המייצר SCFA.27 מחקרים מרובים הראו ש-Prevotellaceae_UCG-001 נמצא בשפע יחסי נמוך בצואה של בעלי חיים עם קוליטיס.40,41 הנתונים הנוכחיים שלנו מראים גם שטיפול ב-BLG יכול להגדיל משמעותית את השפע היחסי של Prevotellaceae_UCG-001 במעי הגס של עכברים שטופלו ב-DSS. לעומת זאת, Oscillibacter הוא חיידק מזופילי, אנאירובי לחלוטין.42 דיווחו כי השפע היחסי של Oscillibacter עלה משמעותית בעכברי UC והיה בקורלציה חיובית משמעותית עם רמות IL-6 ו-IL-1β וציונים פתולוגיים.43,44 ראוי לציין שטיפול ב-BLG הפחית משמעותית את השפע היחסי של Oscillibacter בצואה של עכברים שטופלו ב-DSS. ראוי לציין שחיידקים אלו שעברו שינוי ב-BLG היו החיידקים המייצרים הכי הרבה SCFA. מחקרים קודמים רבים הדגימו את ההשפעות המועילות הפוטנציאליות של SCFA. על דלקת במעי הגס והגנה על שלמות אפיתל המעי.45,46 הנתונים הנוכחיים שלנו הראו גם כי ריכוזי אצטט, פרופיונאט ובוטיראט של SCFA בצואה שטופלה ב-DSS היו גבוהים משמעותית בעכברים שטופלו ב-BLG. יחד, ממצאים אלה מראים בבירור כי טיפול ב-BLG יכול לשפר ביעילות חיידקים מייצרי SCFA המושרים על ידי DSS בעכברים עם קוליטיס כרונית התקפית.
GLP-1 הוא אינקרטין המיוצר בעיקר באילאום ובמעי הגס והוא ממלא תפקיד חשוב בעיכוב ריקון הקיבה ובהורדת רמת הגלוקוז בדם לאחר ארוחה.47 עדויות מצביעות על כך שדיפפטידיל פפטידאז (DPP)-4, אגוניסט לקולטן GLP-1, וננו-רפואה של GLP-1 יכולים להקל ביעילות על דלקת מעיים בעכברים.48-51 כפי שדווח במחקרים קודמים, ריכוזים גבוהים של חומצות שומן רב פעמיות (SCFA) היו קשורים לרמות GLP-1 בפלזמה בבני אדם ובעכברים.52 הנתונים הנוכחיים שלנו מראים שלאחר טיפול ב-BLG, רמות GLP-1 בסרום וביטוי mRNA של Gcg עלו משמעותית. באופן דומה, הפרשת GLP-1 עלתה משמעותית בתרביות המעי הגס לאחר גירוי עם תמציות צואה מעכברים שטופלו ב-BLG עם קוליטיס בהשוואה לגירוי עם תמציות צואה מעכברים שטופלו ב-DSS עם קוליטיס. כיצד משפיעים חומצות שומן רב פעמיות (SCFA) על שחרור GLP-1? גוון טולהרסט ואח'. דיווחו כי SCFA יכול לעורר הפרשת GLP-1 דרך GRP43 ו-GPR41.29 הנתונים הנוכחיים שלנו מראים גם כי טיפול BLG מגביר משמעותית את ביטוי ה-mRNA של GRP43 ו-GPR41 במעי הגס של עכברים שטופלו ב-DSS. נתונים אלה מצביעים על כך שטיפול BLG יכול לשקם את ייצור GLP-1 המקודם על ידי SCFA על ידי הפעלת GRP43 ו-GPR41.
BLG היא תרופה ללא מרשם רופא (OTC) לטווח ארוך בסין. המינון המקסימלי הנסבל של BLG בעכברי קונמינג הוא 80 גרם/ק"ג, ולא נצפתה רעילות חריפה.53 נכון לעכשיו, המינון המומלץ של BLG (ללא סוכר) בבני אדם הוא 9-15 גרם/יום (3 פעמים ביום). המחקר שלנו הראה ש-BLG במינון של 1 גרם/ק"ג שיפר קוליטיס כרונית התקפית הנגרמת על ידי DSS בעכברים. מינון זה קרוב למינון BLG המשמש קלינית. המחקר שלנו מצא גם שמנגנון הפעולה שלו מתווך, לפחות בחלקו, על ידי שינויים במיקרוביוטה של ​​המעי, במיוחד חיידקים המייצרים SCFA, כגון Akkermansia ו-Prevotellaceae_UCG-001, כדי לשקם את ייצור GLP-1 שמקורו במעי. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-BLG ראוי לשיקול נוסף כגורם טיפולי פוטנציאלי לטיפול קליני בקוליטיס. עם זאת, המנגנון המדויק שבאמצעותו הוא מווסת את המיקרוביוטה של ​​המעי טרם אושר על ידי עכברים חסרי מיקרוביוטה והשתלת חיידקי צואה.
אס, חומצה אצטית; אבל, חומצה בוטירית; BLG, פנדאן; DSS, דקסטרן נתרן גופרתי; DAI, מדד פעילות המחלה; DPP, דיפפטידיל פפטידאז; FID, גלאי יינון להבה; F-Con, בקרה; תמציות צואה של עכברים; F-DSS, תמציות צואה של עכברי קוליטיס DSS; F-BLG, תמציות צואה של עכברי קוליטיס שטופלו ב-BLG; GLP-1, פפטיד דמוי גלוקגון-1; Gcg, גלוקגון; כרומטוגרפיית גז, כרומטוגרפיית גז; GRP43, קולטן מצומד לחלבון G 43; GRP41, קולטן מצומד לחלבון G 41; H&E, המטוקסילין-אאוזין; HBSS, תמיסת מלח מאוזנת של הנקס; OTC, OTC; PCA, ניתוח רכיבים עיקריים; PCoA, ניתוח קואורדינטות עיקריות; Pro, חומצה פרופיונית; SASP, סולפסלאזין; SCFA, חומצות שומן קצרות שרשרת; רפואה סינית, רפואה סינית מסורתית; UC, קוליטיס כיבית.
כל הפרוטוקולים הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה בבעלי חיים של המרכז הרפואי למדע וטכנולוגיה של אוניברסיטת פקינג שנזן-הונג קונג (שנג'ן, סין) בהתאם להנחיות המוסדיות ותקנות בעלי חיים (מספר אתיקה A2020157).
כל המחברים תרמו תרומה משמעותית לתכנון ולעיצוב, לרכישת נתונים, או לניתוח ופרשנות נתונים; השתתפו בניסוח המאמר או בעריכה ביקורתית של תוכן אינטלקטואלי חשוב; הסכימו להגיש את כתב היד לכתב העת הנוכחי; אישרו סופית את הגרסה לפרסום; היו אחראים על כל היבטי העבודה.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81560676 ו-81660479), הפרויקט מהשורה הראשונה של אוניברסיטת שנזן (86000000210), קרן ועדת החדשנות למדע וטכנולוגיה של שנזן (JCYJ20210324093810026), וקרן המחקר למדע וטכנולוגיה רפואיים של מחוז גואנגדונג (A2020157 ו-A2020272), בית המרקחת של אוניברסיטת גוויג'ואו לרפואה במחוז גוויג'ואו במימון Key Laboratory (YWZJ2020-01) ובית החולים של אוניברסיטת פקינג שנזן (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. פוטנציאל טיפולי של טריפטוליד כחומר אנטי דלקתי בקוליטיס ניסיונית הנגרמת על ידי דקסטרן נתרן גופרתי בעכברים. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. קפלן GG. הנטל העולמי של IBD: מ-2015 עד 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. פנג ג', ג'נג טי טי, לי שואה ואחרים. אלקלואידים שמקורם בצמחים: גורמים מבטיחים לשינוי מחלות במחלות מעי דלקתיות. פרפרמקולוגיה. 2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. שיאו הייטנג, פנג ג'יה, וון ב', ואחרים. אינדיגו טבעי מעכב עקה חמצונית במעי הגס ותגובות Th1/Th17 בקוליטיס המושרה על ידי DSS בעכברים. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945.doi: 10.1155/2019/9480945
5. צ'ן מ', דינג י', טונג ז'. יעילות ובטיחות של צמחי מרפא סיניים מסוג Sophora flavescens (Sophora flavescens) בטיפול בקוליטיס כיבית: ראיות קליניות ומנגנונים פוטנציאליים. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. קאו פאנג, ליו ג'יה, שה בנקסינג, פאן HF. מוצרים טבעיים: תרופות יעילות בניסוי לטיפול במחלות מעי דלקתיות. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. ג'אנג סי, ג'יאנג מ', לו א'. הרהורים על טיפול אדג'ובנטי בקוליטיס כיבית ברפואה סינית מסורתית. חיסון אלרגיה קליני. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. לי ז'ונגטנג, לי לי, צ'ן טי טי, ואחרים. יעילות ובטיחות של גרגירי בנלאנגן בטיפול בשפעת עונתית: פרוטוקול מחקר עבור ניסוי מבוקר אקראי. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x