תודה שביקרתם באתר nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בגרסת הדפדפן העדכנית ביותר (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בנוסף, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אתר זה לא יכלול סגנונות או JavaScript.
למימן גופרתי (H2S) השפעות פיזיולוגיות ופתולוגיות מרובות על גוף האדם. נתרן הידרוסולפיד (NaHS) נמצא בשימוש נרחב ככלי פרמקולוגי להערכת השפעות ה-H2S בניסויים ביולוגיים. למרות שאובדן ה-H2S מתמיסות NaHS אורך רק מספר דקות, תמיסות NaHS שימשו כתרכובות תורמות ל-H2S במי שתייה בכמה מחקרים בבעלי חיים. מחקר זה בדק האם מי שתייה בריכוז NaHS של 30 מיקרומולר שהוכנו בבקבוקי חולדות/עכברים יכולים להישאר יציבים למשך 12-24 שעות לפחות, כפי שהוצע על ידי כמה מחברים. הכינו תמיסה של NaHS (30 מיקרומולר) במי שתייה ושפכו אותה מיד לבקבוקי מים של חולדות/עכברים. דגימות נאספו מקצה בקבוק המים ומפניםו לאחר 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 ו-24 שעות כדי למדוד את תכולת הגופרתי באמצעות שיטת מתילן כחול. בנוסף, חולדות זכרים ונקבות הוזרקו NaHS (30 מיקרומולר) במשך שבועיים וריכוזי הגופרית בסרום נמדדו כל יומיים במהלך השבוע הראשון ובסוף השבוע השני. תמיסת ה-NaHS בדגימה שהתקבלה מקצה בקבוק המים לא הייתה יציבה; היא ירדה ב-72% ו-75% לאחר 12 ו-24 שעות, בהתאמה. בדגימות שהתקבלו מתוך בקבוקי המים, הירידה ב-NaHS לא הייתה משמעותית תוך שעתיים; עם זאת, היא ירדה ב-47% ו-72% לאחר 12 ו-24 שעות, בהתאמה. הזרקת NaHS לא השפיעה על רמת הגופרית בסרום של חולדות זכרים ונקבות. לסיכום, אין להשתמש בתמיסות NaHS שהוכנו ממי שתייה לתרומת H2S מכיוון שהתמיסה אינה יציבה. דרך מתן זו תחשוף את בעלי החיים לכמויות לא סדירות וקטנות מהצפוי של NaHS.
מימן גופרתי (H2S) משמש כרעלן מאז שנת 1700; עם זאת, תפקידו האפשרי כמולקולת איתות ביולוגית אנדוגנית תואר על ידי אבה וקימורה בשנת 1996. במהלך שלושת העשורים האחרונים, הובהרו תפקודים רבים של H2S במערכות אנושיות שונות, מה שהוביל להבנה כי למולקולות תורמות H2S עשויים להיות יישומים קליניים בטיפול או בניהול מחלות מסוימות; ראה צ'ירינו ואח' לסקירה עדכנית.
נתרן הידרוסולפיד (NaHS) נמצא בשימוש נרחב ככלי פרמקולוגי להערכת השפעות H2S במחקרים רבים בתרביות תאים ובבעלי חיים 5,6,7,8. עם זאת, NaHS אינו תורם H2S אידיאלי מכיוון שהוא מומר במהירות ל-H2S/HS- בתמיסה, מזוהם בקלות בפוליסולפידים, ומתחמצן ומתנדף בקלות 4,9. בניסויים ביולוגיים רבים, NaHS מומס במים, מה שמביא להתנדפות פסיבית ואובדן H2S 10,11,12, חמצון ספונטני של H2S 11,12,13 ופוטוליזה 14. סולפיד בתמיסה המקורית אובד במהירות רבה עקב התנדפות H2S 11. במיכל פתוח, זמן מחצית החיים (t1/2) של H2S הוא כ-5 דקות, וריכוזו יורד בכ-13% לדקה 10. למרות שאובדן מימן גופרתי מתמיסות NaHS אורך רק מספר דקות, מספר מחקרים בבעלי חיים השתמשו בתמיסות NaHS כמקור למימן גופרתי במי שתייה למשך 1-21 שבועות, תוך החלפת התמיסה המכילה NaHS כל 12-24 שעות.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 נוהג זה אינו עולה בקנה אחד עם עקרונות המחקר המדעי, מכיוון שמינון התרופות צריך להתבסס על השימוש בהן במינים אחרים, במיוחד בבני אדם.27
מחקר פרה-קליני בביו-רפואה שואף לשפר את איכות הטיפול בחולים או את תוצאות הטיפול. עם זאת, תוצאות רוב המחקרים בבעלי חיים טרם תורגמו לבני אדם28,29,30. אחת הסיבות לכישלון התרגום הזה היא חוסר תשומת לב לאיכות המתודולוגית של מחקרים בבעלי חיים30. לכן, מטרת מחקר זה הייתה לבדוק האם תמיסות NaHS בריכוז 30 מיקרומולר שהוכנו בבקבוקי מים של חולדות/עכברים יכולות להישאר יציבות במי שתייה למשך 12-24 שעות, כפי שנטען או הוצע במחקרים מסוימים.
כל הניסויים במחקר זה נערכו בהתאם להנחיות שפורסמו לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה באיראן31. כל דוחות הניסויים במחקר זה עקבו גם אחר הנחיות ARRIVE32. ועדת האתיקה של המכון למדעי האנדוקריניה, אוניברסיטת שהיד בהשתי למדעי הרפואה, אישרה את כל הליכי הניסוי במחקר זה.
אבץ אצטט דיהידרט (CAS: 5970-45-6) וכלוריד ברזל נטול מים (CAS: 7705-08-0) נרכשו מ-Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, צרפת). נתרן הידרוסולפיד הידראט (CAS: 207683-19-0) ו-N,N-דימתיל-p-פנילנדיאמין (DMPD) (CAS: 535-47-0) נרכשו מסיגמא-אלדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב). איזופלוראן נרכש מפירמאל (בית לחם, פנסילבניה, ארה"ב). חומצה הידרוכלורית (HCl) נרכשה ממרק (דרמשטט, גרמניה).
הכינו תמיסה של NaHS (30 מיקרומולר) במי שתייה ושפכו אותה מיד לבקבוקי מים של חולדות/עכברים. ריכוז זה נבחר על סמך פרסומים רבים המשתמשים ב-NaHS כמקור ל-H2S; ראו סעיף הדיון. NaHS היא מולקולה מימית שיכולה להכיל כמויות משתנות של מי הידרציה (כלומר, NaHS•xH2O); על פי היצרן, אחוז ה-NaHS בו נעשה שימוש במחקר שלנו היה 70.7% (כלומר, NaHS•1.3 H2O), ולקחנו ערך זה בחשבון בחישובים שלנו, שבהם השתמשנו במשקל מולקולרי של 56.06 גרם/מול, שהוא המשקל המולקולרי של NaHS נטול מים. מי הידרציה (הנקראים גם מי גיבוש) הם מולקולות המים המרכיבות את המבנה הגבישי33. להידרטים תכונות פיזיקליות ותרמודינמיות שונות בהשוואה לאנהידרטים34.
לפני הוספת NaHS למי השתייה, יש למדוד את רמת החומציות (pH) והטמפרטורה של הממס. יש לשפוך מיד את תמיסת ה-NaHS לתוך בקבוק המים לחולדות/עכברים בכלוב החיות. דגימות נאספו מהקצה ומפנימי בקבוק המים ב-0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 ו-24 שעות כדי למדוד את תכולת הסולפיד. מדידות הסולפיד נלקחו מיד לאחר כל דגימה. דגימות נלקחו מקצה הצינור מכיוון שכמה מחקרים הראו שגודל הנקבוביות הקטן של צינור המים יכול למזער את אידוי ה-H2S15,19. נראה כי בעיה זו חלה גם על התמיסה בבקבוק. עם זאת, זה לא היה המקרה עבור התמיסה בצוואר בקבוק המים, אשר הייתה בעלת קצב אידוי גבוה יותר והייתה אוטו-חמצון; למעשה, החיות שתו את המים הללו תחילה.
במחקר נעשה שימוש בחולדות ויסטאר זכרים ונקבות. החולדות שוכנו בכלובים מפוליפרופילן (2-3 חולדות בכלוב) בתנאים סטנדרטיים (טמפרטורה 21-26 מעלות צלזיוס, לחות 32-40%) עם 12 שעות של אור (7:00 עד 19:00) ו-12 שעות של חושך (19:00 עד 7:00). לחולדות הייתה גישה חופשית למי ברז והן ניזונו ממזון סטנדרטי (חברת Khorak Dam Pars, טהרן, איראן). חולדות ויסטאר בנות 6 חודשים (n=10, משקל גוף: 190-230 גרם) וזכרים (n=10, משקל גוף: 320-370 גרם) תואמות גיל (6 חודשים) חולקו באופן אקראי לקבוצות ביקורת וקבוצות שטופלו ב-NaHS (30 מיקרומולר) (n=5 לכל קבוצה). כדי לקבוע את גודל המדגם, השתמשנו בגישת KISS (Keep It Simple, Stupid), המשלבת ניסיון קודם וניתוח כוח. תחילה ערכנו מחקר פיילוט על 3 חולדות וקבענו את רמת הסולפיד הכוללת הממוצעת בסרום ואת סטיית התקן (8.1 ± 0.81 מיקרומולר). לאחר מכן, בהתחשב בעוצמה של 80% ובהנחה של רמת מובהקות דו-צדדית של 5%, קבענו גודל מדגם ראשוני (n = 5 בהתבסס על ספרות קודמת) התואם לגודל אפקט סטנדרטי של 2.02 עם הערך המוגדר מראש שהוצע על ידי Festing לחישוב גודל המדגם של חיות ניסוי 35. לאחר הכפלת ערך זה בסטיית התקן (2.02 × 0.81), גודל האפקט הניתן לזיהוי החזוי (1.6 מיקרומולר) היה 20%, דבר מקובל. משמעות הדבר היא ש-n = 5/קבוצה מספיק כדי לזהות שינוי ממוצע של 20% בין הקבוצות. חולדות חולקו באופן אקראי לקבוצות ביקורת וקבוצות שטופלו ב-NaSH באמצעות הפונקציה האקראית של תוכנת Excel 36 (איור משלים 1). סמיות בוצעה ברמת התוצאה, והחוקרים שביצעו את המדידות הביוכימיות לא היו מודעים להקצאות הקבוצות.
קבוצות ה-NaHS משני המינים טופלו בתמיסת NaHS בריכוז 30 מיקרומולר שהוכנה במי שתייה במשך שבועיים; תמיסה טרייה סופקה כל 24 שעות, ובמהלכן נמדד משקל הגוף. דגימות דם נאספו מקצות הזנב של כל החולדות תחת הרדמה של איזופלורן כל יומיים בסוף השבוע הראשון והשני. דגימות הדם עברו צנטריפוגה ב-3000 גרם למשך 10 דקות, הסרום הופרד ואוחסן ב-80°C- למדידה נוספת של אוריאה בסרום, קריאטינין (Cr) וסך גופרתי. אוריאה בסרום נקבעה בשיטת אוראז אנזימטית, וקריאטינין בסרום נקבע בשיטת Jaffe פוטומטרית באמצעות ערכות זמינות מסחרית (Man Company, טהרן, איראן) ומנתח אוטומטי (Selectra E, מספר סידורי 0-2124, הולנד). מקדמי השונות התוך- ובין-הניסויים עבור אוריאה ו-Cr היו פחות מ-2.5%.
שיטת מתילן כחול (MB) משמשת למדידת סולפיד כולל במי שתייה ובסרום המכילים NaHS; MB היא השיטה הנפוצה ביותר למדידת סולפיד בתמיסות בכמויות גדולות ובדגימות ביולוגיות11,37. ניתן להשתמש בשיטת MB כדי להעריך את מאגר הסולפידים הכולל38 ולמדוד סולפידים אנאורגניים בצורה של H2S, HS- ו-S2 בשלב המימי39. בשיטה זו, גופרית שוקעת כאבץ גופרתי (ZnS) בנוכחות אבץ אצטט11,38. שקיעה של אבץ אצטט היא השיטה הנפוצה ביותר להפרדת סולפידים מכרומופורים אחרים11. ZnS הומס מחדש באמצעות HCl11 בתנאים חומציים חזקים. הסולפיד מגיב עם DMPD ביחס סטוכיומטרי של 1:2 בתגובה המזורזת על ידי ברזל כלורי (Fe3+ פועל כחומר חמצון) ליצירת הצבע MB, אשר מזוהה ספקטרופוטומטרית ב-670 ננומטר40,41. גבול הגילוי של שיטת MB הוא כ-1 מיקרומולר.
במחקר זה, 100 מיקרוליטר מכל דגימה (תמיסה או סרום) נוספו למבחנה; לאחר מכן נוספו 200 מיקרוליטר של אבץ אצטט (1% משקל/נפח במים מזוקקים), 100 מיקרוליטר של DMPD (20 mM ב-7.2 M HCl) ו-133 מיקרוליטר של FeCl3 (30 mM ב-1.2 M HCl). התערובת הודגרה ב-37°C בחושך למשך 30 דקות. התמיסה סורכיזציה ב-10,000 גרם למשך 10 דקות, וספיגת הנוזל העל-תכליתי נקראה ב-670 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלטות (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). ריכוזי הסולפיד נקבעו באמצעות עקומת כיול של NaHS (0-100 מיקרומולר) ב-ddH2O (איור משלים 2). כל התמיסות ששימשו למדידות הוכנו טריות. מקדמי השונות התוך-קבוצתיים והבין-קבוצתיים עבור מדידות סולפיד היו 2.8% ו-3.4%, בהתאמה. כמו כן, קבענו את סך הסולפיד שהושג מדגימות מי שתייה וסרום המכילות נתרן תיוסולפט באמצעות שיטת הדגימה המועשרת42. התוצאות עבור דגימות מי שתייה וסרום המכילות נתרן תיוסולפט היו 91 ± 1.1% (n = 6) ו-93 ± 2.4% (n = 6), בהתאמה.
ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת GraphPad Prism גרסה 8.0.2 עבור Windows (GraphPad Software, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב, www.graphpad.com). מבחן t מזווג שימש להשוואת הטמפרטורה וה-pH של מי השתייה לפני ואחרי הוספת NaHS. אובדן ה-H2S בתמיסה המכילה NaHS חושב כיחס ירידה מספיגה בנקודת ההתחלה, וכדי להעריך האם האובדן היה מובהק סטטיסטית, ביצענו בדיקת ANOVA חד-כיוונית עם מדידות חוזרות ולאחריה מבחן ההשוואה המרובה של דאנט. משקל גוף, אוריאה בסרום, קריאטינין בסרום וסולפיד כולל בסרום לאורך זמן הושוו בין חולדות בקרה וחולדות שטופלו ב-NaHS ממינים שונים באמצעות בדיקת ANOVA מעורבת דו-כיוונית (בין-בתוך) ולאחריה מבחן Bonferroni פוסט הוק. ערכי P דו-צדדיים < 0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית.
רמת החומציות (pH) של מי השתייה הייתה 7.60 ± 0.01 לפני הוספת NaHS ו-7.71 ± 0.03 לאחר הוספת NaHS (n = 13, p = 0.0029). טמפרטורת מי השתייה הייתה 26.5 ± 0.2 וירדה ל-26.2 ± 0.2 לאחר הוספת NaHS (n = 13, p = 0.0128). הכינו תמיסת NaHS של 30 מיקרומולר במי שתייה ואחסנו אותה בבקבוק מים. תמיסת NaHS אינה יציבה וריכוזה יורד עם הזמן. בדגימה מצוואר בקבוק המים נצפתה ירידה משמעותית (68.0%) בתוך השעה הראשונה, ותכולת ה-NaHS בתמיסה ירדה ב-72% וב-75% לאחר 12 ו-24 שעות, בהתאמה. בדגימות שהתקבלו מבקבוקי מים, הירידה ב-NaHS לא הייתה משמעותית עד שעתיים, אך לאחר 12 ו-24 שעות היא ירדה ב-47% וב-72%, בהתאמה. נתונים אלה מצביעים על כך שאחוז ה-NaHS בתמיסה של 30 מיקרומולר שהוכנה במי שתייה ירד לכדי רבע מהערך ההתחלתי לאחר 24 שעות, ללא קשר למיקום הדגימה (איור 1).
יציבות תמיסת NaHS (30 מיקרומולר) במי שתייה בבקבוקי חולדה/עכבר. לאחר הכנת התמיסה, נלקחו דגימות מהקצה ומפנים בקבוק המים. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (n = 6/קבוצה). * ו-#, P < 0.05 בהשוואה לזמן 0. תצלום בקבוק המים מציג את הקצה (עם הפתח) ואת גוף הבקבוק. נפח הקצה הוא כ-740 מיקרוליטר.
ריכוז ה-NaHS בתמיסה הטרייה של 30 מיקרומולר היה 30.3 ± 0.4 מיקרומולר (טווח: 28.7–31.9 מיקרומולר, n = 12). עם זאת, לאחר 24 שעות, ריכוז ה-NaHS ירד לערך נמוך יותר (ממוצע: 3.0 ± 0.6 מיקרומולר). כפי שמוצג באיור 2, ריכוזי ה-NaHS שאליהם נחשפו החולדות לא היו קבועים במהלך תקופת המחקר.
משקל הגוף של החולדות הנקבות עלה משמעותית לאורך זמן (מ-205.2 ± 5.2 גרם ל-213.8 ± 7.0 גרם בקבוצת הביקורת ומ-204.0 ± 8.6 גרם ל-211.8 ± 7.5 גרם בקבוצת הטיפול ב-NaHS); עם זאת, לטיפול ב-NaHS לא הייתה השפעה על משקל הגוף (איור 3). משקל הגוף של החולדות הזכרות עלה משמעותית לאורך זמן (מ-338.6 ± 8.3 גרם ל-352.4 ± 6.0 גרם בקבוצת הביקורת ומ-352.4 ± 5.9 גרם ל-363.2 ± 4.3 גרם בקבוצת הטיפול ב-NaHS); עם זאת, לטיפול ב-NaHS לא הייתה השפעה על משקל הגוף (איור 3).
שינויים במשקל הגוף בחולדות נקבות וזכרים לאחר מתן NaHS (30 מיקרומולר). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM והושוו באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני מעורב (בתוך-בין) עם מבחן Bonferroni post hoc. n = 5 מכל מין בכל קבוצה.
ריכוזי האוריאה והקריאטין פוספט בסרום היו דומים בחולדות קבוצת הביקורת ובחולדות שטופלו ב-NaSH לאורך כל המחקר. יתר על כן, טיפול ב-NaSH לא השפיע על ריכוזי האוריאה והקריאטיןכרום בסרום (טבלה 1).
ריכוזי הסולפיד הכוללים בסרום בנקודת הבסיס היו דומים בין חולדות בקבוצת הביקורת לבין חולדות זכרים (8.1 ± 0.5 מיקרומולר לעומת 9.3 ± 0.2 מיקרומולר) ונקבות (9.1 ± 1.0 מיקרומולר לעומת 6.1 ± 1.1 מיקרומולר) שטופלו ב-NaHS. מתן NaHS במשך 14 ימים לא השפיע על רמות הסולפיד הכוללות בסרום, הן בחולדות זכרים והן בנקבות (איור 4).
שינויים בריכוזי הסולפיד הכוללים בסרום אצל חולדות זכרים ונקבות לאחר מתן NaHS (30 מיקרומולר). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM והושוו באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני מעורב (בתוך-בתוך) עם מבחן Bonferroni פוסט הוק. לכל מין, n = 5/קבוצה.
המסקנה העיקרית של מחקר זה היא שמי שתייה המכילים NaHS אינם יציבים: רק כרבע מתכולת הסולפיד ההתחלתית הכוללת ניתנת לזיהוי 24 שעות לאחר הדגימה מהקצה ובתוך בקבוקי מים של חולדות/עכברים. יתר על כן, חולדות נחשפו לריכוזי NaHS לא יציבים עקב אובדן H2S בתמיסת ה-NaHS, והוספת NaHS למי השתייה לא השפיעה על משקל הגוף, על רמות האוריאה והקריאטין כרום בסרום, או על רמות הסולפיד הכוללות בסרום.
במחקר זה, קצב אובדן ה-H2S מתמיסות NaHS בריכוז 30 מיקרומולר שהוכנו במי שתייה היה כ-3% לשעה. בתמיסה מבופרת (100 מיקרומולר נתרן גופרתי ב-10 mM PBS, pH 7.4), דווח כי ריכוז הגופרתי ירד ב-7% לאורך זמן במשך 8 שעות. בעבר הגנו על מתן NaHS תוך-צפקי על ידי דיווח כי קצב אובדן הגופרתי מתמיסת NaHS בריכוז 54 מיקרומולר במי שתייה היה כ-2.3% לשעה (4% לשעה ב-12 השעות הראשונות ו-1.4% לשעה ב-12 השעות האחרונות לאחר ההכנה). מחקרים קודמים מצאו אובדן קבוע של H2S מתמיסות NaHS, בעיקר עקב התנדפות וחמצון. גם ללא תוספת בועות, הגופרתי בתמיסת הבסיס אובד במהירות עקב התנדפות H2S. מחקרים הראו שבמהלך תהליך הדילול, האורך כ-30-60 שניות, כ-5-10% מה-H2S אובדים עקב אידוי6. כדי למנוע אידוי של H2S מהתמיסה, החוקרים נקטו במספר צעדים, כולל ערבוב עדין של התמיסה12, כיסוי תמיסת הבסיס בניילון6 ומזעור חשיפת התמיסה לאוויר, מכיוון שקצב אידוי ה-H2S תלוי בממשק האוויר-נוזל13. חמצון ספונטני של H2S מתרחש בעיקר עקב יוני מתכת מעבר, במיוחד ברזל ברזלי, שהם זיהומים במים13. חמצון של H2S גורם להיווצרות פוליסולפידים (אטומי גופרית המקושרים בקשרים קוולנטיים)11. כדי למנוע את חמצונו, מוכנים תמיסות המכילות H2S בממסים נטולי חמצון44,45 ולאחר מכן מטוהרים בארגון או חנקן למשך 20-30 דקות כדי להבטיח דה-חמצון.11,12,37,44,45,46 חומצה דיאתילןטריאמיןפנטאצטית (DTPA) היא כלאטור מתכתי (10-4 M) המונע חמצון עצמי של HS- בתמיסות אירוביות. בהיעדר DTPA, קצב החמצון האוטומטי של HS- הוא כ-50% במשך כ-3 שעות ב-25°C37,47. יתר על כן, מכיוון שחמצון 1e-סולפיד מזורז על ידי אור אולטרה סגול, יש לאחסן את התמיסה על קרח ולהגן עליה מפני אור11.
כפי שמוצג באיור 5, NaHS מתפרק ל-Na+ ו-HS-6 כאשר הוא מומס במים; דיסוציאציה זו נקבעת על ידי pK1 של התגובה, התלוי בטמפרטורה: pK1 = 3.122 + 1132/T, כאשר T נע בין 5 ל-30°C ונמדד במעלות קלווין (K), K = °C + 273.1548. ל-HS- יש pK2 גבוה (pK2 = 19), כך שב-pH < 96.49, S2- לא נוצר או נוצר בכמויות קטנות מאוד. לעומת זאת, HS- פועל כבסיס וקולט H+ ממולקולת H2O, ו-H2O פועל כחומצה ומומר ל-H2S ו-OH-.
היווצרות גז H2S מומס בתמיסת NaHS (30 מיקרומולר). aq, תמיסה מימית; g, גז; l, נוזל. כל החישובים מניחים ש-pH של המים = 7.0 וטמפרטורת המים = 20 מעלות צלזיוס. נוצר באמצעות BioRender.com.
למרות ראיות לכך שתמיסות NaHS אינן יציבות, מספר מחקרים בבעלי חיים השתמשו בתמיסות NaHS במי שתייה כתרכובת תורמת H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 עם משך התערבות שנעה בין שבוע ל-21 שבועות (טבלה 2). במהלך מחקרים אלה, תמיסת ה-NaHS חודשה כל 12 שעות, 15, 17, 18, 24, 25 שעות או 24 שעות, 19, 20, 21, 22, 23 שעות. תוצאותינו הראו שחולדות נחשפו לריכוזי תרופה לא יציבים עקב אובדן H2S מתמיסת ה-NaHS, ותכולת ה-NaHS במי השתייה של החולדות השתנתה באופן משמעותי במהלך 12 או 24 שעות (ראה איור 2). שניים ממחקרים אלה דיווחו כי רמות H2S במים נותרו יציבות במשך 24 שעות ביממה או שנצפו רק 2-3% אובדן H2S במשך 12 שעות ביממה, אך הם לא סיפקו נתונים תומכים או פרטי מדידה. שני מחקרים הראו כי קוטר קטן של בקבוקי מים יכול למזער את אידוי ה-H2S15,19. עם זאת, תוצאותינו הראו כי הדבר עשוי לעכב את אובדן ה-H2S מבקבוק מים רק בשעתיים ולא 12-24 שעות. שני המחקרים מציינים כי אנו מניחים שרמת ה-NaHS במי השתייה לא השתנתה מכיוון שלא ראינו שינוי צבע במים; לכן, חמצון ה-H2S על ידי אוויר לא היה משמעותי19,20. באופן מפתיע, שיטה סובייקטיבית זו מעריכה את יציבות ה-NaHS במים במקום למדוד את השינוי בריכוזו לאורך זמן.
אובדן ה-H2S בתמיסת NaHS קשור ל-pH ולטמפרטורה. כפי שצוין במחקר שלנו, המסת NaHS במים גורמת להיווצרות תמיסה בסיסית50. כאשר NaHS מומס במים, היווצרות גז H2S מומס תלויה בערך ה-pH6. ככל ש-pH של התמיסה נמוך יותר, כך שיעור ה-NaHS הקיים כמולקולות גז H2S גדול יותר, וכך אובד יותר גופרתי מהתמיסה המימית11. אף אחד מהמחקרים הללו לא דיווח על ה-pH של מי שתייה המשמשים כממס ל-NaHS. על פי המלצות ארגון הבריאות העולמי, שאומצו על ידי רוב המדינות, ה-pH של מי שתייה צריך להיות בטווח 6.5-8.551. בטווח pH זה, קצב החמצון הספונטני של H2S עולה פי עשרה בקירוב13. המסת NaHS במים בטווח pH זה תגרום לריכוז גז H2S מומס של 1 עד 22.5 מיקרומולר, דבר המדגיש את החשיבות של ניטור ה-pH של המים לפני המסת NaHS. בנוסף, טווח הטמפרטורות שדווח במחקר הנ"ל (18-26 מעלות צלזיוס) יביא לשינוי של כ-10% בריכוז גז ה-H2S המומס בתמיסה, מכיוון ששינויי טמפרטורה משנים את pK1, ושינויים קטנים ב-pK1 יכולים להשפיע באופן משמעותי על ריכוז גז ה-H2S המומס48. בנוסף, משך הזמן הארוך של חלק מהמחקרים (5 חודשים)22, שבמהלכם צפויה שונות גדולה בטמפרטורה, מחריף גם הוא בעיה זו.
כל המחקרים מלבד אחד21 השתמשו בתמיסת NaHS של 30 מיקרומולר במי שתייה. כדי להסביר את המינון בו נעשה שימוש (כלומר 30 מיקרומולר), חלק מהמחברים ציינו ש-NaHS בשלב המימי מייצר בדיוק את אותו ריכוז של גז H2S ושהטווח הפיזיולוגי של H2S הוא 10 עד 100 מיקרומולר, כך שמינון זה נמצא בטווח הפיזיולוגי15,16. אחרים הסבירו ש-30 מיקרומולר NaHS יכול לשמור על רמת H2S בפלזמה בטווח הפיזיולוגי, כלומר 5-300 מיקרומולר19,20. אנו לוקחים בחשבון את ריכוז ה-NaHS במים של 30 מיקרומולר (pH = 7.0, T = 20 מעלות צלזיוס), אשר שימש בכמה מחקרים לחקר השפעות ה-H2S. אנו יכולים לחשב שריכוז גז ה-H2S המומס הוא 14.7 מיקרומולר, שהם כ-50% מריכוז ה-NaHS ההתחלתי. ערך זה דומה לערך שחושב על ידי מחברים אחרים באותם תנאים13,48.
במחקר שלנו, מתן NaHS לא שינה את משקל הגוף; תוצאה זו עולה בקנה אחד עם תוצאות מחקרים אחרים בעכברים זכרים22,23 ובחולדות זכרים18; עם זאת, שני מחקרים דיווחו כי NaSH החזיר את משקל הגוף הירידה בחולדות שעברו כריתת כליה24,26, בעוד שמחקרים אחרים לא דיווחו על השפעת מתן NaSH על משקל הגוף15,16,17,19,20,21,25. יתר על כן, במחקר שלנו, מתן NaSH לא השפיע על רמות האוריאה והקריאטין כרום בסרום, דבר התואם את תוצאותיו של דוח אחר25.
המחקר מצא כי הוספת NaHS למי שתייה במשך שבועיים לא השפיעה על ריכוזי הסולפיד הכוללים בסרום אצל חולדות זכרים ונקבות. ממצא זה עולה בקנה אחד עם תוצאותיהם של Sen וחב' (16): 8 שבועות של טיפול עם 30 מיקרומולר NaHS במי שתייה לא השפיעו על רמות הסולפיד בפלזמה אצל חולדות ביקורת; עם זאת, הם דיווחו כי התערבות זו החזירה את רמות ה-H2S המופחתות בפלזמה של עכברים שעברו כריתת כליה. Li וחב' (22) דיווחו גם כי טיפול עם 30 מיקרומולר NaHS במי שתייה במשך 5 חודשים העלה את רמות הסולפיד החופשי בפלזמה אצל עכברים מבוגרים בכ-26%. מחקרים אחרים לא דיווחו על שינויים בסולפיד במחזור הדם לאחר הוספת NaHS למי שתייה.
שבעה מחקרים דיווחו על שימוש ב-Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 אך לא סיפקו פרטים נוספים על מי ההידרציה, וחמישה מחקרים לא הזכירו את מקור ה-NaHS בו השתמשו בשיטות ההכנה שלהם17,18,24,25,26. NaHS היא מולקולה מימית ותכולת מי ההידרציה שלה יכולה להשתנות, דבר המשפיע על כמות ה-NaHS הנדרשת להכנת תמיסה בעלת מולריות נתונה. לדוגמה, תכולת ה-NaHS במחקר שלנו הייתה NaHS•1.3 H2O. לכן, ריכוזי ה-NaHS בפועל במחקרים אלה עשויים להיות נמוכים מאלה שדווחו.
"כיצד יכולה תרכובת קצרת מועד כל כך להיות בעלת השפעה כה ארוכת טווח?" פוזגיי ועמיתיו שאלו שאלה זו בעת העריכת השפעות ה-NaHS על קוליטיס בעכברים. הם מקווים שמחקרים עתידיים יוכלו לענות על שאלה זו ולשער שתמיסות NaHS עשויות להכיל פוליסולפידים יציבים יותר בנוסף ל-H2S והדיסולפידים המתווכים את השפעת ה-NaHS21. אפשרות נוספת היא שגם ריכוזים נמוכים מאוד של NaHS שנותרו בתמיסה עשויים להיות בעלי השפעה מיטיבה. למעשה, אולסון ועמיתיו סיפקו ראיות לכך שרמות מיקרומולריות של H2S בדם אינן פיזיולוגיות וצריכות להיות בטווח הננומולרי או להיעדר לחלוטין13. H2S עשוי לפעול באמצעות סולפציה של חלבונים, שינוי הפיך לאחר התרגום המשפיע על התפקוד, היציבות והמיקום של חלבונים רבים52,53,54. למעשה, בתנאים פיזיולוגיים, כ-10% עד 25% מחלבוני כבד רבים עוברים סולפציה53. שני המחקרים מכירים בהרס המהיר של NaHS19,23 אך באופן מפתיע קובעים כי "שלטנו על ריכוז ה-NaHS במי השתייה על ידי החלפתו מדי יום".23 מחקר אחד קבע בטעות כי "NaHS הוא תורם H2S סטנדרטי ומשמש בדרך כלל בפרקטיקה הקלינית כדי להחליף את H2S עצמו".18
הדיון לעיל מראה כי NaHS אובד מהתמיסה באמצעות התנדפות, חמצון ופוטוליזה, ולכן מוצעות מספר הצעות להפחתת אובדן ה-H2S מהתמיסה. ראשית, אידוי ה-H2S תלוי בממשק גז-נוזל13 וב-pH של התמיסה11; לכן, כדי למזער את אובדן האידוי, ניתן להפוך את צוואר בקבוק המים לקטן ככל האפשר כפי שתואר קודם לכן15,19, וניתן להתאים את רמת ה-pH של המים לגבול עליון מקובל (כלומר, 6.5-8.551) כדי למזער את אובדן האידוי11. שנית, חמצון ספונטני של H2S מתרחש עקב השפעות החמצן ונוכחות יוני מתכות מעבר במי שתייה13, כך שהסרת חמצון ממי שתייה עם ארגון או חנקן44,45 ושימוש בכלאטורים של מתכות37,47 יכולים להפחית את חמצון הסולפידים. שלישית, כדי למנוע פירוק פוטולי של H2S, ניתן לעטוף בקבוקי מים בנייר אלומיניום; נוהג זה חל גם על חומרים רגישים לאור כגון סטרפטוזוטוצין55. לבסוף, ניתן לתת מלחי גופרתי אנאורגניים (NaHS, Na2S ו-CaS) דרך זרע במקום להמיס אותם במי שתייה כפי שדווח בעבר56,57,58; מחקרים הראו כי נתרן גופרתי רדיואקטיבי הניתן דרך זרע לחולדות נספג היטב ומופץ כמעט לכל הרקמות59. עד כה, רוב המחקרים נתנו מלחי גופרתי אנאורגניים תוך-צפקיים; עם זאת, דרך מתן זו נמצאת בשימוש לעתים רחוקות בסביבות קליניות60. מצד שני, הדרך הפומית היא דרך המתן הנפוצה והמועדפת ביותר בבני אדם61. לכן, אנו ממליצים להעריך את השפעות תורמי H2S במכרסמים באמצעות זרע פומי.
מגבלה אחת היא שמדדנו גופרתי בתמיסה מימית ובסרום באמצעות שיטת MB. השיטות למדידת גופרתי כוללות טיטרציה של יוד, ספקטרופוטומטריה, שיטה אלקטרוכימית (פוטנציומטריה, אמפרומטריה, שיטה קולומטרית ושיטה אמפרומטרית) וכרומטוגרפיה (כרומטוגרפיית גז וכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים), שביניהן השיטה הנפוצה ביותר היא שיטת הספקטרופוטומטריה של MB62. מגבלה של שיטת MB למדידת H2S בדגימות ביולוגיות היא שהיא מודדת את כל התרכובות המכילות גופרית ולא H2S חופשי63 מכיוון שהיא מבוצעת בתנאים חומציים, וכתוצאה מכך מפיקים גופרית מהמקור הביולוגי64. עם זאת, על פי איגוד בריאות הציבור האמריקאי, MB היא השיטה הסטנדרטית למדידת גופרתי במים65. לכן, מגבלה זו אינה משפיעה על התוצאות העיקריות שלנו לגבי חוסר היציבות של תמיסות המכילות NaHS. יתר על כן, במחקר שלנו, שיעור ההתאוששות של מדידות גופרתי בדגימות מים וסרום המכילות NaHS היה 91% ו-93%, בהתאמה. ערכים אלה תואמים טווחים שדווחו בעבר (77–92)66, דבר המצביע על דיוק אנליטי מקובל42. ראוי לציין כי השתמשנו בחולדות זכרים ונקבות כאחד, בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH), כדי להימנע מהסתמכות יתר על מחקרים בבעלי חיים בזכרים בלבד במחקרים פרה-קליניים67 ולכלול חולדות זכרים ונקבות כאחד במידת האפשר68. נקודה זו הודגשה על ידי אחרים69,70,71.
לסיכום, תוצאות מחקר זה מצביעות על כך שלא ניתן להשתמש בתמיסות NaHS שהוכנו ממי שתייה לייצור H2S עקב חוסר היציבות שלהן. דרך מתן זו תחשוף בעלי חיים לרמות לא יציבות ונמוכות מהצפוי של NaHS; לכן, ייתכן שהממצאים אינם רלוונטיים לבני אדם.
מערכי הנתונים ששימשו ו/או נותחו במהלך המחקר הנוכחי זמינים מהמחבר המתאים על פי בקשה סבירה.
סאבו, ק. ציר זמן של מחקר מימן גופרתי (H2S): מרעלן סביבתי למתווך ביולוגי. ביוכימיה ופרמקולוגיה 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. and Kimura, H. תפקיד אפשרי של מימן גופרתי כנוירומודולטור אנדוגני. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. and Papapetropoulos, A. תפקיד פיזיולוגי של מימן גופרתי בתאים, רקמות ואיברים של יונקים. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
דילון, ק.מ., קראזון, ר.ג'., מטסון, ג'.ב., וקאשפי, ק. הבטחה מתפתחת למערכות אספקה ​​תאיות של תחמוצת חנקן ומימן גופרתי: עידן חדש של רפואה מותאמת אישית. ביוכימיה ופרמקולוגיה 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
סאן, X., ואחרים. מתן ארוך טווח של תורם מימן גופרתי בשחרור איטי יכול למנוע פגיעה באיסכמיה/רפרפוזיה של שריר הלב. דוחות מדעיים 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM and Hermann, A. זרחון ערוץ BK מווסת את רגישות מימן גופרתי (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM and Hermann, A. מימן גופרתי משפר את פעילות תעלת האשלגן המופעל על ידי סידן (BK) בתאי גידול של בלוטת יותרת המוח בחולדות. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
ג'די, ש., ואחרים. מימן גופרתי מגביר את ההשפעה המגנה של ניטריט מפני פגיעה עקב איסכמיה-רפרפוזיה של שריר הלב בחולדות סוכרתיות מסוג 2. תחמוצת החנקן 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
קורבינו, א., ואחרים. מגמות בכימיה של תורמי H2S והשפעתה על מחלות לב וכלי דם. נוגדי חמצון 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, and Olson, KR (2012). הפסדים פסיביים של מימן גופרתי בניסויים ביולוגיים. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
נאגי, פ., ואחרים. היבטים כימיים של מדידות מימן גופרתי בדגימות פיזיולוגיות. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
קליין, LL.D. קביעה ספקטרופוטומטרית של מימן גופרתי במים טבעיים. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
אולסון, ק.ר. (2012). הכשרה מעשית בכימיה וביולוגיה של מימן גופרתי. "נוגדי חמצון". איתות חמצון-חיזור. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).