מיון חלבונים במסלול ההפרשה חיוני לשמירה על מידור תאים והומאוסטזיס. ​​בנוסף למיון בתיווך קליפה, תפקידם של ליפידים במיון קינסין בתהליך ההובלה ההפרשית הוא שאלה בסיסית ארוכת שנים שטרם נענתה. כאן, אנו מבצעים הדמיה תלת-ממדית סימולטנית רב-צבעונית ברזולוציה גבוהה בזמן אמת כדי להוכיח in vivo שחלבונים חדשים שסונתזו, שעברו קיבוע בגליקוזילפוספטידילינוזיטול, עם קבוצות ליפידים ארוכות מאוד של סרמיד, מקובצים ומסווגים לאתר יציאה נטו של אנדופלזמה מיוחדת, השונה מזה המשמש חלבונים טרנסממברנליים. בנוסף, אנו מראים שאורך השרשרת של סרמיד בקרום הרשת האנדופלזמית הוא קריטי לסלקטיביות מיון זו. המחקר שלנו מספק את הראיות הישירות הראשונות in vivo לסיווג מטעני חלבונים על סמך אורך שרשרת ליפידים לאתרי יצוא סלקטיביים במסלול ההפרשה.
בתאים אאוקריוטיים, החלבונים המסונתזים ברשתית האנדופלזמית (ER) ממוינים לאחר מכן במהלך ההובלה דרך מסלול ההפרשה למסירה ליעד התאי המתאים להם (1). בנוסף למיון בתיווך הציפוי, הועלתה השערה זמן רב כי ליפידים מסוימים יכולים לשמש גם כנקודות יציאה סלקטיביות על ידי קיבוצם בתחומי ממברנה ספציפיים לחלבונים ספציפיים (2-5). עם זאת, עדיין חסרה ראיות ישירות in vivo כדי להוכיח מנגנון אפשרי זה המבוסס על ליפידים. על מנת לפתור בעיה בסיסית זו, חקרנו בשמרים כיצד חלבונים מעוגנים בגליקוזילפוספטידילינוזיטול (GPI) (GPI-APs) מיוצאים באופן דיפרנציאלי מה-ER. GPI-APs הם מגוון של חלבוני שטח תא המחוברים ליפידים (6, 7). GPI-AP הוא חלבון מופרש המחובר לעלים החיצוניים של קרום הפלזמה דרך חלק הגליקוליפיד (עוגן GPI). הם מקבלים עוגני GPI כשינויים שמרניים לאחר התרגום בלומן ה-ER (8). לאחר ההיצמדות, GPI-AP עובר דרך מנגנון גולג'י (5, 9) מה-ER לקרום הפלזמה. נוכחותם של עוגני GPI גורמת ל-GPI-AP להיות מועבר בנפרד מחלבונים מופרשים טרנסממברנליים (כולל חלבוני קרום פלזמה אחרים) לאורך מסלול ההפרשה (5, 9, 10). בתאי שמרים, GPI-APs מופרדים מחלבונים מופרשים אחרים ברשתית האנדופלסמית, ולאחר מכן נארזים לתוך שלפוחיות ייחודיות עטופות בקומפלקס חלבון ציפוי II (COPII) (6, 7). הגורמים הקובעים את תהליך הסיווג הזה בתהליך ייצוא ה-ER אינם ברורים, אך משערים שמנגנון זה עשוי לדרוש ליפידים, במיוחד את העיצוב המבני של החלק הליפידי של עוגן ה-GPI (5, 8). בשמרים, עיצוב מחדש של ליפידים ב-GPI מתחיל מיד לאחר היצמדות של GPI, ובמקרים רבים, הוא גורם לסרמיד להיקשר לחומצת שומן רוויה ארוכת שרשרת בת 26 פחמנים (C26:0) (11, 12). סרמיד C26 הוא הסרמיד העיקרי המיוצר עד כה על ידי תאי שמרים. הוא מסונתז בחדר הרחם (ER) ורובו מיוצא למנגנון גולג'י דרך שלפוחיות COPII (13). ייצוא GPI-AP ל-ER דורש באופן ספציפי סינתזה מתמשכת של סרמיד (14, 15), ובתורו, המרת הסרמיד לסרמיד אינוזיטול פוספט (IPC) במנגנון גולג'י תלויה בסינתזת עוגן GPI (16). מחקרים ביופיזיקליים עם ממברנות מלאכותיות הראו שסרמידים בעלי שרשרת אציל ארוכה מאוד יכולים להתלכד וליצור דומיינים מסודרים בעלי תכונות פיזיקליות ייחודיות (17, 18). נתונים אלה מובילים להשערה שסרמיד C26 ו-GPI-AP עם סרמיד C26 משתמשים בתכונות הפיזיקליות שלהם כדי להתלכד לאזורים או אזורים מסודרים בסביבת השומנים יחסית מבולגנת של קרום ה-ER. הוא מורכב בעיקר מגליצרוליפידים קצרים ולא רוויים (C16:1 ו-C18:1) (19, 20). אזורים אלה יתמקדו באופן סלקטיבי באתרי יציאה ספציפיים של ER (ERES), שבהם ניתן יהיה להעביר יחד סרמיד ו-GPI-AP מבוסס סרמיד לגולג'י באותה שלפוחית ​​COPII ייעודית (5).
במחקר זה, בדקנו ישירות מנגנון מבוסס ליפידים זה באמצעות מיקרוסקופיית הדמיה בזמן אמת קונפוקלית ברזולוציה גבוהה (SCLIM), שהיא טכניקת מיקרוסקופיה חדשנית שיכולה לצפות בו זמנית בחלבונים המסומנים בפלואורסצנט. לתמונות תלת-צבעיות ותלת-ממדיות (3D) יש רזולוציה ומהירות גבוהות במיוחד בתאים חיים (21, 22).
תחילה יישמנו את טכנולוגיית SCLIM כדי להגדיר עוד יותר כיצד GPI-AP רגיל עם קבוצת סרמיד C26 נבדק מחלבונים מופרשים טרנסממברנליים לאחר עזיבת ה-ER ב-S. cerevisiae. על מנת לבדוק את הסיווג של ER, השתמשנו במערכת גנטית שיכולה לדמיין ישירות מטען מסונתז חדש הנכנס ל-ER in vivo (7, 23). כמטען, בחרנו ב-GPI-AP Gas1 מבוסס סרמיד C26 המסומן בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ובחלבון מופרש טרנסממברנליים Mid2 המסומן בחלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום קרוב (iRFP), שניהם מכוונים לממברנת הפלזמה (24-26). במוטציה הרגישה לטמפרטורה sec31-1, שני מטענים אלה באים לידי ביטוי תחת פרומוטר המושרה על ידי גלקטוז וסמן ERES מכונן. בטמפרטורה קיצונית (37°C), מכיוון שהמוטציה sec31-1 משפיעה על תפקוד רכיב הציפוי של COPII Sec31 כדי לעכב נביטת COPII וייצוא ER, מטען מסונתז חדש מצטבר ב-ER (23). לאחר קירור לטמפרטורה נמוכה (24°C), תאי המוטציה sec31-1 התאוששו מאזור ההפרשה, והמטען הסינתטי החדש שהצטבר החל להיות מיוצא מחדר ה-ER. הדמיית CLIM הראתה שרוב חלבוני Gas1-GFP ו-Mid2-iRFP המסונתזים החדשים עדיין הצטברו בחדר ה-ER של תאי המוטציה sec31-1 לאחר דגירה ב-37°C ולאחר מכן שוחררו ב-24°C למשך 5 דקות (איור 1). מכיוון שמיד2-iRFP מפוזר על פני כל קרום ה-ER, ו-Gas1-GFP מרוכז ונאסף באזור קרום ה-ER הלא רציף, פיזורם שונה לחלוטין (איור 1, A עד C וסרט S1). בנוסף, כפי שמוצג באיור 1D, לאשכול Gas1-GFP אין Mid2-iRFP. תוצאות אלו מצביעות על כך שחלבוני GPI-AP וחלבונים טרנסממברנליים הופרדו לאזורים שונים בממברנת ה-ER מוקדם. אשכול Gas1-GFP צמוד ל-ERES ספציפי המסומן בחלבון המעטפת COPII של mCherry, Sec13 (איור 1, E ו-F, וסרט S1) (23).
תאי sec31-1 מבטאים הפרשות המושרות על ידי גלקטוז, סרמיד בעל שרשרת אציל ארוכה (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ירוק) וחלבון טרנסממברנלי Mid2-iRFP (TMP, כחול). תיוג ERES בונה זה Sec13-mCherry (ERES, מג'נטה) הודגר ב-37°C למשך 30 דקות, הועבר ל-24°C, וצולם על ידי SCLIM 5 דקות לאחר מכן. (A עד C) מציג תמונה מייצגת ממוזגת או דו-ממדית בודדת של מישור (A), תמונת הקרנה דו-ממדית של 10 חתכי z (B) או תמונת חצי כדור תא תלת-ממדית של מטען וסמני ERES (C). סרגל קנה מידה 1 מיקרומטר (A ו-B). יחידת קנה המידה היא 0.551 מיקרומטר (C). Gas1-GFP זוהה באזורי ER נפרדים או באשכולות, בעוד Mid2-iRFP זוהה ופוזר ברחבי קרום ה-ER (C). (ד) הגרף מציג את עוצמת הפלואורסצנציה היחסית של Gas1-GFP ו-Mid2-iRFP באשכול Gas1-GFP לאורך קו החץ הלבן (שמאל). AU, יחידה שרירותית. (E ו-F) מייצגים את התמונה התלת-ממדית המשלבת את הסימון של הסחורה ו-ERES. אשכולות Gas1-GFP זוהו ליד ה-ERES הספציפי. יחידת קנה המידה היא 0.551 מיקרומטר. (F) החץ הלבן המלא מסמן את אשכול Gas1-GFP המשויך ל-ERES. הפאנלים האמצעיים והימניים מציגים את התמונה התלת-ממדית המוגדלת והממוזגת ותצוגה מסובבת של אשכול Gas1-GFP שנבחר.
הקשר המרחבי ההדוק בין אשכול Gas1-GFP לבין ERES ספציפי מצביע על כך ש-Gas1-GFP יכול להיכנס ל-ERES סלקטיבי, דבר השונה מהסלקטיביות בה משתמש Mid2-iRFP כדי לצאת מה-ER. כדי להתמודד עם אפשרות זו, כימתנו את יחס ה-ERES עבור סחורה אחת או שתיים בלבד (איור 2, A עד C). מצאנו שרוב ה-ERES (70%) מכילים רק סוג אחד של מטען. התמונה התחתונה של איור 2C מציגה שתי דוגמאות אופייניות ל-ERES עם Gas1-GFP בלבד (איור 1) או Mid2-iRFP בלבד (איור 2). לעומת זאת, כ-20% מה-ERES מכילים שני מטענים חופפים באותו אזור. נמצא שחלק מה-ERES (10%) הכילו שני סוגי מטען, אך הם בודדו באזורים שונים בבירור. לכן, ניתוח סטטיסטי זה מראה שלאחר ייצוא ה-ER, GPI-AP Gas1-GFP ומטען הטרנסממברנלי Mid2-iRFP מחולקים ל-ERES שונים (איור 2D). יעילות מיון זו עולה בקנה אחד עם הניתוח הביוכימי (6) והקביעה המורפולוגית (7) הקודמים. אנו יכולים גם לצפות בהתנהגות המטען בהסגר הנכנס ל-ERES (איור 2E וסרט S2). איור 2E מראה שרק חלק קטן מ-Gas1-GFP (פאנל 3) או Mid2-iRFP (פאנל 4) נכנס ל-ERES מצד אחד ומוגבל באזור נפרד. פאנל 5 של איור 2E מראה ש-Gas1-GFP ו-Mid2-iRFP נמצאים לעיתים באותו ERES, אך הם נכנסים מצדדים שונים ומרוכזים באזורים נפרדים שעשויים לייצג שלפוחיות COPII שונות. כמו כן, אישרנו שההפרדה והסיווג שנצפתה של GPI-AP Gas1 מבוסס סרמיד C26 כ-ERES סלקטיבי הם ספציפיים מכיוון שמטען הפרשה טרנסממברנלי נוסף, חלבון קרום הפלזמה המסומן ב-GFP Axl2 (27), מראה התנהגות דומה ל-Mid2-iRFP. (תמונה S1 וסרט S3). ה-Axl2-GFP המסונתז החדש מופץ דרך קרום ה-ER כמו Mid2-iRFP (איור S1, A ו-B), והוא מקובל יחד עם Mid2-iRFP ברוב תאי ה-ERE (איור S1, B עד D). פאנלים 1 ו-2 של איור 1. S1C מציגים שתי דוגמאות אופייניות ל-ERES בהן שני מטענים טרנס-ממברנליים חופפים. במקרים אלה, שני הסחורות נכנסות ל-ERES יחד (איור S1E, פאנל 3 וסרט S3).
תאי sec31-1 המבטאים הפרשות המושרות על ידי גלקטוז, Gas1-GFP (GPI-AP, ירוק) ו-Mid2-iRFP (TMP, כחול) ותווית ERES קונסטיטוטיבית Sec13-mCherry (ERES, מג'נטה) הונחו ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה של 30 דקות ב-°C, הועבר ל-24 מעלות צלזיוס כדי לשחרר את בלוק ההפרשה, וצלם באמצעות SCLIM לאחר 20 דקות. (A עד C) תמונות הקרנה דו-ממדיות מייצגות (A; סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר) או תמונות תלת-ממדיות של חצי הכדור של התא (B ו-C; יחידת קנה מידה, 0.456 מיקרומטר) של המטען ו-10 חתכי z המסומנים ב-ERES. הפאנל התחתון ב-(B) והפאנל ב-(C) מציגים תמונות מעובדות כדי להציג רק את הסחורה הקיימת ב-ERES (מג'נטה) [Gas1-GFP (אפור) ו-Mid2-iRFP (כחול בהיר)]. (C) חץ פתוח: ERES נושא רק מטען אחד (1 עד 4). חץ אפור: ERES מכיל מטען מופרד (5). חץ לבן רציף: ERES המכיל מטען הממוקם יחד. למטה: ה-ERES היחיד שנבחר מכיל רק Gas1-GFP (1) או Mid2-iRFP (2). סרגל קנה מידה, 100 ננומטר. (ד) כימות הפוטומיקרוגרף המתואר ב-(ג). האחוז הממוצע של ERES המכיל רק מטען אחד (Gas1-GFP או Mid2-iRFP), מטען מופרד ומטען חופף. בשלושה ניסויים בלתי תלויים, n=432 ב-54 תאים. סרגל שגיאה = סטיית תקן. מבחן t דו-צדדי לא מזווג. *** P = 0.0002. (ה) תמונה תלת-ממדית של ERES נבחר של מטען בהסגר המסומן ב-(ג). Gas1-GFP (ירוק) (3) או Mid2-iRFP (כחול) (4) נכנסים ל-ERES (מג'נטה) מצד אחד ומוגבלים לאזור קטן בתוך ERES. לפעמים, שני סוגי המטען נכנסים לאותו ERES (5) מאותו צד ומוגבלים לאזור מבודד בתוך ה-ERES. סרגל קנה מידה, 100 ננומטר.
לאחר מכן, בדקנו השערה לפיה הסרמיד בעל שרשרת אציל ארוכה (C26) הקיים בקרום ה-ER מניע את האשכול והמיון הספציפיים של Gas1 לתוך ERES סלקטיבי. לשם כך, השתמשנו בזן שמרים שעבר שינוי בשם GhLag1, שבו שני סינתאזות הסרמיד האנדוגניות Lag1 ו-Lac1 הוחלפו על ידי GhLag1 (ההומולוג של Lag1 של כותנה), וכתוצאה מכך נוצר זן שמרים עם זן סרמיד בקרום התא קצר יותר מהזן הפראי (איור 3A) (28). ניתוח ספקטרומטריית מסות (MS) הראה שבזנים מהזן הפראי, 95% מכלל הסרמיד הוא סרמיד בעל שרשרת ארוכה מאוד (C26), בעוד שב-GhLag1, 85% מהסרמיד הוא ארוך מאוד (C18 ו-C16), רק 2% מהסרמיד הוא סרמיד בעל שרשרת ארוכה מאוד (C26). למרות שסרמידים C18 ו-C16 הם הסרמידים העיקריים שזוהו עד כה בקרום GhLag1, ניתוח MS אישר גם שעוגן ה-GPI של Gas1-GFP המתבטא בזן GhLag1 מכיל סרמיד C26, הדומה לליפידים מסוג בר. האיכות זהה (איור 3A) (26). לכן, משמעות הדבר היא שאנזים שיפוץ הסרמיד Cwh43 הוא סלקטיבי ביותר לסרמיד C26, כפי שמוצג באיור 26, והוא משלב באופן מועדף את עוגן ה-GPI מכמות קטנה של סרמיד C26 בזן GhLag1. S2 (29). אף על פי כן, קרום התא של GhLag1 מכיל בעיקרו רק סרמיד C18-C16, בעוד ש-Gas1-GFP עדיין מכיל סרמיד C26. עובדה זו הופכת זן זה לכלי אידיאלי לפתרון ספציפי של בעיית אורך שרשרת האציל של סרמיד בממברנה בחדר ה-ER. התפקיד ההיפותטי של מחלקה ומיון. לאחר מכן, חקרנו תחילה את יכולתו של C26 Gas1-GFP להצטבר באשכולות ב-GhLag1 עם אלל מוטנטי רגיש לטמפרטורה של sec31-1 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי, שבו רק השרשרת הארוכה (C18-C16) קיימת בקרום ה-ER Ceramide (איור 3). צפינו שב-sec31-1, רוב Gas1-GFP היה מרוכז באשכולות, בעוד ש-Gas1-GFP ב-sec31-1 GhLag1 עם קרום ה-ER הסרמיד הארוך (C18-C16) לא היה מקובץ ומפוזר בעיקר בכל קרום ה-ER. ליתר דיוק, מכיוון שצבר מבוסס סרמיד C26 קשור קשר הדוק ל-ERES ספציפי (איור 1), חקרנו לאחר מכן האם תהליך זה עשוי לכלול גם את תפקודו של מנגנון חלבון הייצוא של ER. GPI-AP משתמש במערכת COPII מיוחדת לייצוא ER, המווסתת באופן פעיל על ידי עיצוב מחדש מבני של Ted1 של חלק הגליקן של עוגן GPI (30, 31). לאחר מכן, GPI-גליקן הרקומביננטי מזוהה על ידי קומפלקס קולטן המטען הטרנסממברני p24, אשר בתורו מגייס באופן סלקטיבי את Lst1, שהוא איזופורם ספציפי של תת-היחידה העיקרית לקישור מטען של COPII, Sec24, ויוצר שלפוחיות COPII עשירות ב-GPI-AP (31-33). לכן, בנינו מוטציה כפולה ששילבה את המחיקה של חלבונים בודדים אלה (רכיב קומפלקס p24 Emp24, אנזים שיפוץ GPI-גליקן Ted1 ותת-היחידה הספציפית של COPII Lst1) עם זן המוטציה sec31-1, וחקרנו אותם. האם ניתן ליצור GFP של אשכול Gas1 (איור 3). צפינו שב-sec31-1emp24Δ וב-sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP אינו מקובץ ומפוזר בעיקר ברחבי קרום ה-ER, כפי שנראה בעבר ב-sec31-1 GhLag1, בעוד שב-sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP דומה ל-sec31-1. תוצאות אלו מצביעות על כך שבנוסף לנוכחותו של סרמיד C26 בקרום ה-ER, קיבוץ Gas1-GFP צריך גם להיקשר לקומפלקס p24, ואינו דורש גיוס ספציפי של Lst1. לאחר מכן, חקרנו את האפשרות שאורך שרשרת הסרמיד בקרום ה-ER יכול לווסת את הקישור של Gas1-GFP ל-p24. עם זאת, מצאנו שנוכחות סרמיד C18-C16 בקרום אינה משפיעה על גליקני GPI ששוחזרו על ידי קומפלקס p24 (איורים S3 ו-S4, A ו-B) או על הקישור ל-GPI-AP ויכולת ייצוא GPI-AP. גיוס תת-סוג COPII Lst1 (איור S4C). לכן, קיבוץ תלוי-סרמיד C26 אינו דורש אינטראקציות חלבון עם מנגנוני ייצוא חלבון ER שונים, אלא תומך במנגנון מיון חלופי המונע על ידי אורך ליפיד. לאחר מכן, ניתחנו האם אורך שרשרת האציל של הסרמיד בקרום ה-ER חשוב לסיווג יעיל של Gas1-GFP כ-ERES סלקטיבי. מאחר ש-Gas1 בזן GhLag1 עם סרמיד קצר שרשרת עוזב את חדר ה-ER ונכנס לממברנת הפלזמה (איור S5), אנו מאמינים שאם המיון מונע על ידי אורך שרשרת האציל של הסרמיד, ניתן יהיה להפנות את Gas1 בזן GhLag1 ולחצות אותו. מוצרים מסוג ERES עם אותה ממברנה.
(א) קרום התא של GhLag1 מכיל בעיקר סרמידים קצרים יותר מסוג C18-C16, בעוד שעוגן ה-GPI של Gas1-GFP עדיין מכיל את אותו C26 IPC כמו תאי הבר. למעלה: ניתוח אורך שרשרת האציל של סרמיד בקרום התא של זני הבר (Wt) ו-GhLag1p באמצעות ספקטרומטריית מסות (MS). הנתונים מייצגים את אחוז הסרמיד הכולל. ממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים. סרגל שגיאה = סטיית תקן. מבחן t דו-צדדי לא מזווג. **** P <0.0001. פאנל תחתון: ניתוח MS של אורך שרשרת האציל של ה-IPC הקיים בעוגן GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) המתבטא בזני הבר ו-GhLag1p. הנתונים מייצגים את אחוז אות ה-IPC הכולל. ממוצע של חמישה ניסויים בלתי תלויים. סרגל שגיאה = סטיית תקן. מבחן t דו-צדדי לא מזווג. ns, לא חשוב. P = 0.9134. (ב) מיקרוסקופיות פלואורסצנציה של תאי sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ו-sec31-1lst1Δ המבטאים Gas1-GFP המושרה על ידי גלקטוז הודגרו ב-37°C למשך 30 דקות והועברו למטה ל-. בצעו מיקרוסקופ פלואורסצנציה שגרתי לאחר 24°C. חץ לבן: אשכול Gas1-GFP של ER. חץ פתוח: Gas1-GFP לא מקובץ מפוזר על פני כל קרום ה-ER, ומראה את צביעת הטבעת הגרעינית האופיינית ל-ER. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. (ג) כימות הפוטומיקרוגרף המתואר ב-(ב). האחוז הממוצע של תאים עם מבנה Gas1-GFP נקודתי. בשלושה ניסויים בלתי תלויים, n≥300 תאים. סרגל שגיאה = סטיית תקן. מבחן t דו-צדדי לא מזווג. **** P <0.0001.
כדי לפתור בעיה זו ישירות, ביצענו הדמיה SCLIM של Gas1-GFP ו-Mid2-iRFP ב-GhLag1 עם האלל המוטנטי הרגיש לטמפרטורה sec31-1 (איור 4 וסרט S4). לאחר שה-ER נשמר ב-37°C ולאחר מכן שוחרר ב-24°C, רוב ה-Gas1-GFP המסונתז החדש לא הצטבר ופוזר ברחבי קרום ה-ER, כפי שנצפה על ידי מיקרוסקופים קונבנציונליים (איור 4, A ו-B). בנוסף, אחוז גדול של ERES (67%) כולל שני סוגי מטען הממוקמים בו יחד (איור 4D). פאנלים 1 ו-2 של איור 4C מראים שתי דוגמאות אופייניות ל-ERES עם חפיפה של Gas1-GFP ו-Mid2-GFP. בנוסף, שני הסחורות גויסו לאותו ERES (איור 4E, פאנל 3 וסרט S4). לכן, התוצאות שלנו מצביעות על כך שאורך שרשרת האציל הסרמיד בקרום ה-ER הוא גורם חשוב באגרגציה ובסיווג חלבוני ה-ER.
תאי Sec31-1 GhLag1 המבטאים הפרשות המושרות על ידי גלקטוז, Gas1-GFP (GPI-AP, ירוק) ו-Mid2-iRFP (TMP, כחול) ו-Sec13-mCherry (ERES, מג'נטה) המסומן ב-ERES קונסטיטוטיבי. דגירה ב-37°C. המשך למשך 30 דקות, הורדה ל-24°C כדי לשחרר הפרשות, וצלם באמצעות SCLIM לאחר 20 דקות. (A עד C) תמונות הקרנה דו-ממדיות מייצגות (A; סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר) או תמונות תלת-ממדיות של המיספרות התאיות (B ו-C; יחידת קנה מידה, 0.45 מיקרומטר) של 10 חתכי z המסומנים במטען ו-ERES. הפאנל התחתון ב-(B) והפאנל ב-(C) מציגים תמונות מעובדות כדי להציג רק את הסחורה הקיימת ב-ERES (מג'נטה) [Gas1-GFP (אפור) ו-Mid2-iRFP (כחול בהיר)]. (C) חץ מלא לבן: ERES, סחורות חופפות. חץ פתוח: ERES מכיל פריט אחד בלבד. פאנל תחתון: ל-ERES שנבחר יש סחורות חופפות (1 ו-2) המסומנות ב-(C). סרגל קנה מידה, 100 ננומטר. (D) כימות הפוטומיקרוגרף המתואר ב-(C). ביחידות GhLag1 sec31-1 ו-sec31-1, נכלל מטען אחד בלבד (Gas1-GFP או Mid2-iRFP), והאחוז הממוצע של ERES עבור מטען מבודד ומטען חופף. בשלושה ניסויים בלתי תלויים, n = 432 ב-54 תאים (sec31-1) ו-n = 430 ב-47 תאים (sec31-1 GhLag1). סרגל שגיאה = סטיית תקן. מבחן t דו-צדדי לא מזווג. *** P = 0.0002 (sec31-1) ו- ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) תמונה תלת-ממדית של ERES שנבחר עם מטען חופף (3) המסומנות ב-(C). Gas1-GFP (ירוק) ו-Mid2-iRFP (כחול) מתקרבים ל-ERES (מג'נטה) מאותו צד ונשארים באותו אזור מוגבל של ERES. סרגל קנה מידה, 100 ננומטר.
מחקר זה מספק ראיות ישירות in vivo לכך שמטענים של חלבונים מבוססי ליפידים מסווגים לאתרי ייצוא סלקטיביים במסלול ההפרשה, וחושף את החשיבות של אורך שרשרת האציל לסלקטיביות סיווג. באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה עוצמתית וחדשנית הנקראת SCLIM, הדגמנו את Gas1-GFP המסונתז לאחרונה (GPI-AP עיקרי בממברנת הפלזמה עם חלק ליפידי של סרמיד שרשרת אציל (C26) ארוך מאוד) בשמרים. האזורים המקובצים ב-ERs נפרדים קשורים ל-ERES ספציפי, בעוד שחלבונים מופרשים טרנסממברנליים מפוזרים ברחבי קרום ה-ER (איור 1). בנוסף, שני סוגי סחורות אלה נכנסים ל-ERs שונים באופן סלקטיבי (איור 2). אורך שרשרת האציל של הסרמיד התאי בממברנה מצטמצם מ-C26 ל-C18-C16, אשכול Gas1-GFP מופרע לאזור ה-ER הנפרד, ו-Gas1-GFP מנותב מחדש כדי לעזוב את ה-ER עם החלבון הטרנסממברנליים דרך אותו ERES (איור 3 ואיור 3).
למרות ש-GPI-AP משתמש במנגנון חלבון מיוחד כדי לצאת מ-ER, מצאנו שהפרדה תלוית-סרמיד C26 אינה מסתמכת על אינטראקציות חלבון דיפרנציאליות שעשויות להוביל להתמחות ב-ERES (איורים S4 ו-S5). במקום זאת, הממצאים שלנו תומכים במנגנון סיווג חלופי המונע על ידי קיבוץ חלבונים מבוססי ליפידים ולאחר מכן הדרה של מטענים אחרים. התצפיות שלנו מצביעות על כך שאזור או אשכול Gas1-GFP הקשורים ל-ERES ספציפי חסר את החלבון המופרש הטרנסממברני Mid2-iRFP, דבר המצביע על כך שאשכול GPI-AP התלוי בסרמיד C26 יקל על כניסתם ל-ERES הרלוונטי, ובמקביל, יוציא הפרשות טרנסממברניות מהן נכנסות ל-ERES הספציפי הזה (איורים 1 ו-2). לעומת זאת, נוכחותם של סרמידים C18-C16 בקרום ה-ER אינה גורמת ל-GPI-AP ליצור אזורים או אשכולות, ולכן הם אינם שוללים או מחליפים חלבונים מופרשים טרנסממברניים באותו ERES (איורים 3 ו-4). לכן אנו מציעים שסרמיד C26 מניע הפרדה וסיווג על ידי הקלת אשכולות של חלבונים המקושרים ל-ERES ספציפי.
כיצד להשיג אשכול תלוי-סרמיד C26 זה באזור ER ספציפי? הנטייה של סרמיד ממברנלי להיפרד לרוחב עלולה לגרום ל-GPI-AP ולסרמיד C26 ליצור ליפידים קטנים ומסודרים באופן מיידי בסביבה ליפידית לא סדירה יותר של קרום ה-ER המכילה גליצרוליפידים קצרים ובלתי רוויים. אשכולות איכותיים (17, 18). אשכולות זמניים קטנים אלה יכולים להתמזג עוד יותר לאשכולות גדולים ויציבים יותר לאחר קשירה לקומפלקס p24 (34). בהתאם לכך, הראינו ש-C26 Gas1-GFP צריך לקיים אינטראקציה עם קומפלקס p24 כדי ליצור אשכולות גלויים גדולים יותר (איור 3). קומפלקס p24 הוא אוליגומר הטרוזיגוטי המורכב מארבעה חלבוני p24 טרנסממברנליים שונים בשמרים (35), המספקים קישור רב-ערכי, שיכול להוביל לקישור צולב של אשכולות GPI-AP קטנים, ובכך ליצור אשכול יציב גדול יותר (34). האינטראקציה בין אקטודומיינים חלבוניים של GPI-APs עשויה גם היא לתרום לאגרגציה שלהם, כפי שמוצג במהלך הובלת גולג'י שלהם בתאי אפיתל מקוטבים של יונקים (36). עם זאת, כאשר סרמיד C18-C16 נוכח בקרום ה-ER, כאשר קומפלקס p24 נקשר ל-Gas1-GFP, לא ייווצרו צבירים גדולים ונפרדים. המנגנון הבסיסי עשוי להיות תלוי בתכונות הפיזיקליות והכימיות הספציפיות של הסרמיד בעל שרשרת האציל הארוכה. מחקרים ביופיזיקליים של ממברנות מלאכותיות מראים שלמרות שסרמידים בעלי שרשרת אציל ארוכה (C24) וקצרה (C18-C16) יכולים לגרום להפרדת פאזות, רק סרמידים בעלי שרשרת אציל ארוכה (C24) יכולים לקדם עקמומיות גבוהה וכיפוף שכבה כדי לעצב מחדש את שכבה הצילום. באמצעות התייחסות הדדית (17, 37, 38). הוכח כי הסליל הטרנסממברני של TMED2, ההומולוג האנושי של Emp24, מקיים אינטראקציה סלקטיבית עם ספינגומיאלין מבוסס סרמיד C18 באונות הציטופלזמיות (39). באמצעות סימולציות דינמיקה מולקולרית (MD), מצאנו כי גם סרמידים C18 וגם C26 מצטברים סביב האונות הציטופלזמיות של הסליל הטרנסממברני של Emp24, ויש להם העדפות דומות (איור S6). ראוי לציין כי הדבר מצביע על כך שהסליל הטרנסממברני של Emp24 יכול להוביל לפיזור אסימטרי של ליפידים בקרום. זוהי תוצאה עדכנית המבוססת על תאים של יונקים. סימולציות MD דומות מראות גם את נוכחותם של אתר ליפידים (40). לכן, אנו משערים כי סרמיד C26 בשתי האונות של ER26 מועשר באופן מקומי. כאשר GPI-AP באונות הלומיניות נקשר ישירות ל-p24 רב-ערכי ולהצטברות של סרמיד C26 סביב p24 באונות הציטופלזמיות, הוא יכול לקדם את הצטברות החלבונים הנלווית ויצירת עקמומיות הממברנה דרך האצבעות (41), מה שגורם להיפרדות של GPI-AP לאזורים נפרדים הסמוכים ל-ERES, מה שמעדיף גם את האזורים המעוקלים מאוד של קרום ה-ER (42). דיווחים קודמים תמכו במנגנון המוצע (43, 44). הקישור הרב-ערכי של אוליגולקטינים, פתוגנים או נוגדנים לגליקוספינגוליפידים (GSL) מבוססי סרמיד על קרום הפלזמה מפעיל צבירה גדולה של GSL, משפרת את הפרדת הפאזה וגורמת לעיוות והפנמה של הממברנה (44). איוואבוצ'י וכו' (43) נמצא כי בנוכחות שרשראות אציל ארוכות (C24) אך לא קצרות (C16), הליגנד הרב-ערכי הקשור ללקטוזילצרמיד GSL גרם להיווצרות צברים גדולים ופלישה לממברנה, והתמרת אותות בתיווך Lyn בציטופלזמה על העלעלים משולבת על ידי שרשראות אציל בנויטרופילים מצומדים.
בתאי אפיתל מקוטבים של יונקים, ריכוז רשת האנטי-גולג'י (TGN) עד לרמת קרום הפלזמה האפיקלי שולט בהפרדה ובמיון של GPI-AP (10, 45). צבירה זו מונעת על ידי אוליגומריזציה של GPI-AP (36), אך היא עשויה להיות תלויה גם באורך שרשרת הסרמיד שאנו מוצאים בשמרים. למרות של-GPI-AP של יונקים יש עוגן מבוסס אתר ליפידים, והמבנה הכימי שלו שונה מאוד מהסרמיד בעל שרשרת האציל הארוכה מאוד, מחקר שנערך לאחרונה מצא שלשני הליפידים יש תכונות פיזיקליות וכימיות ותפקוד דומים מבחינה אבולוציונית (40). לכן, חלק הליפיד האתרי בתאי יונקים עשוי להיות דומה לסרמיד C26 בשמרים, ותפקידו הוא להיקשר לסרמיד ארוך השרשרת בקרום כדי לקדם צבירה ומיון של GPI-AP. למרות שעדיין יש לבדוק אפשרות זו ישירות, ממצאים קודמים תומכים בכך שהובלת הסרמיד בעל שרשרת האציל הארוכה לגוף גולג'י אינה מתבצעת על ידי חלבוני העברה ציטופלזמיים, אלא תלויה בסינתזה של עוגני GPI כמו בשמרים. לכן, נראה כי המנגנון השמרני האבולוציוני מסוגל להעביר באופן סלקטיבי סרמיד בעל שרשרת אציל ארוכה מאוד ו-GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) יחד באותה שלפוחית ​​הובלה.
במערכות תאי אפיתל מקוטבים של שמרים ויונקים, צבירה והפרדה של GPI-AP מחלבוני קרום פלזמה אחרים מתרחשות כולן לפני שהן מגיעות לפני השטח של התא. פאלאדינו ועמיתיו (48) מצאו שב-TGN של תאי אפיתל מקוטבים של יונקים, אשכול GPI-AP אינו הכרחי רק לסיווג סלקטיבי של GPI-APs לקרום הפלזמה האפיקלי, אלא גם מווסת את ארגון האשכולות של GPI-APs ואת הפעילות הביולוגית שלהם. פני התא. בשמרים, מחקר זה הראה כי אשכול GPI-AP התלוי בסרמיד C26 ב-ER יכול לווסת את ארגון האשכולות והפעילות התפקודית של GPI-AP על קרום הפלזמה (24, 49). בהתאם למודל זה, תאי GhLag1 אלרגיים למעכבי GPI או לתרופות המשפיעות על שלמות דופן התא (28), והצורך באשכולות Gas1-GFP פונקציונליים (49) של קצה הסרמיד המוקרן בהזדווגות של תאי שמרים מצביע על השלכות פיזיולוגיות אפשריות של תאי hLag1. שגיאת GPI-AP. עם זאת, בדיקות נוספות האם הארגון התפקודי של פני התא תוכנת מה-ER על ידי שיטת מיון המבוססת על אורך שומנים יהיו נושא המחקר העתידי שלנו.
זני Saccharomyces cerevisiae ששימשו בעבודה זו מפורטים בטבלה S1. זני MMY1583 ו-MMY1635 של SCLIM להדמיית תאים חיים נבנו ברקע של W303. זנים אלה המבטאים Sec13-mCherry עם תג חלבון פלואורסצנטי נבנו באמצעות שיטה מבוססת תגובת שרשרת פולימראז (PCR) עם פלסמיד pFA6a כתבנית (23). הזן המבטא Mid2-iRFP המסומן בחלבון פלואורסצנטי תחת שליטה של ​​​​המקדם GAL1 נבנה באופן הבא. הגברת PCR של רצף iRFP-KanMx מוקטור pKTiRFP-KAN (מתנה של E. O'Shea, פלסמיד Addgene מספר 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; מזהה משאבי מחקר (RRID): Addgene_64687) והוכנסו לקצה C של Mid2 אנדוגני. לאחר שרצף הגנום Mid2-iRFP הוגבר ושובט לתוך פרומוטר GAL1, הוא שולב באתר Not I-Sac I של פלסמיד האינטגרציה pRS306. הפלסמיד pRGS7 שנוצר עבר לינאריזציה עם Pst I כדי להשתלב בלוקוס URA3.
גן האיחוי Gas1-GFP מתבטא תחת בקרת הפרומוטר GAL1 בפלסמיד הצנטרומר (CEN), אשר בנוי כדלקמן. רצף Gas1-GFP הוגבר על ידי PCR מפלסמיד pRS416-GAS1-GFP (24) (מתנה של L. Popolo) ושובט לאתר Xma I–Xho I של פלסמיד CEN pBEVY-GL LEU2 (מתנה של C). Miller; פלסמיד Addgene מספר 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). הפלסמיד שנוצר נקרא pRGS6. גן האיחוי Axl2-GFP מתבטא גם הוא תחת בקרת הפרומוטר GAL1 של וקטור pBEVY-GL LEU2, ובנייתו היא כדלקמן. רצף Axl2-GFP הוגבר מפלסמיד pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) על ידי PCR, ושובט לאתר Bam HI-Pst I של וקטור pBEVY-GL LEU2. הפלסמיד שנוצר נקרא pRGS12. רצף האוליגונוקלאוטידים ששימשו במחקר זה מופיע בטבלה S2.
הזן תווסף ב-0.2% אדנין ו-2% גלוקוז [YP-דקסטרוז (YPD)], 2% מצע חלבון p (YP) עשיר ברפינוז [YP-raffinose] של תמצית שמרים עשירה ברפינוז (1% תמצית שמרים ו-2% חלבון ept). (YPR)] או 2% גלקטוז [YP-גלקטוז (YPG)] כמקור פחמן, או במצע מינימלי סינתטי (0.15% בסיס חנקן שמרים ו-0.5% אמוניום סולפט) כהשלמה לחומצות אמינו ובסיסים מתאימים הנדרשים לתזונה, והכיל 2% גלוקוז (מצע מינימלי גלוקוז סינתטי) או 2% גלקטוז (מצע מינימלי גלקטוז סינתטי) כמקור פחמן.
לצורך הדמיה בזמן אמת, תאי מוטציה sec31-1 רגישים לטמפרטורה המבטאים את המבנה תחת פרומוטר GAL1 גודלו במדיום YPR בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס למשך הלילה עד לשלב הלוגריתמי האמצעי. לאחר אינדוקציה ב-YPG בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס למשך שעה, התאים הודגרו ב-SG בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן הועברו לטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס לשחרור מגוש ההפרשה. קונקאנאוולין A שימש לקיבוע התאים על גבי זכוכית וצולם באמצעות SCLIM. SCLIM הוא שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מדגם Olympus IX-71 ועדשת שמן בצמצם מספרי UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), סורק קונפוקלי דיסק מסתובב במהירות גבוהה ובעל יחס אות לרעש גבוה (Yokogawa Electric), ספקטרומטר מותאם אישית וקירור מותאם אישית. מגבר התמונה של המערכת (Hamamatsu Photonics) יכול לספק מערכת עדשות מגדילות עם הגדלה סופית של ×266.7 ומצלמת התקן מצומדת מטען המכפילה אלקטרונים (Hamamatsu Photonics) (21). רכישת התמונה מתבצעת על ידי תוכנה מותאמת אישית (Yokogawa Electric). עבור תמונות תלת-ממדיות, השתמשנו במפעיל פיזואלקטרי מותאם אישית כדי לרטוט את עדשת האובייקטיב אנכית, ואספנו את החלקים האופטיים במרחק של 100 ננומטר זה מזה בערימה. תמונת מחסנית ה-Z מומרת לנתוני ווקסל תלת-ממדיים, ופונקציית פיזור הנקודות התיאורטית המשמשת עבור מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב משמשת לעיבוד פירוק על ידי תוכנת Volocity (PerkinElmer). באמצעות תוכנת Volocity לקביעת סף אוטומטית לניתוח קו-לוקציה, נמדדה ERES כולל מטען. ניתוח סריקת קווי בוצע באמצעות תוכנת MetaMorph (Molecular Devices).
השתמשו בתוכנת GraphPad Prism כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית. עבור מבחן t דו-צדדי של סטודנט ומבחן ניתוח שונות חד-כיווני רגיל (ANOVA), הבדלים בין הקבוצות נחשבים כבעלי השפעה מובהקת על P <0.05 (*).
עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של Gas1-GFP, תאי פאזה לוגריתמיים גודלו למשך הלילה ב-YPD ונאספו באמצעות צנטריפוגה, נשטפו פעמיים בתמיסת מלח עם בופר פוספט, והודגרו על קרח למשך 15 דקות לפחות, ולאחר מכן המשיכו תחת המיקרוסקופ כפי שתואר קודם לכן בבדיקה (24). לצורך הרכישה נעשה שימוש במיקרוסקופ Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) המצויד בעדשת אובייקטיבית, מסנן L5 (GFP), מצלמת Hamamatsu ותוכנת Application Suite X (LAS X).
הדגימות עברו דנטורציה באמצעות בופר דגימה SDS ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן הופרדו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל SDS-polyacrylamide (PAGE). לצורך ניתוח אימונובלוטינג, נטענו 10 מיקרוליטר של דגימה לכל נתיב. נוגדן ראשוני: השתמשו בנוגדן פוליקלונאלי ארנבת אנטי-Gas1 בדילול של 1:3000, בנוגדן פוליקלונאלי ארנבת אנטי-Emp24 בדילול של 1:500, ובנוגדן פוליקלונאלי ארנבת אנטי-GFP (מתנה מה. ריזמן) בדילול של 1:3000. נעשה שימוש בנוגדן חד-שבטי עכבר אנטי-Pgk1 בדילול של 1:5000 (מתנה מג'. דה לה קרוז). נוגדן משני: נוגדן עז מצומד לחזרת פראוקסידאז (HRP) נגד אימונוגלובולין G (IgG) ארנבת בדילול של 1:3000 (פירס). נעשה שימוש בנוזלי IgG עיזים מצומדים ל-HRP בדילול של 1:3000 (פירס). אזור התגובה החיסונית נצפה בשיטת הכימילומינסנציה של ריאגנט SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
כמתואר ב-(31), בוצע ניסוי אימונופרציפיטציה טבעית על מקטע ה-ER המועשר. בקצרה, שטפו את תאי השמרים עם בופר TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM פנילמתילסולפוניל פלואוריד ותערובת מעכבי פרוטאז) ב-600 ננומטר (OD600) בצפיפות אופטית של 100 פעמיים. הוא נשבר באמצעות חרוזי זכוכית, ולאחר מכן הוסרו שאריות התאים וחרוזי הזכוכית באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן, הנוזל העליון נצנטרפו ב-17,000 גרם למשך 15 דקות ב-4°C. הגלולה הושעתה מחדש ב-TNE ודיגיטליס ספונין נוסף לריכוז סופי של 1%. התרחיף הודגר במשך שעה אחת עם סיבוב ב-4°C, ולאחר מכן הרכיבים הבלתי מסיסים הוסרו באמצעות צנטריפוגה ב-13,000 גרם ב-4°C למשך 60 דקות. עבור אימונופרסיפיטציה באמצעות Gas1-GFP, יש לבצע תחילה דגירה מוקדמת של הדגימה עם חרוזי אגרוז ריקים (ChromoTek) ב-4°C למשך שעה, ולאחר מכן דגירה עם GFP-Trap_A (ChromoTek) ב-4°C למשך 3 שעות. החרוזים שעברו אימונופרסיפיטציה נשטפו חמש פעמים עם TNE המכיל 0.2% דיגוקסיגנין, עברו אלציה עם בופר דגימה SDS, הופרדו ב-SDS-PAGE ונותחו באמצעות אימונובלוטינג.
כמתואר ב-(31), בוצעה קביעת קישור צולב על מקטע ה-ER המועשר. בקצרה, מקטע ה-ER המועשר הודגר עם 0.5 mM דיתיוביס(סוקסינימידיל פרופיונאט) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 דקות). תגובת הקישור צולב דוכאה על ידי הוספת גליצין (ריכוז סופי של 50 mM, 5 דקות, 20°C).
כפי שתואר קודם לכן (50), בוצע ניתוח MS של סרמיד בזני wild-type ו-GhLag1. בקצרה, התאים גודלו לפאזה אקספוננציאלית (3 עד 4 יחידות OD600/מ"ל) ב-YPD ב-30°C, ו-25×107 תאים נאספו. חילוף החומרים שלהם דומם באמצעות חומצה טריכלורואצטית. השתמשו בממס מיצוי [אתנול, מים, אתר, פירידין ו-4.2 N אמוניום הידרוקסיד (15:15:5:1:0.018 v/v)] ו-1.2 ננומול של סרמיד C17 בתקן פנימי (איכות 860517, Avanti polar lipid). השתמשו בריאגנט מונומתילאמין [מתנול, מים, n-בוטנול ותמיסת מתילאמין (4:3:1:5 v/v)] כדי לבצע הידרוליזה אלקלית עדינה של התמצית, ולאחר מכן השתמשו ב-n-בוטנול רווי במים כדי להסיר מלח. לבסוף, התמצית הושעתה מחדש בממס במצב חיובי [כלורופורם/מתנול/מים (2:7:1) + 5 mM אמוניום אצטט] והוזרקה לספקטרומטר המסה. ניטור רב-תגובות (MRM) בוצע לזיהוי וכימות של מולקולות ספינגוליפידים. ספקטרומטר המסה השלישוני קוואדרופולי TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) מצויד במקור יוני ננו-זרימה רובוטי Nanomate HD (Advion Biosciences, איתקה, ניו יורק) לניתוח ליפידים. אנרגיית ההתנגשות ממוטבת עבור כל קטגוריית סרמיד. נתוני MS התקבלו במצב חיובי. עבור כל שכפול ביולוגי, אות הליפיד הוא החציון של שלוש מדידות בלתי תלויות.
כפי שתואר ב-(31), התאים (800×107) המבטאים את Gas1-GFP עברו אימונופרציפיטציה טבעית. ה-Gas1-GFP המטוהר הופרד באמצעות SDS-PAGE והועבר לממברנת פוליווינילידן פלואוריד (PVDF). החלבון הוצג על ידי צביעת PVDF בשחור אמיד. רצועת Gas1-GFP נחתכה מה-PVDF ונשטפה 5 פעמים עם מתנול ופעם אחת עם מים בדרגת כרומטוגרפיית נוזלים-MS (LC-MS). על ידי דגירה של רצועת הממברנה עם 500 מיקרוליטר 0.3 M NaOAc (pH 4.0), בופר ו-500 מיקרוליטר תערובת נתרן ניטריט 1 M מומסת טרייה ב-37°C למשך 3 שעות, מקטע הליפידים משתחרר מ-Gas1-GFP ומפורק. שחרור אינוזין פוספט סרמיד בין גלוקוזאמין לאינוזיטול (51). לאחר מכן, רצועת הממברנה נשטפה ארבע פעמים עם מים בדרגת LC-MS, יובשה בטמפרטורת החדר ואוחסן באטמוספרת חנקן ב-80°C- עד לניתוח. כביקורת, נעשה שימוש בדגימה ריקה של קרום PVDF עבור כל ניסוי. לאחר מכן, הליפיד שחולץ מ-Gas1-GFP נותח באמצעות MS כמתואר (50). בקצרה, רצועות PVDF המכילות GPI-ליפיד הושעו מחדש ב-75 מיקרוליטר ממס עובש שלילי [כלורופורם/מתנול (1:2) + 5 mM אמוניום אצטט] ועברו ניתוח יינון אלקטרוספרייס (ESI)-MRM/MS של מיני ספינגוליפידים (TSQ Vantage). במקרה זה, נתוני MS התקבלו במצב יונים שליליים.
כפי שצוין קודם לכן, החלק הליפידי של עוגן ה-GPI הופרד מ-GPI-AP המסומן ב-[3H]-אינוזיטול (16). הליפידים הופרדו באמצעות כרומטוגרפיית שכבה דקה באמצעות מערכת ממס (55:45:10 כלורופורם-מתנול-0.25% KCl) והוצגו באמצעות FLA-7000 (Fujifilm).
התאים המבטאים את Gas1-GFP (600×107) נשטפו פעמיים עם בופר TNE, נשברו בעזרת חרוזי זכוכית, ולאחר מכן עברו צנטריפוגה להסרת שאריות תאים וחרוזי זכוכית. לאחר מכן, הנוזל העליון נצנטרפו ב-17,000 גרם למשך שעה ב-4°C. הגלולה נשטפה ב-TNE והודגרה עם יחידה אחת של PI-PLC (Invitrogen) ב-TNE המכיל 0.2% ספונין דיגיטליס למשך שעה ב-37°C. לאחר הטיפול באנזים, הממברנה הוסרה באמצעות צנטריפוגה ב-17,000 גרם ב-4°C למשך שעה. כדי ליצור אימונופרסיפיטיציה של Gas1-GFP, הנוזל העליון הודגר עם GFP-Trap_A (ChromoTek) ב-4°C למשך הלילה. Gas1-GFP המטוהר שהופרד באמצעות SDS-PAGE נצבע בכחול מבריק Coomassie. פס הצביעה Gas1-GFP נותק מהאפור המקיף את האמה, ולאחר אלקילציה עם יודואצטמיד וחיזור עם דיתיותרייטול, בוצע עיכול בג'ל עם טריפסין. חילצו וייבשו פפטידים טריפטיים ופפטידים עם GPI-גליקנים. הפפטיד המיובש הומס ב-20 מיקרוליטר מים. הזריקו חלק (8 מיקרוליטר) לתוך ה-LC. עמודת אוקטדצילסילאן (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; קוטר פנימי 150 מ"מ × 1.0 מ"מ; Nomura Chemical, מחוז איצ'י, יפן) שימשה להפרדת פפטידים בתנאי גרדיאנט ספציפיים. הפאזה הניידת היא ממס A (0.08% חומצה פורמית) וממס B (0.15% חומצה פורמית ב-80% אצטוניטריל). מערכת Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, בוסטון, מסצ'וסטס) שימשה לאלוציה של העמודה עם ממס A תוך 55 דקות בקצב זרימה של 50 מיקרוליטר לדקה למשך 5 דקות, ולאחר מכן הועלה ריכוז ממס B ל-40%. (ארצות הברית). האלואט הוכנס ברציפות למקור יוני ESI, והפפטידים הטריפטיים והפפטידים עם GPI-גליקנים נותחו על ידי LTQ Orbitrap XL (ספקטרומטר מסה היברידי לינארי יונים מלכודת-אורביטראפה; Thermo Fisher Scientific). בהגדרת ה-MS, מתח מקור הקפילרי נקבע ל-4.5 קילו-וולט, וטמפרטורת קפילר ההעברה נשמרה על 300 מעלות צלזיוס. מתח הקפילרי ומתח עדשת השפופרת נקבעו ל-15 וולט ו-50 וולט, בהתאמה. נתוני MS התקבלו במצב יונים חיוביים (רזולוציה של 60,000; דיוק מסה של 10 חלקים למיליון) בטווח מסות של יחס מסה/מטען (m/z) 3000. נתוני MS/MS מתקבלים דרך מלכודת היונים ב-LTQ Orbitrap XL [שלוש הספרות הראשונות עליהן תלויים הנתונים, דיסוציאציה מושרה על ידי התנגשות (CID)].
סימולציות MD בוצעו באמצעות תוכנת GROMACS (52) ושדה כוח MARTINI 2 (53-55). לאחר מכן, בונה הממברנות CHARMM GUI (56, 57) שימש לבניית שכבה דו-צדדית המכילה דיאולאילפוספטידילכולין (DOPC) ו-Cer C18 או DOPC ו-Cer C26. הטופולוגיה והקואורדינטות של Cer C26 נגזרות מ-DXCE על ידי הסרת החרוזים הנוספים מזנב הספינגוזין. השתמש בתהליך המתואר להלן כדי לאזן את השכבה הכפולה ולהריץ אותה, לאחר מכן השתמש בקואורדינטות האחרונות של המערכת כדי לבנות מערכת המכילה Emp24. הדומיין הטרנסממברנלי של שמרים Emp24 (שאריות 173 עד 193) נבנה כסליל α באמצעות כלי המבנה המולקולרי החזותי של MD (VMD) (58). לאחר מכן, לאחר הסרת הליפידים החופפים, החלבון עבר גרגירים גסים והוכנס לשכבה הדו-צדדית באמצעות CHARMM GUI. המערכת הסופית מכילה 1202 DOPC ו-302 Cer C26 או 1197 DOPC ו-295 Cer C18 ו-Emp24. יינון המערכת לריכוז של 0.150M. בוצעו ארבעה חזרות בלתי תלויות עבור שתי קומפוזיציות דו-שכבתיות.
שכבת הדו-ליפידים מאוזנת באמצעות תהליך CHARMM GUI, הכולל מזעור ולאחר מכן איזון של 405,000 צעדים, כאשר אילוצי המיקום מצטמצמים ומבוטלים בהדרגה, וצעד הזמן גדל מ-0.005 ps ל-0.02 ps. לאחר איזון, הוא מייצר 6 מיקרו-שניות עם צעד זמן של 0.02 ps. לאחר הכנסת Emp24, השתמש באותו תהליך CHARMM GUI כדי למזער ולאזן את המערכת, ולאחר מכן הפעל למשך 8 שניות בייצור.
עבור כל המערכות, במהלך תהליך האיזון, הלחץ נשלט על ידי ברוסטט ברנדסן (59), ובמהלך תהליך הייצור, הלחץ נשלט על ידי ברוסטט פארינלו-רחמן (60). בכל המקרים, הלחץ הממוצע הוא 1 בר ומשתמשים בסכמת צימוד לחץ חצי-איזוטרופית. בתהליך האיזון והייצור, משתמשים בתרמוסטט (61) עם כיול מחדש של מהירות כדי לצמד את הטמפרטורה של חלקיקי החלבון, השומנים והממס בהתאמה. במהלך כל הפעולה, טמפרטורת היעד היא 310K. האינטראקציה ללא קשר מחושבת על ידי יצירת רשימת זיווג באמצעות סכמת Verlet עם סבילות חיץ של 0.005. איבר קולומב מחושב באמצעות שדה התגובה ומרחק חיתוך של 1.1 ננומטר. איבר Vander Waals משתמש בסכמת חיתוך עם מרחק חיתוך של 1.1 ננומטר, וסכמת החיתוך Verlet משמשת לסחיפה פוטנציאלית (62).
באמצעות VMD, אורך הגל הניתוק בין חרוזי פוספט DOPC או חרוזי סרמיד AM1 לבין החלבון הוא 0.7 ננומטר, ומספר הליפידים המקיימים אינטראקציה עם החלבון מחושב. לפי הנוסחה הבאה, חשב את גורם הדלדול-העשרה (DE) כמו ב-(63): גורם DE = (כמות הליפידים הכוללים בחלבון 0.7) בחלבון 0.7 (כמות ה-Cer בליפידים הכוללים)
הערך המדווח מתקבל כממוצע, וסרגלי השגיאה הם ארבעה עותקים בלתי תלויים של SE. המובהקות הסטטיסטית של גורם DE מחושבת על ידי מבחן t [(ממוצע DE-factor-1)/SE]. חשב את ערך P מההתפלגות החד-זנבית.
כלי GROMACS שימש לחישוב מפת הצפיפות הצידית הדו-ממדית של המערכת המכילה Emp24 בתוך 250 ננו-שניות האחרונות של המעקב. על מנת לקבל את מפת ההעשרה/דלדול של סרמיד, מפת הצפיפות של Cer מחולקת בסכום מפת Cer ו-DOPC, ולאחר מכן מחולקת בריכוז Cer בגוף. נעשה שימוש באותו קנה מידה של מפת צבעים.
לחומרים משלימים למאמר זה, אנא עיינו בכתובת http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
זהו מאמר גישה פתוחה המופץ תחת תנאי רישיון Creative Commons Attribution-Non-Commercial, המאפשר שימוש, הפצה ורבייה בכל מדיום, כל עוד השימוש הסופי אינו למטרות רווח מסחרי וההנחה היא שהיצירה המקורית נכונה. הפניה.
הערה: אנו מבקשים שתספקו את כתובת הדוא"ל שלכם רק כדי שהאדם שאתם ממליצים עליו לדף ידע שאתם רוצים שהוא יראה את האימייל ושזה אינו ספאם. לא נאסוף כתובות דוא"ל.
שאלה זו משמשת לבדיקת האם אתה מבקר ולמניעת שליחת דואר זבל אוטומטי.
סופיה רודריגז-גלרדו, קזואו קורוקווה, סוזנה סבידו-בוזו, אלחנדרו קורטז · גומז (אלחנדרו קורטס-גומז), אטסוקו איקדה (אטסוקו איקדה), ולריה זוני (ולריה זוני), אוקסיאדורה אגילרה-רומרו, אנה מריה סרז'ו - לינופז (וואג'ו סרז'ו - לינופס), מייג'ו סרז'ו - לינופס. (מיהו וואגה), מיסאקו ארמן (מיסקו ארמן), מיאקו רימן (מיאקו רימן), פרוו אקירה, סטפנו פאני, אקיהיקו נאקאנו, מנואל מוניז
הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה בזמן אמת חושפת את החשיבות של אורך שרשרת הסרמיד למיון חלבונים באתרי פלט סלקטיביים.
סופיה רודריגז-גלרדו, קזואו קורוקווה, סוזנה סבידו-בוזו, אלחנדרו קורטז · גומז (אלחנדרו קורטס-גומז), אטסוקו איקדה (אטסוקו איקדה), ולריה זוני (ולריה זוני), אוקסיאדורה אגילרה-רומרו, אנה מריה סרז'ו - לינופז (וואג'ו סרז'ו - לינופס), מייג'ו סרז'ו - לינופס. (מיהו וואגה), מיסאקו ארמן (מיסקו ארמן), מיאקו רימן (מיאקו רימן), פרוו אקירה, סטפנו פאני, אקיהיקו נאקאנו, מנואל מוניז
הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה בזמן אמת חושפת את החשיבות של אורך שרשרת הסרמיד למיון חלבונים באתרי פלט סלקטיביים.
©2020 האגודה האמריקאית לקידום המדע. כֹּל הַזְכוּיוֹת שְׁמוּרוֹת. AAAS הוא שותף של HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ו-COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.