דיווחנו בעבר כי רמות הסרום של מטבוליט טריפטופן שמקורו במעי, חומצה אינדול-3-פרופיונית (IPA), נמוכות יותר בחולים עם פיברוזיס כבד. במחקר זה, חקרנו את הטרנסקריפטום ואת מתילום ה-DNA בכבדים שמנים ביחס לרמות IPA בסרום, כמו גם את תפקידו של IPA בגרימת אי-אקטיבציה פנוטיפית של תאי כוכבי כבד (HSCs) במבחנה.
המחקר כלל 116 חולים הסובלים מהשמנת יתר ללא סוכרת מסוג 2 (T2DM) (גיל 46.8 ± 9.3 שנים; BMI: 42.7 ± 5.0 ק"ג/מ"ר) שעברו ניתוח בריאטרי במרכז הכירורגי הבריאטרי בקופיו (KOBS). רמות ה-IPA במחזור הדם נמדדו באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים-ספקטרומטריית מסות (LC-MS), ניתוח טרנסקריפטום של הכבד בוצע באמצעות ריצוף RNA כולל, וניתוח מתילציה של DNA בוצע באמצעות ה-Infinium HumanMethylation450 BeadChip. תאי כוכב כבד אנושיים (LX-2) שימשו לניסויים חוץ גופיים.
רמות IPA בסרום היו בקורלציה עם ביטוי של גנים המעורבים במסלולים אפופטוטיים, מיטופגיים ואריכות ימים בכבד. הגן AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) היה הגן הנפוץ והדומיננטי ביותר בעל האינטראקציה בתעתיק הכבד ובפרופילי מתילציה של ה-DNA. טיפול ב-IPA גרם לאפופטוזיס, להפחתת הנשימה המיטוכונדריאלית ולשינוי מורפולוגיה של תאים ודינמיקה מיטוכונדריאלית על ידי ויסות הביטוי של גנים הידועים כמווסתים פיברוזיס, אפופטוזיס והישרדות של תאי LX-2.
יחד, נתונים אלה תומכים בכך של-IPA יש השפעות טיפוליות פוטנציאליות והוא יכול לגרום לאפופטוזיס ולהסיט את הפנוטיפ של HSC למצב לא פעיל, ובכך להרחיב את האפשרות לעיכוב פיברוזיס כבד על ידי הפרעה להפעלת HSC ולמטבוליזם המיטוכונדריאלי.
שכיחות ההשמנה והתסמונת המטבולית נקשרה לעלייה בשכיחות של מחלת כבד שומני הקשורה מטבולית (MASLD); המחלה משפיעה על 25% עד 30% מהאוכלוסייה הכללית [1]. התוצאה העיקרית של האטיולוגיה של MASLD היא פיברוזיס כבד, תהליך דינמי המאופיין בהצטברות מתמשכת של מטריצה ​​חוץ-תאית סיבית (ECM) [2]. התאים העיקריים המעורבים בפיברוזיס כבד הם תאי כוכבי כבד (HSCs), המציגים ארבעה פנוטיפים ידועים: שקטה, מופעלת, לא מופעלת ומזדקנת [3, 4]. תאי HSC יכולים להיות מופעלים ולהתמיין מצורה שקטה לתאים דמויי פיברובלסטים מתרבים בעלי דרישות אנרגיה גבוהות, עם ביטוי מוגבר של α-אקטין שריר חלק (α-SMA) וקולגן מסוג I (Col-I) [5, 6]. במהלך היפוך פיברוזיס כבד, תאי HSC מופעלים מסולקים באמצעות אפופטוזיס או השבתה. תהליכים אלה כוללים ירידה בוויסות של גנים פיברוגניים ומודולציה של גנים פרו-הישרדותיים (כגון מסלולי איתות NF-κB ו-PI3K/Akt) [7, 8], כמו גם שינויים בדינמיקה ובתפקוד המיטוכונדריאלי [9].
רמות בסרום של מטבוליט הטריפטופן, חומצה אינדול-3-פרופיונית (IPA), המיוצר במעי, נמצאו כפחותות במחלות מטבוליות אנושיות, כולל MASLD [10-13]. IPA קשור לצריכת סיבים תזונתיים, ידוע בהשפעותיו נוגדות החמצון והאנטי-דלקתיות, ומחליש את הפנוטיפ של סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH) הנגרמת על ידי תזונה in vivo וב-in vitro [11-14]. עדויות מסוימות מגיעות ממחקר קודם שלנו, שהראה שרמות IPA בסרום היו נמוכות יותר בחולים עם פיברוזיס כבד מאשר בחולים שמנים ללא פיברוזיס כבד במחקר הניתוחים הבריאטריים של קואופיו (KOBS). יתר על כן, הראינו שטיפול ב-IPA יכול להפחית את הביטוי של גנים שהם סמנים קלאסיים של הידבקות תאים, נדידת תאים והפעלת תאי גזע המטופויאטיים במודל תאי כוכבי כבד אנושי (LX-2) והוא מטבוליט פוטנציאלי להגנת הכבד [15]. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד IPA גורם לרגרסיה של פיברוזיס כבד על ידי הפעלת אפופטוזיס של HSC וביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית.
כאן, אנו מדגימים כי IPA בסרום קשור לביטוי של גנים מועשרים במסלולי אפופטוזיס, מיטופגיה ואריכות ימים בכבד של אנשים הסובלים מהשמנת יתר אך ללא סוכרת מסוג 2 (KOBS). יתר על כן, מצאנו כי IPA יכול לגרום לפינוי ופירוק של תאי גזע המטופויאטיים (HSCs) מופעלים דרך מסלול האינאקטיבציה. תוצאות אלו חושפות תפקיד חדש ל-IPA, מה שהופך אותו למטרה טיפולית פוטנציאלית לקידום נסיגת פיברוזיס בכבד.
מחקר קודם בקבוצת KOBS הראה כי לחולים עם פיברוזיס כבד היו רמות IPA נמוכות יותר במחזור הדם בהשוואה לחולים ללא פיברוזיס כבד [15]. כדי לשלול את ההשפעה המבלבלת הפוטנציאלית של סוכרת מסוג 2, גייסנו 116 חולים שמנים ללא סוכרת מסוג 2 (גיל ממוצע ± סטיית תקן: 46.8 ± 9.3 שנים; BMI: 42.7 ± 5.0 ק"ג/מ"ר) (טבלה 1) ממחקר KOBS המתמשך כאוכלוסיית המחקר [16]. כל המשתתפים נתנו הסכמה מדעת בכתב ופרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המחוזי צפון סאבו בהתאם להצהרת הלסינקי (54/2005, 104/2008 ו-27/2010).
דגימות ביופסיה של כבד נאספו במהלך ניתוח בריאטרי ונבדקו היסטולוגית על ידי פתולוגים מנוסים בהתאם לקריטריונים שתוארו קודם לכן [17, 18]. קריטריוני ההערכה מסוכמים בטבלה המשלימה S1 ותוארו בעבר [19].
דגימות סרום בצום נותחו באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים לא ממוקדת-ספקטרומטריית מסות (LC-MS) לצורך ניתוח מטבולומיקה (n = 116). הדגימות נותחו באמצעות מערכת UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) כמתואר קודם לכן19. זיהוי אלכוהול איזופרופילי (IPA) התבסס על זמן שמירה והשוואה של ספקטרום MS/MS עם סטנדרטים טהורים. עוצמת אות ה-IPA (שטח השיא) נלקחה בחשבון בכל הניתוחים הנוספים [20].
ריצוף RNA של כבד שלם בוצע באמצעות Illumina HiSeq 2500 והנתונים עברו עיבוד מקדים כמתואר קודם לכן [19, 21, 22]. ביצענו ניתוח ביטוי דיפרנציאלי ממוקד של תמלילים המשפיעים על תפקוד/ביוגנזה מיטוכונדריה באמצעות 1957 גנים שנבחרו ממסד הנתונים MitoMiner 4.0 [23]. ניתוח מתילציה של DNA בכבד בוצע באמצעות Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב) תוך שימוש באותה מתודולוגיה שתוארה קודם לכן [24, 25].
תאי כוכב כבד אנושיים (LX-2) סופקו באדיבותו של פרופ' סטפנו רומיאו וגודלו ונשמרו במדיום DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). כדי לבחור את מינון ה-IPA המתאים, תאי LX-2 טופלו בריכוזים שונים של IPA (10 מיקרומולר, 100 מיקרומולר ו-1 mM; Sigma, 220027) במדיום DMEM/F12 למשך 24 שעות. יתר על כן, כדי לחקור את יכולתו של IPA להשבית תאי HSC, תאי LX-2 טופלו במקביל ב-5 ננוגרם/מ"ל TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) ו-1 mM IPA במדיום נטול סרום למשך 24 שעות. עבור בקרות הרכב המתאימות, נעשה שימוש ב-4 nM HCL המכיל 0.1% BSA לטיפול ב-TGF-β1 ו-0.05% DMSO לטיפול ב-IPA, ושניהם שימשו יחד לטיפול המשולב.
אפופטוזיס הוערך באמצעות ערכת גילוי אפופטוזיס FITC Annexin V עם 7-AAD (Biolegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב, מספר קטלוגי 640922) בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, LX-2 (1 × 105 תאים/באר) גודלו למשך הלילה בצלחות של 12 בארות ולאחר מכן טופלו במינונים מרובים של IPA או IPA ו-TGF-β1. למחרת, תאים צפים ודבוקים נאספו, עברו טריפסין, נשטפו עם PBS, הושעו מחדש בבופר קשירה של Annexin V, והודגרו עם FITC-Annexin V ו-7-AAD למשך 15 דקות.
מיטוכונדריה בתאים חיים נצבעו לפעילות חמצונית באמצעות Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, קרלסבד, קליפורניה). עבור מבחני MTR, תאי LX-2 הודגרו בצפיפויות שוות עם IPA ו-TGF-β1. לאחר 24 שעות, תאים חיים עברו טריפסין, נשטפו עם PBS, ולאחר מכן הודגרו עם 100 מיקרומולר MTR במדיום נטול סרום ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כמתואר קודם לכן [26]. עבור ניתוח מורפולוגיה של תאים חיים, גודל התא ומורכבות הציטופלזמה נותחו באמצעות פרמטרים של פיזור קדמי (FSC) ופיזור צדדי (SSC), בהתאמה.
כל הנתונים (30,000 אירועים) נאספו באמצעות NovoCyte Quanteon (Agilent) ונותחו באמצעות תוכנות NovoExpress® 1.4.1 או FlowJo V.10.
קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב החמצה החוץ-תאית (ECAR) נמדדו בזמן אמת באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי של Seahorse (Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה) המצויד ב-Seahorse XF Cell Mito Stress בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, 2 × 104 תאי LX-2/באר נזרעו על גבי פלטות תרבית תאים XF96. לאחר דגירה למשך הלילה, התאים טופלו באיזופרופנול (IPA) וב-TGF-β1 (שיטות משלימות 1). ניתוח הנתונים בוצע באמצעות תוכנת Seahorse XF Wave, הכוללת את מחולל דוחות בדיקת פנוטיפ אנרגטי של תאי Seahorse XF. מכך חושב מדד בריאות ביו-אנרגטי (BHI) [27].
RNA כולל תועתק ל-cDNA. לשיטות ספציפיות, ראו מקור [15]. רמות mRNA של חלבון חומצי ריבוזומלי 60S P0 (RPLP0) וציקלופילין A1 (PPIA) שימשו כבקרות גנים קונסטיטוטיביות. מערכת QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, הולנד) שימשה עם ערכת TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) או ערכת Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), וקיפול ביטוי גנים יחסי חושב באמצעות פרמטרים השוואתיים של ערך Ct (ΔΔCt) ושיטת ∆∆Ct. פרטים על הפריימרים מסופקים בטבלאות המשלימות S2 ו-S3.
DNA גרעיני (ncDNA) ו-DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) חולצו באמצעות ערכת הדם והרקמות DNeasy (Qiagen) כפי שתואר קודם לכן [28]. הכמות היחסית של mtDNA חושבה על ידי חישוב היחס בין כל אזור mtDNA מטרה לממוצע הגיאומטרי של שלושת אזורי ה-DNA הגרעיני (mtDNA/ncDNA), כמפורט בשיטות המשלימות 2. פרטים על הפריימרים עבור mtDNA ו-ncDNA מסופקים בטבלה המשלימה S4.
תאים חיים נצבעו ב-Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, קרלסבד, קליפורניה) כדי להמחיש רשתות מיטוכונדריאליות בין-תאיות ותאיות. תאי LX-2 (1 × 104 תאים/באר) גודלו על גבי שקופיות זכוכית בצלחות תרבית בעלות תחתית זכוכית מתאימות (Ibidi GmbH, מרטינסריד, גרמניה). לאחר 24 שעות, תאי LX-2 חיים הודגרו עם 100 מיקרומולר MTR למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס וגרעיני התא נצבעו ב-DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל, Sigma-Aldrich) כמתואר קודם לכן [29]. רשתות מיטוכונדריאליות נצבעו באמצעות מיקרוסקופ הפוך Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, ינה, גרמניה) המצויד במודול קונפוקלי Zeiss LSM 800 ב-37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2 באמצעות עדשה 63×NA 1.3. השגנו עשר תמונות מסדרת Z עבור כל סוג דגימה. כל סדרת Z מכילה 30 מקטעים, כל אחד בעובי של 9.86 מיקרון. עבור כל דגימה, תמונות של עשרה שדות ראייה שונים נרכשו באמצעות תוכנת ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, ינה, גרמניה), וניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בוצע באמצעות תוכנת ImageJ (גרסה 1.54d) [30, 31] בהתאם לפרמטרים המפורטים בשיטות המשלימות 3.
התאים קובעו באמצעות 2% גלוטראלדהיד בתמיסת בופר פוספט 0.1 M, ולאחר מכן קובעו באמצעות תמיסת אוסמיום טטרוקסיד 1% (Sigma Aldrich, מיזורי, ארה"ב), מיובשים בהדרגה באמצעות אצטון (Merck, דרמשטט, גרמניה), ולבסוף שובצו בשרף אפוקסי. חתכים דקים במיוחד הוכנו ונצבעו ב-1% אורניל אצטט (Merck, דרמשטט, גרמניה) וב-1% עופרת ציטרט (Merck, דרמשטט, גרמניה). תמונות אולטרה-מבניות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, טוקיו, יפן) במתח תאוצה של 80 קילו-וולט.
המורפולוגיה של תאי LX-2 שטופלו ב-IPA במשך 24 שעות נותחה באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 50 באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך של Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 ו-AxioCam MRm, ינה, גרמניה).
נתונים קליניים באו לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן או חציון (טווח בין-רבעוני: IQR). ניתוח שונות חד-כיווני (משתנים רציפים) או מבחן χ² (משתנים קטגוריים) שימשו להשוואת ההבדלים בין שלוש קבוצות המחקר. שיעור החיובי השגוי (FDR) שימש לתיקון עבור בדיקות מרובות, וגנים עם FDR < 0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית. ניתוח מתאם ספירמן שימש לקורלציה של מתילציה של DNA CpG עם עוצמת אות IPA, כאשר ערכי p נומינליים (p < 0.05) דווחו.
ניתוח מסלול הגידול בוצע באמצעות כלי ניתוח גנים מבוסס-אינטרנט (WebGestalt) עבור 268 תמלילים (p נומינלי < 0.01), 119 תמלילים הקשורים למיטוכונדריה (p נומינלי < 0.05) ו-4350 CpG מתוך 3093 תמלילי כבד שהיו קשורים לרמות IPA בסרום. כלי Venny DB (גרסה 2.1.0) הזמין בחינם שימש למציאת גנים חופפים, ו-StringDB (גרסה 11.5) שימש להמחשת אינטראקציות חלבון-חלבון.
עבור ניסוי LX-2, הדגימות נבדקו לנורמליות באמצעות מבחן ד'אגוסטינו-פירסון. הנתונים התקבלו משלושה חזרות ביולוגיות לפחות ועברו ANOVA חד-כיווני עם מבחן בונפרוני פוסט הוק. ערך p של פחות מ-0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן, ומספר הניסויים מצוין בכל איור. כל הניתוחים והגרפים בוצעו באמצעות תוכנת הסטטיסטיקה GraphPad Prism 8 עבור Windows (GraphPad Software Inc., גרסה 8.4.3, סן דייגו, ארה"ב).
ראשית, חקרנו את הקשר בין רמות IPA בסרום לבין תעתיקים של הכבד, הגוף כולו והמיטוכונדריה. בפרופיל התעתיק הכולל, הגן החזק ביותר הקשור לרמות IPA בסרום היה MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3); בפרופיל התעתיק הקשור למיטוכונדריה, הגן הקשור החזק ביותר היה AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (קובץ נוסף 1 וקובץ נוסף 2).
לאחר מכן ניתחנו תמלילים גלובליים (n = 268; p < 0.01) ותמלילים הקשורים למיטוכונדריה (n = 119; p < 0.05), ובסופו של דבר זיהינו אפופטוזיס כמסלול הקנוני המשמעותי ביותר (p = 0.0089). עבור תמלילים מיטוכונדריאליים הקשורים לרמות IPA בסרום, התמקדנו באפופטוזיס (FDR = 0.00001), מיטופגיה (FDR = 0.00029) ומסלולי איתות TNF (FDR = 0.000006) (איור 1A, טבלה 2, ואיורים משלימים 1A-B).
ניתוח חפיפה של תמלילים גלובליים הקשורים למיטוכונדריה, ומתילציה של DNA בכבד אנושי בקשר לרמות IPA בסרום. A מייצג 268 תמלילים גלובליים, 119 תמלילים הקשורים למיטוכונדריה, ותמלילים מתילצי DNA הממופים ל-3092 אתרי CpG הקשורים לרמות IPA בסרום (ערכי p < 0.01 עבור תמלילים גלובליים ו-DNA מתילצי, וערכי p < 0.05 עבור תמלילים מיטוכונדריאליים). התמלילים החופפים העיקריים מוצגים באמצע (AKT1 ו-YKT6). B מפת האינטראקציה של 13 הגנים עם ציון האינטראקציה הגבוה ביותר (0.900) עם גנים אחרים נבנתה מ-56 הגנים החופפים (אזור הקו השחור) שהיו קשורים באופן מובהק לרמות IPA בסרום באמצעות הכלי המקוון StringDB. ירוק: גנים הממופים לרכיב התאי של אונטולוגיה גנטית (GO): מיטוכונדריה (GO:0005739). AKT1 הוא החלבון עם הציון הגבוה ביותר (0.900) עבור אינטראקציות עם חלבונים אחרים בהתבסס על הנתונים (בהתבסס על כריית טקסט, ניסויים, מסדי נתונים וביטוי משותף). צמתי הרשת מייצגים חלבונים, וקצוות מייצגים קשרים בין חלבונים.
מאחר ומטבוליטים של מיקרוביוטת המעיים יכולים לווסת את ההרכב האפיגנטי באמצעות מתילציה של DNA [32], בדקנו האם רמות IPA בסרום קשורות למתילציה של DNA בכבד. מצאנו ששני אתרי המתילציה העיקריים הקשורים לרמות IPA בסרום היו ליד אזור עשיר בפרולין-סרין 3 (C19orf55) ומשפחת חלבון הלם חום B (קטן) חבר 6 (HSPB6) (קובץ נוסף 3). מתילציה של DNA של 4350 CpG (p < 0.01) הייתה בקורלציה עם רמות IPA בסרום והייתה מועשרת במסלולי ויסות אריכות ימים (p = 0.006) (איור 1A, טבלה 2, ואיור משלים 1C).
כדי להבין את המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס הקשרים בין רמות IPA בסרום, תמלילים גלובליים, תמלילים הקשורים למיטוכונדריה ומתילציה של DNA בכבד אנושי, ביצענו ניתוח חפיפה של הגנים שזוהו בניתוח המסלול הקודם (איור 1A). תוצאות ניתוח העשרת המסלולים של 56 הגנים החופפים (בתוך הקו השחור באיור 1A) הראו שמסלול האפופטוזיס (p = 0.00029) הדגיש שני גנים משותפים לשלושת הניתוחים: AKT1 ו-YKT6 (הומולוג YKT6 v-SNARE), כפי שמוצג בדיאגרמת ון (איור משלים 2 ואיור 1A). מעניין לציין, שמצאנו ש-AKT1 (cg19831386) ו-YKT6 (cg24161647) היו בקורלציה חיובית עם רמות IPA בסרום (קובץ נוסף 3). כדי לזהות אינטראקציות חלבוניות פוטנציאליות בין תוצרי גנים, בחרנו 13 גנים עם ציון האזור המשותף הגבוה ביותר (0.900) מבין 56 גנים חופפים כקלט ובנינו מפת אינטראקציה. לפי רמת הביטחון (ביטחון שולי), הגן AKT1 עם הציון הגבוה ביותר (0.900) היה בראש הרשימה (איור 1B).
בהתבסס על ניתוח המסלול, מצאנו שאפופטוזיס היה המסלול העיקרי, ולכן בדקנו האם טיפול ב-IPA ישפיע על האפופטוזיס של תאי HSC במבחנה. בעבר הדגמנו שמינונים שונים של IPA (10 מיקרומולר, 100 מיקרומולר ו-1 mM) לא היו רעילים לתאי LX-2 [15]. מחקר זה הראה שטיפול ב-IPA במינון של 10 מיקרומולר ו-100 מיקרומולר הגדיל את מספר התאים החיים והתאים הנמקיים. עם זאת, בהשוואה לקבוצת הביקורת, כדאיות התאים ירדה בריכוז IPA של 1 mM, בעוד שקצב נמק התאים נותר ללא שינוי (איור 2A, B). לאחר מכן, כדי למצוא את הריכוז האופטימלי לגרימת אפופטוזיס בתאי LX-2, בדקנו IPA של 10 מיקרומולר, 100 מיקרומולר ו-1 mM למשך 24 שעות (איור 2A-E ואיור משלים 3A-B). מעניין לציין, ש-IPA 10 מיקרומולר ו-100 מיקרומולר הפחיתו את קצב האפופטוזיס (%), אולם, IPA 1 mM הגביר את האפופטוזיס המאוחר ואת קצב האפופטוזיס (%) בהשוואה לקבוצת הביקורת ולכן נבחר לניסויים נוספים (איורים 2A-D).
IPA גורם לאפופטוזיס של תאי LX-2. נעשה שימוש בשיטת צביעה כפולה של Annexin V ו-7-AAD כדי לכמת את קצב האפופטוזיס ואת מורפולוגיית התאים באמצעות ציטומטריית זרימה. תאי BA הודגרו עם 10 מיקרומטר, 100 מיקרומטר ו-1 mM IPA למשך 24 שעות או עם F–H TGF-β1 (5 ננוגרם/מ"ל) ו-1 mM IPA במדיום נטול סרום למשך 24 שעות. A: תאים חיים (Annexin V -/ 7AAD-); B: תאים נמקיים (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: מוקדם (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: מאוחר (Annexin V+/7AAD.+); E, H: אחוז מכלל תאי האפופטוזיס המוקדמים והמאוחרים בקצב האפופטוזיס (%). הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן, n = 3 ניסויים בלתי תלויים. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות ANOVA חד כיווני עם מבחן Bonferroni post hoc. *p < 0.05; ****p < 0.0001
כפי שהראינו בעבר, 5 ננוגרם/מ"ל TGF-β1 יכול לגרום להפעלת HSC על ידי הגברת הביטוי של גני סמן קלאסיים [15]. תאי LX-2 טופלו בשילוב של 5 ננוגרם/מ"ל TGF-β1 ו-1 mM IPA (איור 2E-H). טיפול ב-TGF-β1 לא שינה את קצב האפופטוזיס, אולם טיפול משותף ב-IPA הגביר את האפופטוזיס המאוחר ואת שיעור האפופטוזיס (%) בהשוואה לטיפול ב-TGF-β1 (איור 2E-H). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-1 mM IPA יכול לקדם אפופטוזיס בתאי LX-2 באופן עצמאי מאינדוקציה של TGF-β1.
חקרנו עוד את השפעת ה-IPA על נשימה מיטוכונדריאלית בתאי LX-2. התוצאות הראו ש-1 mM IPA הפחית את פרמטרי קצב צריכת החמצן (OCR): נשימה לא מיטוכונדריאלית, נשימה בסיסית ומקסימלית, דליפת פרוטונים וייצור ATP בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 3A, B), בעוד שמדד הבריאות הביו-אנרגטי (BHI) לא השתנה.
IPA מפחית את הנשימה המיטוכונדריאלית בתאי LX-2. עקומת הנשימה המיטוכונדריאלית (OCR) מוצגת כפרמטרים של נשימה מיטוכונדריאלית (נשימה לא מיטוכונדריאלית, נשימה בסיסית, נשימה מקסימלית, דליפת פרוטונים, יצירת ATP, SRC ו-BHI). תאים A ו-B הודגרו עם 10 מיקרומטר, 100 מיקרומטר ו-1 mM IPA למשך 24 שעות, בהתאמה. תאים C ו-D הודגרו עם TGF-β1 (5 ננוגרם/מ"ל) ו-1 mM IPA במדיום נטול סרום למשך 24 שעות, בהתאמה. כל המדידות נורמלו לתכולת DNA באמצעות ערכת CyQuant. BHI: מדד בריאות ביו-אנרגטי; SRC: קיבולת רזרבה נשימתית; OCR: קצב צריכת חמצן. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD), n = 5 ניסויים בלתי תלויים. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני ומבחן Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ו-***p < 0.001
כדי להשיג הבנה מקיפה יותר של השפעת IPA על הפרופיל הביו-אנרגטי של תאי LX-2 המופעלים על ידי TGF-β1, ניתחנו זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי באמצעות OCR (איור 3C,D). התוצאות הראו שטיפול ב-TGF-β1 יכול להפחית את הנשימה המקסימלית, קיבולת הרזרבה הנשימתית (SRC) ואת BHI בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 3C,D). בנוסף, הטיפול המשולב הפחית את הנשימה הבסיסית, דליפת פרוטונים וייצור ATP, אך SRC ו-BHI היו גבוהים משמעותית מאלה שטופלו ב-TGF-β1 (איור 3C,D).
ביצענו גם את "Cellular Energy Phenotype Test" המסופק על ידי תוכנת Seahorse (איור משלים 4A-D). כפי שמוצג באיור המשלים 3B, הפוטנציאלים המטבוליים של OCR ו-ECAR ירדו לאחר טיפול ב-TGF-β1, אולם לא נצפה הבדל בקבוצות הטיפול המשולב וב-IPA בהשוואה לקבוצת הביקורת. יתר על כן, רמות הבסיס והלחץ של OCR ירדו לאחר טיפול משולב ו-IPA בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור משלים 4C). מעניין לציין כי דפוס דומה נצפה עם טיפול משולב, שבו לא נצפה שינוי ברמות הבסיס והלחץ של ECAR בהשוואה לטיפול ב-TGF-β1 (איור משלים 4C). בתאי HSC, הירידה בזרחון חמצוני מיטוכונדריאלי ויכולת הטיפול המשולב לשחזר את SCR וה-BHI לאחר חשיפה לטיפול ב-TGF-β1 לא שינו את הפוטנציאל המטבולי (OCR ו-ECAR). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-IPA עשוי להפחית את הביו-אנרגטיקה בתאי HSC, דבר המצביע על כך ש-IPA עשוי לגרום לפרופיל אנרגטי נמוך יותר שמעביר את הפנוטיפ של HSC לכיוון אי-אקטיבציה (איור משלים 4D).
ההשפעה של IPA על הדינמיקה המיטוכונדריאלית נחקרה באמצעות כימות תלת-ממדי של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית וחיבורי רשת, כמו גם צביעת MTR (איור 4 ואיור משלים 5). איור 4 מראה כי בהשוואה לקבוצת הביקורת, טיפול ב-TGF-β1 הפחית את שטח הפנים הממוצע, מספר הענפים, אורך הענפים הכולל ומספר צומת הענפים (איור 4A ו-B) ושינה את שיעור המיטוכונדריה ממורפולוגיה כדורית למורפולוגיה בינונית (איור 4C). רק טיפול ב-IPA הפחית את נפח המיטוכונדריה הממוצע ושינה את שיעור המיטוכונדריה ממורפולוגיה כדורית למורפולוגיה בינונית בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 4A). לעומת זאת, כדוריות, אורך ענף ממוצע ופעילות המיטוכונדריה שהוערכו על ידי MTR תלוי פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה (איור 4A ו-E) נותרו ללא שינוי ופרמטרים אלה לא היו שונים בין הקבוצות. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שטיפול ב-TGF-β1 וב-IPA נראה כמשפיע על צורת וגודל המיטוכונדריה, כמו גם על מורכבות הרשת בתאי LX-2 חיים.
IPA משנה את הדינמיקה המיטוכונדריאלית ואת שפע ה-DNA המיטוכונדריאלי בתאי LX-2. א. תמונות קונפוקליות מייצגות של תאי LX-2 חיים שהודגרו עם TGF-β1 (5 ng/ml) ו-1 mM IPA למשך 24 שעות במדיום נטול סרום, המציגות רשתות מיטוכונדריאליות צבועות ב-Mitotracker™ Red CMXRos וגרעינים צבועים בכחול עם DAPI. כל הנתונים הכילו לפחות 15 תמונות לכל קבוצה. רכשנו 10 תמונות Z-stack עבור כל סוג דגימה. כל רצף ציר Z הכיל 30 פרוסות, כל אחת בעובי של 9.86 מיקרומטר. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. ב. עצמים מייצגים (מיטוכונדריה בלבד) שזוהו על ידי החלת סף אדפטיבי לתמונה. ניתוח כמותי והשוואה של קשרי רשת מורפולוגיים מיטוכונדריאליים בוצעו עבור כל התאים בכל קבוצה. ג. תדירות יחסי צורה מיטוכונדריאלית. ערכים קרובים ל-0 מצביעים על צורות כדוריות, וערכים קרובים ל-1 מצביעים על צורות פילמנטיות. ד. תכולת ה-DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA) נקבעה כמתואר בחומרים ובשיטות. ניתוח E Mitotracker™ Red CMXRos בוצע באמצעות ציטומטריית זרימה (30,000 אירועים) כמתואר בסעיף חומרים ושיטות. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן, n = 3 ניסויים בלתי תלויים. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני ומבחן Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
לאחר מכן ניתחנו את תכולת ה-mtDNA בתאי LX-2 כאינדיקטור למספר המיטוכונדריה. בהשוואה לקבוצת הביקורת, תכולת ה-mtDNA הייתה גבוהה יותר בקבוצה שטופלה ב-TGF-β1 (איור 4D). בהשוואה לקבוצת שטופלה ב-TGF-β1, תכולת ה-mtDNA ירדה בקבוצת הטיפול המשולב (איור 4D), דבר המצביע על כך ש-IPA עשוי להפחית את תכולת ה-mtDNA ואולי את מספר המיטוכונדריה וכן את הנשימה המיטוכונדריאלית (איור 3C). יתר על כן, נראה כי IPA הפחית את תכולת ה-mtDNA בטיפול המשולב אך לא השפיע על פעילות המיטוכונדריה בתיווך MTR (איורים 4A-C).
חקרנו את הקשר בין IPA לבין רמות ה-mRNA של גנים הקשורים לפיברוזיס, אפופטוזיס, הישרדות ודינמיקה מיטוכונדריאלית בתאי LX-2 (איור 5A-D). בהשוואה לקבוצת הביקורת, הקבוצה שטופלה ב-TGF-β1 הראתה ביטוי מוגבר של גנים כגון שרשרת α2 מסוג I של קולגן (COL1A2), α-אקטין שריר חלק (αSMA), מטריקס מטאלופרוטאינאז 2 (MMP2), מעכב רקמות של מטאלופרוטאינאז 1 (TIMP1) וגן דמוי דינמין 1 (DRP1), דבר המצביע על עלייה בפיברוזיס והפעלה. יתר על כן, בהשוואה לקבוצת הביקורת, טיפול ב-TGF-β1 הפחית את רמות ה-mRNA של קולטן פרגנן X גרעיני (PXR), קספאז 8 (CASP8), MAPKAPK3, מעכב של α של תאי B, משפר פפטיד קל של גן κ גרעיני (NFκB1A) ומעכב של תת-יחידה קינאז β של גורם גרעיני κB (IKBKB) (איור 5A-D). בהשוואה לטיפול ב-TGF-β1, טיפול משולב עם TGF-β1 ו-IPA הפחית את הביטוי של COL1A2 ו-MMP2, אך העלה את רמות ה-mRNA של PXR, TIMP1, לימפומה של תאי B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β ו-IKBKB. טיפול ב-IPA הפחית משמעותית את הביטוי של MMP2, Bcl-2-associated protein X (BAX), AKT1, optic atrophy protein 1 (OPA1) וחלבון היתוך מיטוכונדריאלי 2 (MFN2), בעוד שהביטוי של CASP8, NFκB1A, NFκB1B ו-IKBKB גדל בהשוואה לקבוצת הביקורת. עם זאת, לא נמצא הבדל בביטוי של caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), mitochondrial fusion protein 1 (MFN1) וחלבון ביקוע 1 (FIS1). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שטיפול IPA מווסת את ביטוי הגנים הקשורים לפיברוזיס, אפופטוזיס, הישרדות ודינמיקה מיטוכונדריאלית. הנתונים שלנו מצביעים על כך שטיפול IPA מפחית פיברוזיס בתאי LX-2; במקביל, הוא מגרה הישרדות על ידי שינוי הפנוטיפ לכיוון אי-אקטיבציה.
IPA מווסת את הביטוי של גנים של פיברובלסטים, אפופטוזים, כדאיות ודינמיקה מיטוכונדריאלית בתאי LX-2. היסטוגרמות מציגות ביטוי mRNA יחסית לשליטה אנדוגנית (RPLP0 או PPIA) לאחר שתאי LX-2 עברו אינדוקציה עם TGF-β1 ו-IPA במדיום נטול סרום למשך 24 שעות. A מציין פיברובלסטים, B מציין תאים אפופטוטיים, C מציין תאים שורדים ו-D מציין ביטוי גנים של דינמיקה מיטוכונדריאלית. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD), n = 3 ניסויים בלתי תלויים. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות ANOVA חד כיווני ומבחן Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
לאחר מכן, שינויים בגודל התא (FSC-H) ובמורכבות הציטופלזמית (SSC-H) הוערכו באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 6A,B), ושינויים במורפולוגיה של התא לאחר טיפול ב-IPA הוערכו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) ומיקרוסקופיית ניגוד פאזה (איור משלים 6A-B). כצפוי, תאים בקבוצה שטופלה ב-TGF-β1 גדלו בגודלם בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 6A,B), דבר המצביע על התרחבות קלאסית של הרשת האנדופלזמית המחוספסת (ER*) והפגוליזוזומים (P), דבר המצביע על הפעלת תאי גזע המטופויאטיים (HSC) (איור משלים 6A). עם זאת, בהשוואה לקבוצה שטופלה ב-TGF-β1, גודל התא, מורכבות הציטופלזמית (איור 6A,B) ותכולת ה-ER* ירדו בקבוצת הטיפול המשולב ב-TGF-β1 ו-IPA (איור משלים 6A). יתר על כן, טיפול ב-IPA הפחית את גודל התא, מורכבות הציטופלזמית (איורים 6A,B), תכולת P ו-ER* (איור משלים 6A) בהשוואה לקבוצת הביקורת. בנוסף, תכולת התאים האפופטוטיים עלתה לאחר 24 שעות של טיפול ב-IPA בהשוואה לקבוצת הביקורת (חיצים לבנים, איור משלים 6B). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-1 mM IPA יכול לעורר אפופטוזיס של HSC ולהפוך את השינויים בפרמטרים המורפולוגיים של התא הנגרמים על ידי TGF-β1, ובכך לווסת את גודל התא ומורכבותו, אשר עשויים להיות קשורים להשבתת HSC.
IPA משנה את גודל התא ואת מורכבות הציטופלזמה בתאי LX-2. תמונות מייצגות של ניתוח ציטומטריית זרימה. הניתוח השתמש באסטרטגיית שער ספציפית לתאי LX-2: SSC-A/FSC-A כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים, FSC-H/FSC-A כדי לזהות דובלטים, ו-SSC-H/FSC-H לניתוח גודל ומורכבות תאים. תאים הודגרו עם TGF-β1 (5 ng/ml) ו-1 mM IPA במדיום נטול סרום למשך 24 שעות. תאי LX-2 חולקו לרביע שמאלי תחתון (SSC-H-/FSC-H-), רביע שמאלי עליון (SSC-H+/FSC-H-), רביע ימני תחתון (SSC-H-/FSC-H+), ורביע ימני עליון (SSC-H+/FSC-H+) לניתוח גודל התא ומורכבות הציטופלזמה. ב. מורפולוגיית התאים נותחה על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות FSC-H (פיזור קדמי, גודל תא) ו-SSC-H (פיזור צדדי, מורכבות ציטופלזמית) (30,000 אירועים). הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן, n = 3 ניסויים בלתי תלויים. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני ומבחן Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ו-****p < 0.0001
מטבוליטים במעיים כמו IPA הפכו לנושא מחקר חם, דבר המצביע על כך שייתכן שיתגלו מטרות חדשות במיקרוביוטה של ​​המעיים. לכן מעניין ש-IPA, מטבוליט שקישרנו לפיברוזיס כבד בבני אדם [15], הוכח כתרכובת אנטי-פיברוטית פוטנציאלית במודלים של בעלי חיים [13, 14]. כאן, אנו מדגימים לראשונה קשר בין IPA בסרום לבין טרנסקריפטומיקה גלובלית של הכבד ומתילציה של DNA אצל אנשים שמנים ללא סוכרת מסוג 2 (T2D), תוך הדגשת אפופטוזיס, מיטופגיה ואריכות ימים, כמו גם גן מועמד אפשרי AKT1 המווסת הומאוסטזיס של הכבד. חידוש נוסף במחקר שלנו הוא שהדגמנו את האינטראקציה של טיפול ב-IPA עם אפופטוזיס, מורפולוגיה של תאים, ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית ודינמיקה בתאי LX-2, דבר המצביע על ספקטרום אנרגיה נמוך יותר שמסיט את הפנוטיפ של HSC לכיוון אי-אקטיבציה, מה שהופך את IPA למועמד פוטנציאלי לשיפור פיברוזיס כבד.
מצאנו שאפופטוזיס, מיטופגיה ואריכות ימים היו המסלולים הקנוניים החשובים ביותר, המועשרים בגנים של הכבד הקשורים ל-IPA בסרום במחזור הדם. שיבוש מערכת בקרת האיכות המיטוכונדריאלית (MQC) יכול להוביל לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מיטופגיה ואפופטוזיס, ובכך לקדם את הופעת MASLD [33, 34]. לכן, אנו יכולים לשער ש-IPA עשוי להיות מעורב בשמירה על הדינמיקה של התא ושלמות המיטוכונדריה באמצעות אפופטוזיס, מיטופגיה ואריכות ימים בכבד. הנתונים שלנו הראו ששני גנים היו נפוצים בשלושת הבדיקות: YKT6 ו-AKT1. ראוי לציין ש-YKT6 הוא חלבון SNARE המעורב בתהליך איחוי קרום התא. הוא ממלא תפקיד באוטופגיה ובמיטופגיה על ידי יצירת קומפלקס התחלה עם STX17 ו-SNAP29 על האוטופגוזום, ובכך מקדם את האיחוי של אוטופגוזומים וליזוזומים [35]. יתר על כן, אובדן תפקוד YKT6 גורם לפגיעה במיטופגיה [36], בעוד שעלייה ברמת YKT6 קשורה להתקדמות קרצינומה הפטוצלולרית (HCC), דבר המראה עלייה בהישרדות תאים [37]. מצד שני, AKT1 הוא הגן האינטראקטיבי החשוב ביותר וממלא תפקיד חשוב במחלות כבד, כולל מסלול איתות PI3K/AKT, מחזור התא, נדידת תאים, התפשטות תאים, הידבקות מוקדית, תפקוד מיטוכונדריאלי והפרשת קולגן [38-40]. מסלול איתות PI3K/AKT מופעל יכול להפעיל תאי גזע המטופויאטיים (HSCs), שהם התאים האחראים לייצור מטריצה ​​חוץ-תאית (ECM), וחוסר ויסות שלו עשוי לתרום להופעה ולהתקדמות של פיברוזיס כבד [40]. בנוסף, AKT הוא אחד מגורמי ההישרדות המרכזיים של תאים המעכבים אפופטוזיס של תאים תלויי p53, והפעלת AKT עשויה להיות קשורה לעיכוב אפופטוזיס של תאי כבד [41, 42]. התוצאות שהתקבלו מצביעות על כך ש-IPA עשוי להיות מעורב באפופטוזיס הקשור למיטוכונדריה בכבד על ידי השפעה על ההחלטה של ​​​​הפטוציטים בין כניסה לאפופטוזיס או הישרדות. השפעות אלו עשויות להיות מווסתות על ידי גנים מועמדים ל-AKT ו/או YKT6, שהם קריטיים להומאוסטזיס של הכבד.
תוצאותינו הראו ש-1 mM IPA גרם לאפופטוזיס והפחית את הנשימה המיטוכונדריאלית בתאי LX-2 ללא תלות בטיפול ב-TGF-β1. ראוי לציין שאפופטוזיס הוא מסלול עיקרי לפתרון פיברוזיס ולהפעלת תאי גזע המטופויאטיים (HSC), והוא גם אירוע מפתח בתגובה הפיזיולוגית ההפיכה של פיברוזיס בכבד [4, 43]. יתר על כן, שיקום ה-BHI בתאי LX-2 לאחר טיפול משולב סיפק תובנות חדשות לגבי התפקיד הפוטנציאלי של IPA בוויסות הביו-אנרגטיקה המיטוכונדריאלית. בתנאי מנוחה ולא פעילים, תאים המטופויאטיים בדרך כלל משתמשים בזרחון חמצוני מיטוכונדריאלי כדי לייצר ATP ויש להם פעילות מטבולית נמוכה. מצד שני, הפעלת HSC משפרת את הנשימה והביוסינתזה המיטוכונדריאלית כדי לפצות על דרישות האנרגיה של הכניסה למצב גליקוליטי [44]. העובדה ש-IPA לא השפיעה על הפוטנציאל המטבולי ועל ECAR מצביעה על כך שמסלול הגליקוליטי מקבל עדיפות נמוכה יותר. באופן דומה, מחקר אחר הראה ש-1 mM IPA היה מסוגל לווסת את פעילות שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית בקרדיומיוציטים, קו תאי הפטוציטים אנושיים (Huh7) ותאי אנדותל וריד טבורי אנושיים (HUVEC); עם זאת, לא נמצאה השפעה של IPA על גליקוליזה בקרדיומיוציטים, דבר המצביע על כך ש-IPA עשוי להשפיע על הביו-אנרגטיקה של סוגי תאים אחרים [45]. לכן, אנו משערים ש-1 mM IPA עשוי לפעול כמנתק כימי קל, מכיוון שהוא יכול להפחית באופן משמעותי את ביטוי הגנים הפיברוגניים, את המורפולוגיה של התא ואת הביו-אנרגטיקה המיטוכונדריאלית מבלי לשנות את כמות ה-mtDNA [46]. מנתקי מצמדים מיטוכונדריה יכולים לעכב פיברוזיס המושרה על ידי תרבית והפעלת HSC [47] ולהפחית את ייצור ה-ATP המיטוכונדריאלי המווסת או המושרה על ידי חלבונים מסוימים כגון חלבוני ניתוק (UCP) או אדנין נוקלאוטיד טרנסלוקאז (ANT). בהתאם לסוג התא, תופעה זו יכולה להגן על תאים מפני אפופטוזיס ו/או לקדם אפופטוזיס [46]. עם זאת, יש צורך במחקרים נוספים כדי להבהיר את תפקידו של IPA כמנתק מיטוכונדריאלי בהשבתת תאי גזע המטופויאטיים.
לאחר מכן בדקנו האם השינויים בנשימה המיטוכונדריאלית משתקפים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית בתאי LX-2 חיים. מעניין לציין, שטיפול ב-TGF-β1 משנה את הפרופורציה המיטוכונדריאלית מכדורית לבינונית, עם ירידה בהסתעפות המיטוכונדריה וביטוי מוגבר של DRP1, גורם מפתח בביקוע המיטוכונדריאלי [48]. יתר על כן, פרגמנטציה מיטוכונדריאלית קשורה למורכבות הרשת הכוללת, והמעבר מאיחוי לביקוע הוא קריטי להפעלת תאי גזע המטופויאטיים (HSC), בעוד שעיכוב ביקוע המיטוכונדריה מוביל לאפופטוזיס של HSC [49]. לפיכך, תוצאותינו מצביעות על כך שטיפול ב-TGF-β1 עשוי לגרום לירידה במורכבות הרשת המיטוכונדריאלית עם ירידה בהסתעפות, דבר שכיח יותר בביקוע מיטוכונדריאלי הקשור לתאי גזע המטופויאטיים מופעלים (HSCs). יתר על כן, הנתונים שלנו הראו ש-IPA יכול לשנות את שיעור המיטוכונדריה מצורה כדורית לבינונית, ובכך להפחית את הביטוי של OPA1 ו-MFN2. מחקרים הראו כי ירידה ב-OPA1 עלולה לגרום לירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי ולגרום לאפופטוזיס של התאים [50]. MFN2 ידוע כמתווך איחוי ואפופטוזיס של התאים [51]. התוצאות שהתקבלו מצביעות על כך שאינדוקציה של תאי LX-2 על ידי TGF-β1 ו/או IPA נראה כמשפיעה על צורת וגודל המיטוכונדריה, כמו גם על מצב ההפעלה ומורכבות הרשת.
תוצאותינו מצביעות על כך שטיפול משולב של TGFβ-1 ו-IPA יכול להפחית את ה-mtDNA ואת הפרמטרים המורפולוגיים של התא על ידי ויסות ביטוי ה-mRNA של גנים הקשורים לפיברוזיס, אפופטוזיס וגנים הקשורים להישרדות בתאים המתחמקים מאפופטוזיס. ואכן, IPA הפחית את רמת הביטוי של mRNA של AKT1 וגנים חשובים לפיברוזיס כמו COL1A2 ו-MMP2, אך הגביר את רמת הביטוי של CASP8, הקשורה לאפופטוזיס. תוצאותינו הראו שלאחר טיפול ב-IPA, ביטוי BAX ירד וביטוי mRNA של תת-יחידות משפחת TIMP1, BCL-2 ו-NF-κB עלה, דבר המצביע על כך ש-IPA יכול לעורר אותות הישרדות בתאי גזע המטופויאטיים (HSCs) המתחמקים מאפופטוזיס. מולקולות אלו עשויות לפעול כאותות פרו-הישרדות בתאי גזע המטופויאטיים מופעלים, דבר שעשוי להיות קשור לביטוי מוגבר של חלבונים אנטי-אפופטוטיים (כגון Bcl-2), ביטוי מופחת של BAX פרו-אפופטוטי, ויחסי גומלין מורכבים בין TIMP ו-NF-κB [5, 7]. IPA מפעיל את השפעותיו דרך PXR, ומצאנו שטיפול משולב עם TGF-β1 ו-IPA הגביר את רמות הביטוי של mRNA של PXR, דבר המצביע על דיכוי הפעלת HSC. ידוע כי איתות PXR מופעל מעכב הפעלת HSC הן in vivo והן in vitro [52, 53]. תוצאותינו מצביעות על כך ש-IPA עשוי להשתתף בסילוק של HSCs מופעלים על ידי קידום אפופטוזיס, הפחתת פיברוזיס ומטבוליזם מיטוכונדריאלי, ושיפור אותות הישרדות, שהם תהליכים אופייניים ההופכים את הפנוטיפ של HSC מופעל לפנוטיפ לא פעיל. הסבר אפשרי נוסף למנגנון הפוטנציאלי ולתפקיד של IPA באפופטוזיס הוא שהוא אוגר מיטוכונדריה לא מתפקדת בעיקר דרך מיטופגיה (מסלול פנימי) ומסלול איתות TNF חיצוני (טבלה 1), המקושר ישירות למסלול איתות ההישרדות NF-κB (איור משלים 7). מעניין לציין, שגנים מועשרים הקשורים ל-IPA מסוגלים לגרום לאותות פרו-אפופטוטיים ואותות פרו-הישרדות במסלול האפופטוטי [54], דבר המצביע על כך ש-IPA עשוי לגרום למסלול האפופטוטי או להישרדות על ידי אינטראקציה עם גנים אלה. עם זאת, כיצד IPA גורם לאפופטוזיס או הישרדות במהלך הפעלת HSC והמסלולים המכניסטיים שלו נותרים לא ברורים.
IPA הוא מטבוליט מיקרוביאלי הנוצר מטריפטופן תזונתי דרך המיקרוביוטה של ​​המעי. מחקרים הראו שיש לו תכונות אנטי דלקתיות, נוגדות חמצון ואפיגנטיות בסביבת המעי.[55] מחקרים הראו ש-IPA יכול לווסת את תפקוד מחסום המעי ולהפחית עקה חמצונית, מה שעשוי לתרום להשפעותיו הפיזיולוגיות המקומיות.[56] למעשה, IPA מועבר לאיברי המטרה דרך מחזור הדם, ומכיוון של-IPA מבנה מטבוליט עיקרי דומה עם נגזרות טריפטופן, סרוטונין ואינדול, IPA מפעיל פעולות מטבוליות וכתוצאה מכך תחרות בגורלות מטבוליים.[52] IPA עשוי להתחרות עם מטבוליטים שמקורם בטריפטופן על אתרי קישור לאנזימים או קולטנים, דבר שעלול לשבש מסלולים מטבוליים תקינים. זה מדגיש את הצורך במחקרים נוספים על הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה שלו כדי להבין טוב יותר את החלון הטיפולי שלו.[57] נותר לראות האם זה יכול להתרחש גם בתאי גזע המטופויאטיים (HSCs).
אנו מכירים בכך שלמחקר שלנו יש כמה מגבלות. כדי לבחון באופן ספציפי קשרים הקשורים ל-IPA, לא כללנו חולים עם סוכרת מסוג 2 (T2DM). אנו מכירים בכך שזה מגביל את הישימות הרחבה של ממצאינו לחולים עם סוכרת מסוג 2 ומחלת כבד מתקדמת. למרות שהריכוז הפיזיולוגי של IPA בסרום אנושי הוא 1-10 מיקרומולר [11, 20], נבחר ריכוז של 1 mM IPA על סמך הריכוז הלא רעיל הגבוה ביותר [15] ושיעור האפופטוזיס הגבוה ביותר, ללא הבדל באחוז אוכלוסיית התאים הנמקיים. למרות שנעשה שימוש ברמות סופרפיזיולוגיות של IPA במחקר זה, אין כיום הסכמה לגבי המינון האפקטיבי של IPA [52]. למרות שתוצאותינו משמעותיות, הגורל המטבולי הרחב יותר של IPA נותר תחום מחקר פעיל. יתר על כן, ממצאינו על הקשר בין רמות IPA בסרום לבין מתילציה של DNA של תעתיקי כבד התקבלו לא רק מתאי גזע המטופויאטיים (HSCs) אלא גם מרקמות כבד. בחרנו להשתמש בתאי LX-2 אנושיים בהתבסס על ממצאים קודמים שלנו מניתוח טרנסקריפטומים לפיהם IPA קשור להפעלת תאי גזע המטופויאטיים (HSC) [15], ו-HSCs הם התאים העיקריים המעורבים בהתקדמות פיברוזיס בכבד. הכבד מורכב מסוגי תאים מרובים, לכן יש לשקול מודלים אחרים של תאים כגון מערכת תרבית משותפת של תאי הפטוציטים-HSC-חיסון בשילוב עם הפעלת קספאז ופרגמנטציה של DNA, כמו גם את מנגנון הפעולה כולל רמת החלבון, כדי לחקור את תפקיד ה-IPA ואת האינטראקציה שלו עם סוגי תאי כבד אחרים.