תודה שביקרת באתר nature.com. גרסת הדפדפן בה אתה משתמש כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בגרסת הדפדפן העדכנית ביותר (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בנוסף, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אתר זה לא יכלול סגנונות או JavaScript.
הסינתון 3-(אנתרצן-9-יל)-2-ציאנואקרילויל כלוריד 4 סונתז ושימש לסינתזה של מגוון תרכובות הטרוציקליות פעילות ביותר באמצעות תגובתו עם נוקלאופילים חנקניים שונים. המבנה של כל תרכובת הטרוציקלית שסונתזה אופיין ביסודיות באמצעות אנליזה ספקטרוסקופית ואלמנטרית. עשר מתוך שלוש עשרה התרכובות ההטרוציקליות החדשות הראו יעילות מעודדת כנגד חיידקים עמידים לתרופות מרובות (MRSA). ביניהן, תרכובות 6, 7, 10, 13b ו-14 הראו את הפעילות האנטיבקטריאלית הגבוהה ביותר עם אזורי עיכוב הקרובים ל-4 ס"מ. עם זאת, מחקרי עגינה מולקולרית גילו כי לתרכובות היו זיקות קישור שונות לחלבון קושר פניצילין 2a (PBP2a), מטרה מרכזית לעמידות ל-MRSA. תרכובות מסוימות כמו 7, 10 ו-14 הראו זיקת קישור ויציבות אינטראקציה גבוהה יותר באתר הפעיל של PBP2a בהשוואה לליגנד הכינוזולינון שעבר התגבשות משותפת. לעומת זאת, לתרכובות 6 ו-13b היו ציוני עגינה נמוכים יותר, אך עדיין הציגו פעילות אנטיבקטריאלית משמעותית, כאשר לתרכובת 6 היו ערכי MIC (9.7 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר) ו-MBC (78.125 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר) הנמוכים ביותר. ניתוח עגינה גילה אינטראקציות מרכזיות, כולל קשרי מימן ו-π-stacking, במיוחד עם שאריות כגון Lys 273, Lys 316 ו-Arg 298, אשר זוהו כמקיימות אינטראקציה עם הליגנד הקו-קריסטלי במבנה הגבישי של PBP2a. שאריות אלו חיוניות לפעילות האנזימטית של PBP2a. תוצאות אלו מצביעות על כך שהתרכובות המסונתזות עשויות לשמש כתרופות מבטיחות נגד MRSA, ומדגישות את החשיבות של שילוב עגינה מולקולרית עם ביו-אסיי כדי לזהות מועמדים טיפוליים יעילים.
בשנים הראשונות של המאה הזו, מאמצי המחקר התמקדו בעיקר בפיתוח הליכים ושיטות חדשים ופשוטים לסינתזה של מספר מערכות הטרוציקליות חדשניות בעלות פעילות אנטי-מיקרוביאלית תוך שימוש בחומרי מוצא זמינים בקלות.
קבוצות אקרילוניטריל נחשבות לחומרי מוצא חשובים לסינתזה של מערכות הטרוציקליות רבות ומרשימות, משום שהן תרכובות בעלות ריאקטיביות גבוהה. יתר על כן, נגזרות של 2-ציאנואקרילויל כלוריד נמצאות בשימוש נרחב בשנים האחרונות לפיתוח וסינתזה של מוצרים בעלי חשיבות חיונית בתחום היישומים הפרמקולוגיים, כגון חומרי ביניים תרופתיים1,2,3, חומרים קודמנים של חומרים נוגדי HIV, אנטי-ויראליים, נוגדי סרטן, אנטיבקטריאליים, נוגדי דיכאון ונוגדי חמצון4,5,6,7,8,9,10. לאחרונה, היעילות הביולוגית של אנתרצן ונגזרותיו, כולל תכונותיהם האנטיביוטיות, נוגדות הסרטן11,12, אנטיבקטריאליות13,14,15 וקוטלות החרקים16,17, משכו תשומת לב רבה18,19,20,21. התרכובות האנטי-מיקרוביאליות המכילות קבוצות אקרילוניטריל ואנתרצן מוצגות באיורים 1 ו-2.
על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO) (2021), עמידות לאנטיביוטיקה (AMR) מהווה איום עולמי על הבריאות והפיתוח22,23,24,25. חולים אינם ניתנים לריפוי, מה שמביא לאשפוז ממושך יותר ולצורך בתרופות יקרות יותר, כמו גם לתמותה ולמוגבלות מוגברת. היעדר חומרים אנטיביוטיים יעילים מוביל לעיתים קרובות לכישלון טיפול בזיהומים שונים, במיוחד במהלך כימותרפיה וניתוחים גדולים.
על פי דו"ח ארגון הבריאות העולמי לשנת 2024, סטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין (MRSA) ו-E. coli כלולים ברשימת הפתוגנים בעלי עדיפות גבוהה. שני החיידקים עמידים לאנטיביוטיקה רבות, ולכן הם מייצגים זיהומים שקשה לטפל ולשלוט בהם, וקיים צורך דחוף לפתח תרכובות אנטי-מיקרוביאליות חדשות ויעילות כדי לטפל בבעיה זו. אנתרצן ונגזרותיו הם אנטי-מיקרוביאליות ידועות שיכולות לפעול הן על חיידקים גראם-חיוביים והן על חיידקים גראם-שליליים. מטרת מחקר זה היא לסנתז נגזרת חדשה שיכולה להילחם בפתוגנים המסוכנים לבריאות.
ארגון הבריאות העולמי (WHO) מדווח כי פתוגנים חיידקיים רבים עמידים לאנטיביוטיקה מרובת גורמים, כולל סטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין (MRSA), גורם שכיח לזיהום בקהילה ובמסגרות שירותי בריאות. חולים עם זיהומי MRSA דווחו כבעלי שיעור תמותה גבוה ב-64% מאלה עם זיהומים הרגישים לתרופות. בנוסף, E. coli מהווה סיכון עולמי מכיוון שקו ההגנה האחרון כנגד Enterobacteriaceae עמידים לקרבפנם (כלומר, E. coli) הוא קוליסטין, אך לאחרונה דווח על חיידקים עמידים לקוליסטין במספר מדינות. 22,23,24,25
לכן, על פי תוכנית הפעולה העולמית של ארגון הבריאות העולמי בנושא עמידות לאנטיביוטיקה26, קיים צורך דחוף בגילוי וסינתזה של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים. הפוטנציאל הגדול של אנתרצן ואקרילוניטריל כחומרים אנטיבקטריאליים27, אנטי-פטרייתיים28, נוגדי סרטן29 ונוגדי חמצון30 הודגש במאמרים רבים שפורסמו. בהקשר זה, ניתן לומר כי נגזרות אלו הן מועמדות טובות לשימוש נגד סטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין (MRSA).
סקירות ספרות קודמות הניעו אותנו לסנתז נגזרות חדשות בקבוצות אלו. לכן, המחקר הנוכחי נועד לפתח מערכות הטרוציקליות חדשניות המכילות קבוצות אנתרצן ואקרילוניטריל, להעריך את יעילותן האנטי-מיקרוביאלית והאנטיבקטריאלית, ולחקור את האינטראקציות הפוטנציאליות שלהן הקשורות לקישור עם חלבון קושר פניצילין 2a (PBP2a) על ידי עגינה מולקולרית. בהתבסס על מחקרים קודמים, המחקר הנוכחי המשיך את הסינתזה, ההערכה הביולוגית והניתוח החישובי של מערכות הטרוציקליות כדי לזהות חומרים מבטיחים עמידים בפני מתיצילין (MRSA) בעלי פעילות מעכבת חזקה של PBP2a31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49.
המחקר הנוכחי שלנו מתמקד בסינתזה והערכה אנטי-מיקרוביאלית של תרכובות הטרוציקליות חדשות המכילות אנתרצן ואקרילוניטריל. 3-(אנתרצן-9-יל)-2-ציאנואקרילויל כלוריד 4 הוכן ושימש כאבן בניין לבניית מערכות הטרוציקליות חדשות.
המבנה של תרכובת 4 נקבע באמצעות נתונים ספקטרליים. ספקטרום 1H-NMR הראה נוכחות של CH= ב-9.26 ppm, ספקטרום IR הראה נוכחות של קבוצת קרבוניל ב-1737 cm−1 וקבוצת ציאנו ב-2224 cm−1, וספקטרום 13CNMR גם אישר את המבנה המוצע (ראה סעיף ניסיוני).
הסינתזה של 3-(אנתרצן-9-יל)-2-ציאנואקרילואיל כלוריד 4 הושגה על ידי הידרוליזה של קבוצות ארומטיות 250, 41, 42, 53 עם תמיסת נתרן הידרוקסיד אתנולית (10%) לקבלת חומצות 354, 45, 56, אשר טופלו לאחר מכן עם תיוניל כלוריד באמבט מים לקבלת נגזרת אקרילואיל כלוריד 4 בתפוקה גבוהה (88.5%), כפי שמוצג באיור 3.
כדי ליצור תרכובות הטרוציקליות חדשות בעלות היעילות האנטיבקטריאלית הצפויה, בוצעה תגובה של אציל כלוריד 4 עם דינוקלאופילים שונים.
חומצה כלוריד 4 טופל בהידרזין הידראט ב-0°C למשך שעה אחת. לרוע המזל, פיראזולון 5 לא הושג. התוצר היה נגזרת אקרילאמיד שמבנהו אושר על ידי נתונים ספקטרליים. ספקטרום ה-IR שלו הראה פסי בליעה של C=O ב-1720 ס"מ-1, C≡N ב-2228 ס"מ-1 ו-NH3 ב-3424 ס"מ-1. ספקטרום ה-1H-NMR הראה אות סינגלט חילופי של פרוטוני האולפין ופרוטוני NH3 ב-9.3 ppm (ראה סעיף ניסיוני).
שני מולים של חומצה כלוריד 4 הגיבו עם מול אחד של פנילהידרזין כדי לקבל את נגזרת N-פנילאקרילוילהידרזין 7 בתפוקה טובה (77%) (איור 5). המבנה של 7 אושר על ידי נתוני ספקטרוסקופיית אינפרא אדום, שהראו בליעה של שתי קבוצות C=O ב-1691 ו-1671 ס"מ-1, בליעה של קבוצת CN ב-2222 ס"מ-1 ובליעה של קבוצת NH ב-3245 ס"מ-1, וספקטרום 1H-NMR שלו הראה קבוצת CH ב-9.15 ו-8.81 ppm ופרוטון NH ב-10.88 ppm (ראה סעיף ניסיוני).
במחקר זה, נחקרה התגובה של אציל כלוריד 4 עם 1,3-דינוקלאופילים. טיפול באציל כלוריד 4 עם 2-אמינופירידין ב-1,4-דיאוקסאן עם TEA כבסיס בטמפרטורת החדר הניב את נגזרת אקרילאמיד 8 (איור 5), אשר המבנה שלה זוהה באמצעות נתונים ספקטרליים. ספקטרום IR הראה פסי בליעה של ציאנו המתוחים ב-2222 ס"מ-1, NH ב-3148 ס"מ-1 וקרבוניל ב-1665 ס"מ-1; ספקטרום 1H NMR אישרו את נוכחותם של פרוטונים של אולפינים ב-9.14 ppm (ראה סעיף ניסיוני).
תרכובת 4 מגיבה עם תיאוראה ליצירת פירימידינתיון 9; תרכובת 4 מגיבה עם תיו-סמיקרבזיד ליצירת נגזרת תיאופיראזול 10 (איור 5). המבנים של תרכובות 9 ו-10 אושרו על ידי אנליזה ספקטרלית ואלמנטרית (ראה סעיף ניסיוני).
טטרהזין-3-תיול 11 הוכן על ידי תגובה של תרכובת 4 עם תיוקרבזיד כ-1,4-דינוקלאופיל (איור 5), ומבנהו אושר על ידי ספקטרוסקופיה ואנליזה אלמנטרית. בספקטרום האינפרא אדום, קשר C=N הופיע ב-1619 ס"מ⁻¹. במקביל, ספקטרום 1H-NMR שלו שמר על אותות מרובי לוחות של פרוטונים ארומטיים ב-7.78–8.66 ppm ופרוטוני SH ב-3.31 ppm (ראה סעיף ניסיוני).
אקרילויל כלוריד 4 מגיב עם 1,2-דיאמינובנזן, 2-אמינותיופנול, חומצה אנתרנילית, 1,2-דיאמינואתאן ואתנולמין כ-1,4-דינוקלאופילים ליצירת מערכות הטרוציקליות חדשות (13-16).
המבנים של תרכובות אלו שסונתזו לאחרונה אושרו על ידי אנליזה ספקטרלית ואלמנטרית (ראה סעיף ניסיוני). נגזרת 2-הידרוקסיפנילאקרילאמיד 17 הושגה על ידי תגובה עם 2-אמינופנול כדינוקלאופיל (איור 6), והמבנה שלה אושר על ידי אנליזה ספקטרלית ואלמנטרית. ספקטרום האינפרא אדום של תרכובת 17 הראה כי אותות C=O ו-C≡N הופיעו ב-1681 ו-2226 ס"מ⁻¹, בהתאמה. בינתיים, ספקטרום 1H-NMR שלו שמר על אות הסינגלט של פרוטון האולפין ב-9.19 ppm, ופרוטון ה-OH הופיע ב-9.82 ppm (ראה סעיף ניסיוני).
התגובה של חומצה כלוריד 4 עם נוקלאופיל אחד (למשל, אתילאמין, 4-טולואידין ו-4-מתוקסיאנילין) בדיאוקסאן כממס ו-TEA כזרז בטמפרטורת החדר הניבה נגזרות אקרילאמיד גבישיות ירוקות 18, 19a ו-19b. נתונים אלמנטריים וספקטרליים של תרכובות 18, 19a ו-19b אישרו את המבנים של נגזרות אלו (ראה סעיף ניסיוני) (איור 7).
לאחר בדיקת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של תרכובות סינתטיות שונות, התקבלו תוצאות שונות כפי שמוצג בטבלה 1 ובאיור 8 (ראה קובץ איורים). כל התרכובות שנבדקו הראו דרגות שונות של עיכוב כנגד החיידק הגראם-חיובי MRSA, בעוד שהחיידק הגראם-שלילי אשריכיה קולי הראה עמידות מלאה לכל התרכובות. ניתן לחלק את התרכובות שנבדקו לשלוש קטגוריות על סמך קוטר אזור העיכוב כנגד MRSA. הקטגוריה הראשונה הייתה הפעילה ביותר וכללה חמישה תרכובות (6, 7, 10, 13b ו-14). קוטר אזור העיכוב של תרכובות אלו היה קרוב ל-4 ס"מ; התרכובות הפעילות ביותר בקטגוריה זו היו תרכובות 6 ו-13b. הקטגוריה השנייה הייתה פעילה במידה בינונית וכללה חמישה תרכובות נוספות (11, 13a, 15, 18 ו-19a). אזור העיכוב של תרכובות אלו נע בין 3.3 ל-3.65 ס"מ, כאשר תרכובת 11 מציגה את אזור העיכוב הגדול ביותר של 3.65 ± 0.1 ס"מ. מצד שני, הקבוצה האחרונה הכילה שלוש תרכובות (8, 17 ו-19b) בעלות הפעילות האנטי-מיקרוביאלית הנמוכה ביותר (פחות מ-3 ס"מ). איור 9 מציג את התפלגות אזורי העיכוב השונים.
חקירה נוספת של הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של התרכובות שנבדקו כללה קביעת ה-MIC וה-MBC עבור כל תרכובת. התוצאות השתנו מעט (כפי שמוצג בטבלאות 2, 3 ובאיור 10 (ראה קובץ איורים)), כאשר תרכובות 7, 11, 13a ו-15 סווגו מחדש ככל הנראה כתרכובות הטובות ביותר. היו להן אותם ערכי MIC ו-MBC נמוכים ביותר (39.06 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר). למרות שלתרכובות 7 ו-8 היו ערכי MIC נמוכים יותר (9.7 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר), ערכי ה-MBC שלהן היו גבוהים יותר (78.125 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר). לכן, הן נחשבו חלשות יותר מהתרכובות שהוזכרו קודם לכן. עם זאת, שש תרכובות אלו היו היעילות ביותר מבין אלו שנבדקו, שכן ערכי ה-MBC שלהן היו מתחת ל-100 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר.
תרכובות (10, 14, 18 ו-19b) היו פחות פעילות בהשוואה לתרכובות אחרות שנבדקו, שכן ערכי ה-MBC שלהן נעו בין 156 ל-312 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר. מצד שני, תרכובות (8, 17 ו-19a) היו הכי פחות מבטיחות, שכן הן היו בעלות ערכי ה-MBC הגבוהים ביותר (625, 625 ו-1250 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר, בהתאמה).
לבסוף, בהתאם לרמות הסבילות המוצגות בטבלה 3, ניתן לחלק את התרכובות שנבדקו לשתי קטגוריות על סמך אופן הפעולה שלהן: תרכובות בעלות השפעה חיידקית (7, 8, 10, 11, 13a, 15, 18, 19b) ותרכובות בעלות השפעה אנטיבקטריאלית (6, 13b, 14, 17, 19a). מביניהן, תרכובות 7, 11, 13a ו-15 הן העדיפות, אשר מפגינות פעילות הרג בריכוז נמוך מאוד (39.06 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר).
עשר מתוך שלוש עשרה התרכובות שנבדקו הראו פוטנציאל כנגד סטפילוקוקוס אאורוס (MRSA) עמיד לאנטיביוטיקה ועמיד למתיצילין. לכן, מומלץ לבצע סינון נוסף עם פתוגנים עמידים יותר לאנטיביוטיקה (במיוחד מבודדים מקומיים המכסים חיידקים גראם-חיוביים וגראם-שליליים פתוגניים) ושמרים פתוגניים, כמו גם בדיקות ציטוטוקסיות של כל תרכובת כדי להעריך את בטיחותה.
מחקרי עגינה מולקולרית נערכו כדי להעריך את הפוטנציאל של התרכובות המסונתזות כמעכבות של חלבון קושר פניצילין 2a (PBP2a) בסטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין (MRSA). PBP2a הוא אנזים מפתח המעורב בביוסינתזה של דופן התא של חיידקים, ועיכוב של אנזים זה מפריע להיווצרות דופן התא, ובסופו של דבר מוביל לליזיס חיידקית ומוות תאי1. תוצאות העגינה מפורטות בטבלה 4 ומתוארות ביתר פירוט בקובץ הנתונים המשלים, והתוצאות מראות שמספר תרכובות הציגו זיקה חזקה לקישור PBP2a, במיוחד שיירי אתר פעיל מרכזיים כגון Lys 273, Lys 316 ו-Arg 298. האינטראקציות, כולל קשרי מימן וערימה π, היו דומות מאוד לאלו של ליגנד הכינוזולינון המקובל יחד (CCL), דבר המצביע על הפוטנציאל של תרכובות אלו כמעכבים חזקים.
נתוני העגינה המולקולרית, יחד עם פרמטרים חישוביים אחרים, הצביעו בצורה חזקה על כך שעיכוב PBP2a היה המנגנון המרכזי האחראי לפעילות האנטיבקטריאלית שנצפתה של תרכובות אלו. ציוני העגינה וערכי סטיית הריבועים הממוצעת (RMSD) חשפו עוד יותר את הזיקה והיציבות של הקישור, ותמכו בהשערה זו. כפי שמוצג בטבלה 4, בעוד שמספר תרכובות הראו זיקה טובה לקישור, חלק מהתרכובות (למשל, 7, 9, 10 ו-14) הראו ציוני עגינה גבוהים יותר מאשר הליגנד המגובה יחד, דבר המצביע על כך שייתכן שיש להן אינטראקציות חזקות יותר עם שיירי האתר הפעיל של PBP2a. עם זאת, התרכובות הביו-אקטיביות ביותר 6 ו-13b הראו ציוני עגינה נמוכים במקצת (-5.98 ו--5.63, בהתאמה) בהשוואה לליגנדים האחרים. ממצא זה מצביע על כך שלמרות שניתן להשתמש בציוני עגינה כדי לחזות זיקה לקישור, גורמים אחרים (למשל, יציבות ליגנד ואינטראקציות מולקולריות בסביבה הביולוגית) גם הם ממלאים תפקיד מפתח בקביעת הפעילות האנטיבקטריאלית. ראוי לציין כי ערכי ה-RMSD של כל התרכובות המסונתזות היו מתחת ל-2 Å, דבר המאשר שתנוחות העגינה שלהן תואמות מבחינה מבנית את קונפורמציית הקישור של הליגנד המגובה-בשיתוף, דבר התומך עוד יותר בפוטנציאל שלהן כמעכבי PBP2a רבי עוצמה.
למרות שציוני עגינה וערכי RMS מספקים תחזיות חשובות, המתאם בין תוצאות עגינה אלו לפעילות אנטי-מיקרוביאלית אינו תמיד ברור במבט ראשון. למרות שעיכוב PBP2a נתמך מאוד כגורם מפתח המשפיע על הפעילות האנטי-מיקרוביאלית, מספר הבדלים מצביעים על כך שגם תכונות ביולוגיות אחרות ממלאות תפקיד חשוב. תרכובות 6 ו-13b הראו את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית הגבוהה ביותר, עם קוטר אזור עיכוב של 4 ס"מ וערכי MIC (9.7 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר) ו-MBC (78.125 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר) הנמוכים ביותר, למרות ציוני העגינה הנמוכים יותר שלהן בהשוואה לתרכובות 7, 9, 10 ו-14. ממצא זה מצביע על כך שלמרות שעיכוב PBP2a תורם לפעילות אנטי-מיקרוביאלית, גורמים כמו מסיסות, זמינות ביולוגית ודינמיקת אינטראקציה בסביבה החיידקית משפיעים גם הם על הפעילות הכוללת. איור 11 מציג את תנוחות העגינה שלהן, דבר המצביע על כך ששתי התרכובות, אפילו עם ציוני קישור נמוכים יחסית, עדיין מסוגלות לתקשר עם שאריות מפתח של PBP2a, ובכך לייצב באופן פוטנציאלי את קומפלקס העיכוב. זה מדגיש שבעוד שעגינה מולקולרית מספקת תובנות חשובות לגבי עיכוב PBP2a, יש לקחת בחשבון גורמים ביולוגיים אחרים כדי להבין באופן מלא את ההשפעות האנטי-מיקרוביאליות של תרכובות אלו בעולם האמיתי.
באמצעות מבנה הגביש של PBP2a (מזהה PDB: 4CJN), נבנו מפות אינטראקציה דו-ממדיות ותלת-ממדיות של התרכובות הפעילות ביותר 6 ו-13b, המקושרות לחלבון קושר פניצילין 2a (PBP2a) של סטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין (MRSA). מפות אלו משוות את דפוסי האינטראקציה של תרכובות אלו עם ליגנד קוינזולינון (CCL) שעבר קו-גביש מחדש, תוך הדגשת אינטראקציות מרכזיות כגון קשרי מימן, π-stacking ואינטראקציות יוניות.
דפוס דומה נצפה עבור תרכובת 7, אשר הראתה ציון עגינה גבוה יחסית (-6.32) וקוטר אזור עיכוב דומה (3.9 ס"מ) לתרכובת 10. עם זאת, ה-MIC שלה (39.08 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר) וה-MBC (39.06 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר) היו גבוהים משמעותית, דבר המצביע על כך שהיא נדרשה לריכוזים גבוהים יותר כדי להפגין השפעה אנטיבקטריאלית. ממצא זה מצביע על כך שלמרות שתרכובת 7 הראתה זיקה חזקה לקישור במחקרי עגינה, גורמים כגון זמינות ביולוגית, ספיגה תאית או תכונות פיזיקוכימיות אחרות עשויים להגביל את יעילותה הביולוגית. למרות שתרכובת 7 הראתה תכונות חיידקיות, היא הייתה פחות יעילה בעיכוב גדילה חיידקית בהשוואה לתרכובות 6 ו-13b.
תרכובת 10 הראתה הבדל דרמטי יותר עם ציון העגינה הגבוה ביותר (-6.40), דבר המצביע על זיקה חזקה ל-PBP2a. עם זאת, קוטר אזור העיכוב שלה (3.9 ס"מ) היה דומה לתרכובת 7, ו-MBC שלה (312 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר) היה גבוה משמעותית מתרכובות 6, 7 ו-13b, דבר המצביע על פעילות חיידקית חלשה יותר. ממצא זה מצביע על כך שלמרות תחזיות עגינה טובות, תרכובת 10 הייתה פחות יעילה בהריגת MRSA עקב גורמים מגבילים אחרים כגון מסיסות, יציבות או חדירות ירודה של קרום החיידקים. תוצאות אלו תומכות בהבנה שבעוד שעיכוב PBP2a ממלא תפקיד מפתח בפעילות אנטיבקטריאלית, הוא אינו מסביר במלואו את ההבדלים בפעילות הביולוגית שנצפו בין התרכובות שנבדקו. הבדלים אלו מצביעים על כך שיש צורך בניתוחים ניסיוניים נוספים והערכות ביולוגיות מעמיקות כדי להבהיר באופן מלא את המנגנונים האנטיבקטריאליים המעורבים.
תוצאות העגינה המולקולרית בטבלה 4 ובקובץ הנתונים המשלים מדגישות את הקשר המורכב בין ציוני עגינה לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. למרות שלתרכובות 6 ו-13b יש ציוני עגינה נמוכים יותר מאשר לתרכובות 7, 9, 10 ו-14, הן מפגינות את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית הגבוהה ביותר. מפות האינטראקציה שלהן (מוצגות באיור 11) מצביעות על כך שלמרות ציוני הקישור הנמוכים יותר שלהן, הן עדיין יוצרות קשרי מימן משמעותיים ואינטראקציות π-stacking עם שיירים מרכזיים של PBP2a שיכולים לייצב את קומפלקס האנזים-מעכב בצורה מועילה מבחינה ביולוגית. למרות ציוני העגינה הנמוכים יחסית של 6 ו-13b, הפעילות האנטי-מיקרוביאלית המוגברת שלהן מצביעה על כך שיש לקחת בחשבון תכונות אחרות כגון מסיסות, יציבות וקליטה תאית בשילוב עם נתוני העגינה בעת הערכת פוטנציאל המעכב. זה מדגיש את החשיבות של שילוב מחקרי עגינה עם ניתוח אנטי-מיקרוביאלי ניסיוני כדי להעריך במדויק את הפוטנציאל הטיפולי של תרכובות חדשות.
תוצאות אלו מדגישות כי בעוד שעגינה מולקולרית היא כלי רב עוצמה לחיזוי זיקת קישור ולזיהוי מנגנוני עיכוב פוטנציאליים, אין להסתמך עליה לבדה כדי לקבוע את יעילותה האנטי-מיקרוביאלית. הנתונים המולקולריים מצביעים על כך שעיכוב PBP2a הוא גורם מפתח המשפיע על פעילות אנטי-מיקרוביאלית, אך שינויים בפעילות הביולוגית מצביעים על כך שיש למטב תכונות פיזיקו-כימיות ופרמקוקינטיות אחרות כדי לשפר את היעילות הטיפולית. מחקרים עתידיים צריכים להתמקד באופטימיזציה של המבנה הכימי של תרכובות 7 ו-10 כדי לשפר את הזמינות הביולוגית ואת הקליטה התאית, תוך הבטחה שאינטראקציות עגינה חזקות יתורגמו לפעילות אנטי-מיקרוביאלית בפועל. מחקרים נוספים, כולל מבחנים ביולוגיים נוספים וניתוח יחסי מבנה-פעילות (SAR), יהיו קריטיים לשיפור הבנתנו כיצד תרכובות אלו מתפקדות כמעכבי PBP2a ולפיתוח חומרים אנטי-מיקרוביאליים יעילים יותר.
תרכובות שסונתזו מ-3-(אנתרצן-9-יל)-2-ציאנואקרילויל כלוריד 4 הציגו דרגות שונות של פעילות אנטי-מיקרוביאלית, כאשר מספר תרכובות הדגימו עיכוב משמעותי של סטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין (MRSA). ניתוח יחסי מבנה-פעילות (SAR) חשף מאפיינים מבניים מרכזיים העומדים בבסיס היעילות האנטי-מיקרוביאלית של תרכובות אלו.
נוכחותן של קבוצות אקרילוניטריל ואנתרצן כאחד הוכחה כקריטית לשיפור הפעילות האנטי-מיקרוביאלית. קבוצת הניטריל בעלת הריאקציה הגבוהה באקרילוניטריל נחוצה כדי להקל על אינטראקציות עם חלבונים חיידקיים, ובכך תורמת לתכונות האנטי-מיקרוביאליות של התרכובת. תרכובות המכילות גם אקרילוניטריל וגם אנתרצן הפגינו באופן עקבי השפעות אנטי-מיקרוביאליות חזקות יותר. הארומטיות של קבוצת האנתרצן ייצבה עוד יותר את התרכובות הללו, מה שעשוי לשפר את הפעילות הביולוגית שלהן.
הכנסת טבעות הטרוציקליות שיפרה משמעותית את היעילות האנטיבקטריאלית של מספר נגזרות. בפרט, נגזרת בנזותיאזול 13b ונגזרת אקרילהידראזיד 6 הראו את הפעילות האנטיבקטריאלית הגבוהה ביותר עם אזור עיכוב של כ-4 ס"מ. נגזרות הטרוציקליות אלו הראו השפעות ביולוגיות משמעותיות יותר, דבר המצביע על כך שהמבנה ההטרוציקלי ממלא תפקיד מפתח בהשפעות האנטיבקטריאליות. באופן דומה, פירימידינתיון בתרכובת 9, תיופיראזול בתרכובת 10 וטבעת טטרזין בתרכובת 11 תרמו לתכונות האנטיבקטריאליות של התרכובות, מה שמדגיש עוד יותר את חשיבות המודיפיקציה ההטרוציקלית.
מבין התרכובות המסונתזות, 6 ו-13b בלטו בזכות פעילותן האנטיבקטריאלית המצוינת. הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של תרכובת 6 היה 9.7 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר, והריכוז הבקטרצידי המינימלי (MBC) היה 78.125 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר, דבר המדגיש את יכולתה המצוינת לסלק סטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין (MRSA). באופן דומה, לתרכובת 13b היה אזור עיכוב של 4 ס"מ וערכי MIC ו-MBC נמוכים, המאשרים את פעילותה האנטיבקטריאלית החזקה. תוצאות אלו מדגישות את התפקידים המרכזיים של קבוצות פונקציונליות אקרילוהידראזיד ובנזותיאזול בקביעת היעילות הביולוגית של תרכובות אלו.
לעומת זאת, תרכובות 7, 10 ו-14 הציגו פעילות אנטיבקטריאלית מתונה עם אזורי עיכוב שנעו בין 3.65 ל-3.9 סמ"ק. תרכובות אלו דרשו ריכוזים גבוהים יותר כדי להרוג לחלוטין את החיידקים, כפי שמשתקף בערכי ה-MIC וה-MBC הגבוהים יחסית שלהן. למרות שתרכובות אלו היו פחות פעילות מתרכובות 6 ו-13b, הן עדיין הראו פוטנציאל אנטיבקטריאלי משמעותי, דבר המצביע על כך ששילוב של קבוצות אקרילוניטריל ואנתרצן בטבעת ההטרוציקלית תורם להשפעתן האנטיבקטריאלית.
לתרכובות אופני פעולה שונים, חלקן מפגינות תכונות חיידקיות ואחרות מפגינות השפעות בקטריוסטטיות. תרכובות 7, 11, 13a ו-15 הן חיידקיות ודורשות ריכוזים נמוכים יותר כדי להרוג לחלוטין חיידקים. לעומת זאת, תרכובות 6, 13b ו-14 הן בקטריוסטטיות ויכולות לעכב גדילה של חיידקים בריכוזים נמוכים יותר, אך דורשות ריכוזים גבוהים יותר כדי להרוג לחלוטין חיידקים.
בסך הכל, ניתוח יחסי מבנה-פעילות מדגיש את החשיבות של הכנסת קבוצות אקרילוניטריל ואנתרצן ומבנים הטרוציקליים כדי להשיג פעילות אנטיבקטריאלית משמעותית. תוצאות אלו מצביעות על כך שאופטימיזציה של רכיבים מבניים אלה וחקר שינויים נוספים לשיפור המסיסות וחדירות הממברנה עשויים להוביל לפיתוח תרופות יעילות יותר נגד MRSA.
כל הריאגנטים והממסים טוהרו ויובשו באמצעות נהלים סטנדרטיים (אל גומהוריה, מצרים). נקודות ההיתוך נקבעו באמצעות מכשיר נקודת התכה אלקטרוני GallenKamp ומדווחות ללא תיקון. ספקטרום אינפרא אדום (IR) (ס"מ⁻¹) תועד במחלקה לכימיה, בפקולטה למדעים, באוניברסיטת עין שמס באמצעות כדורי אשלגן ברומיד (KBr) על ספקטרומטר Thermo Electron Nicolet iS10 FTIR (Thermo Fisher Scientific, וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב).
ספקטרום NMR של 1H התקבל בתדר 300 מגה-הרץ באמצעות ספקטרומטר NMR של GEMINI (GEMINI Manufacturing & Engineering, אנאהיים, קליפורניה, ארה"ב) וספקטרומטר NMR של BRUKER 300 מגה-הרץ (BRUKER Manufacturing & Engineering, Inc.). טטרמתילסילאן (TMS) שימש כסטנדרט פנימי עם דימתיל סולפוקסיד דאוטרטי (DMSO-d₆). מדידות NMR בוצעו בפקולטה למדעים, אוניברסיטת קהיר, גיזה, מצרים. ניתוח אלמנטרי (CHN) בוצע באמצעות מנתח אלמנטרי Perkin-Elmer 2400 והתוצאות שהתקבלו תואמות היטב את הערכים המחושבים.
תערובת של חומצה 3 (5 מילימול) ותיוניל כלוריד (5 מ"ל) חוממה באמבט מים ב-65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. עודף תיוניל כלוריד הוסר על ידי זיקוק תחת לחץ מופחת. המוצק האדום שנוצר נאסף ונעשה בו שימוש ללא טיהור נוסף. נקודת התכה: 200-202 מעלות צלזיוס, תשואה: 88.5%. IR (KBr, ν, cm−1): 2224 (C≡N), 1737 (C=O). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9.26 (s, 1H, CH=), 7.27-8.57 (m, 9H, הטרוארומטיזציה). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 115.11 (C≡N), 124.82–130.53 (CH אנתרצן), 155.34, 114.93 (CH=C–C=O), 162.22 (C=O); HRMS (ESI) m/z [M + H]+: 291.73111. אנליסט. מחושב עבור C18H10ClNO3 (291.73): C, 74.11; H, 3.46; N, 4.80. נמצא: C, 74.41; H, 3.34; N, 4.66%.
ב-0°C, 4 (2 מילימול, 0.7 גרם) הומס בדיוקסאן נטול מים (20 מ"ל) והידרזין הידראט (2 מילימול, 0.16 מ"ל, 80%) נוסף טיפה אחר טיפה וערבב במשך שעה אחת. המוצק שהתקבל נאסף באמצעות סינון והתגבש מחדש מאתנול כדי לקבל את תרכובת 6.
גבישים ירוקים, נקודת התכה 190-192℃, תשואה 69.36%; IR (KBr) ν=3424 (NH), 2228 (C≡N), 1720 (C=O), 1621 (C=N) cm−1. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9.3 (br s, H, NH, ניתן להחלפה), 7.69-8.51 (m, 18H, הטרוארומטי), 9.16 (s, 1H, CH=), 8.54 (s, 1H, CH=); ערך מחושב עבור C33H21N3O (475.53): C, 83.35; H, 4.45; N, 8.84. נמצא: C, 84.01; H, 4.38; N, 8.05%.
יש להמיס 4 (2 מילימול, 0.7 גרם) ב-20 מ"ל של תמיסת דיאוקסן נטולת מים (המכילה כמה טיפות של טריאתילאמין), להוסיף פנילהידרזין/2-אמינופירידין (2 מילימול) ולערבב בטמפרטורת החדר במשך שעה ושעה, בהתאמה. יש לשפוך את תערובת התגובה לקרח או למים ולחמצם עם חומצה הידרוכלורית מדוללת. יש לסנן את המוצק המופרד ולגבש מחדש מאתנול לקבלת 7 ולגבש מחדש מבנזן לקבלת 8.
גבישים ירוקים, נקודת התכה 160-162℃, תשואה 77%; IR (KBr, ν, cm−1): 3245 (NH), 2222 (C≡N), 1691 (C=O), 1671 (C=O) cm−1. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm): 10.88 (s, 1H, NH, ניתן להחלפה), 9.15 (s, 1H, CH=), 8.81 (s, 1H, CH=), 6.78-8.58 (m, 23H, הטרוארומטי); ערך מחושב עבור C42H26N4O2 (618.68): C, 81.54; H, 4.24; N, 9.06. נמצא: C, 81.96; H, 3.91; נ', 8.91%.
4 (2 מילימול, 0.7 גרם) הומס ב-20 מ"ל של תמיסת דיאוקסן נטולת מים (המכילה כמה טיפות של טריאתילאמין), 2-אמינופירידין (2 מילימול, 0.25 גרם) נוספה והתערובת עורבבה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. תערובת התגובה נמזגה למי קרח וחומצה בחומצה הידרוכלורית מדוללת. המשקע שנוצר סונן והתגבש מחדש מבנזן, ונתן גבישים ירוקים של 8 עם נקודת התכה של 146-148 מעלות צלזיוס ותשואה של 82.5%; ספקטרום אינפרא אדום (KBr) ν: 3148 (NH3), 2222 (C≡N), 1665 (C=O) cm−1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm): 8.78 (s, H, NH, ניתן להחלפה), 9.14 (s, 1H, CH=), 7.36-8.55 (m, 13H, הטרוארומטיזציה); מחושב עבור C23H15N3O (348.38): C, 79.07; H, 4.33; N, 12.03. נמצא: C, 78.93; H, 3.97; N, 12.36%.
תרכובת 4 (2 מילימול, 0.7 גרם) הומסה ב-20 מ"ל של דיאוקסן יבש (המכיל כמה טיפות של טריאתילאמין ו-2 מילימול של תיאוריאה/סמיקרבזיד) וחוממה תחת רפלוקס במשך שעתיים. הממס התאדה בוואקום. השארית עברה התגבשות מחדש מדיאוקסן ליצירת תערובת.