תיאוריות שונות של הגנה על צמחים מספקות הכוונה תיאורטית חשובה להסבר דפוסי המטבוליזם הייעודי של צמחים, אך התחזיות המרכזיות שלהן נותרו לבחינה. כאן, השתמשנו בניתוח ספקטרומטריית מסות טנדם (MS/MS) בלתי מוטה כדי לחקור באופן שיטתי את המטבולום של זנים מוחלשים של טבק מצמחים בודדים לאוכלוסיות ולמינים קרובים, ועיבדנו מספר רב של תיאוריות תכונות ספקטרומטריות מסות המבוססות על ספקטרום מורכב במידע. מסגרת לבדיקת התחזיות המרכזיות של תיאוריות הגנה אופטימלית (OD) ומטרה נעה (MT). רכיב המידע של מטבולומיקה של צמחים עולה בקנה אחד עם תיאוריית OD, אך סותר את התחזית העיקרית של תיאוריית MT על דינמיקת מטבולומיקה הנגרמת על ידי אוכלי עשב. מהסולם המיקרו למאקרו אבולוציוני, אות היסמונט זוהה כגורם המכריע של OD, בעוד שאות האתילן סיפק כוונון עדין של התגובה הספציפית לאוכלי עשב, כפי שצוין על ידי הרשת המולקולרית MS/MS.
מטבוליטים מיוחדים בעלי מבנים מגוונים הם המשתתפים העיקריים בהסתגלות צמחים לסביבה, במיוחד בהגנה מפני אויבים (1). הגיוון המדהים של חילוף החומרים המיוחד שנמצא בצמחים עודד עשרות שנים של מחקר מעמיק על היבטי התפקודים האקולוגיים הרבים שלו, ויצר רשימה ארוכה של תיאוריות הגנה על צמחים, שהן ההתפתחות האבולוציונית והאקולוגית של יחסי גומלין בין צמחים לחרקים. מחקר אמפירי מספק הכוונה חשובה (2). עם זאת, תיאוריות הגנה אלו על צמחים לא עקבו אחר הנתיב הנורמטיבי של חשיבה דדוקטיבית היפותטית, שבה תחזיות מפתח היו באותה רמת ניתוח (3) ונבדקו בניסוי כדי לקדם את המחזור הבא של הפיתוח התיאורטי (4). מגבלות טכניות מגבילות את איסוף הנתונים לקטגוריות מטבוליות ספציפיות ומונעות ניתוח מקיף של מטבוליטים מיוחדים, ובכך מונעות השוואות בין-קטגוריות החיוניות לפיתוח תיאורטי (5). היעדר נתוני מטבולומיקה מקיפים ומטבע משותף להשוואת זרימת העבודה של המרחב המטבולי בין קבוצות צמחים שונות מעכב את הבגרות המדעית של התחום.
ההתפתחויות האחרונות בתחום המטבולומיקה של ספקטרומטריית מסות טנדם (MS/MS) יכולות לאפיין באופן מקיף את השינויים המטבוליים בתוך ובין מינים של מערכת נתונה, וניתן לשלב אותן עם שיטות חישוביות כדי לחשב את הדמיון המבני בין תערובות מורכבות אלו. ידע קודם בכימיה (5). השילוב של טכנולוגיות מתקדמות בניתוח ובמחשוב מספק מסגרת הכרחית לבדיקה ארוכת טווח של תחזיות רבות שנעשו על ידי התיאוריות האקולוגיות והאבולוציוניות של גיוון מטבולי. שאנון (6) הציג את תורת המידע בפעם הראשונה במאמרו פורץ הדרך בשנת 1948, והניח את היסודות לניתוח מתמטי של מידע, אשר שימש בתחומים רבים מלבד יישומו המקורי. בגנומיקה, תורת המידע יושמה בהצלחה לכמת מידע שמרני ברצף (7). במחקר טרנסקריפטומיקה, תורת המידע מנתחת את השינויים הכוללים בטרנסקריפטום (8). במחקר קודם, יישמנו את המסגרת הסטטיסטית של תורת המידע על מטבולומיקה כדי לתאר את המומחיות המטבולית של רמת הרקמה בצמחים (9). כאן, אנו משלבים את זרימת העבודה מבוססת MS/MS עם המסגרת הסטטיסטית של תורת המידע, המאופיינת בגיוון המטבולי במטבע המשותף, כדי להשוות את התחזיות המרכזיות של תורת ההגנה של הצמח של המטבולום המושרה על ידי אוכלי עשב.
המסגרות התיאורטיות של הגנת צמחים הן בדרך כלל כוללות זו את זו וניתן לחלק אותן לשתי קטגוריות: אלו המנסות להסביר את התפלגות המטבוליטים הספציפיים לצמח על סמך תפקודי הגנה, כגון הגנה אופטימלית (OD) (10), מטרה נעה (MT) (11) ותיאוריית המראה (12), בעוד שאחרות מחפשות הסברים מכניים כיצד שינויים בזמינות המשאבים משפיעים על צמיחת צמחים והצטברות מטבוליטים מיוחדים, כגון פחמן: השערת מאזן חומרי הזנה (13), השערת קצב צמיחה (14) והשערת שיווי המשקל של צמיחה והתמיינות (15). שתי קבוצות התיאוריות נמצאות ברמות ניתוח שונות (4). עם זאת, שתי תיאוריות הכוללות תפקודים הגנתיים ברמה התפקודית שולטות בשיחה על הגנות מכוננות וניתנות להשראה של צמחים: תיאוריית OD, המניחה שצמחים משקיעים בהגנות הכימיות היקרות שלהם רק בעת הצורך, למשל, כאשר הן נבלעות. כאשר בעל חיים עשב תוקף, לכן, בהתאם לאפשרות של התקפה עתידית, מוקצה התרכובת עם תפקוד הגנתי (10); השערת ה-MT מציעה שאין ציר של שינוי מטבוליטים כיווני, אלא שהמטבוליט משתנה באופן אקראי, ובכך יוצר את האפשרות לחסום את "מטרת התנועה" המטבולית של אוכלי עשב תוקפים. במילים אחרות, שתי תיאוריות אלו מניחות שינויים הפוכים לגבי השינוי המטבולי המתרחש לאחר התקפה של אוכלי עשב: הקשר בין הצטברות חד-כיוונית של מטבוליטים בעלי תפקוד הגנתי (OD) לבין שינויים מטבוליים לא מכוונים (MT) (11).
השערות ה-OD וה-MT כוללות לא רק את השינויים המושרים במטבולום, אלא גם את ההשלכות האקולוגיות והאבולוציוניות של הצטברות מטבוליטים אלה, כגון העלויות והתועלות ההסתגלותיות של שינויים מטבוליים אלה בסביבה אקולוגית ספציפית (16). למרות ששתי ההשערות מכירות בתפקוד ההגנתי של מטבוליטים מיוחדים, שעשויים להיות יקרים או לא, התחזית המרכזית המבדילה את השערות ה-OD וה-MT טמונה בכיווניות השינויים המטבוליים המושרים. חיזוי תיאוריית ה-OD זכה עד כה לתשומת הלב הניסויית הרבה ביותר. בדיקות אלה כוללות את חקר תפקודי ההגנה הישירים או העקיפים של רקמות שונות של תרכובות ספציפיות בחממות ובתנאים טבעיים, כמו גם שינויים בשלב התפתחות הצמח (17-19). עם זאת, עד כה, בשל היעדר זרימת עבודה ומסגרת סטטיסטית לניתוח מקיף גלובלי של מגוון מטבולי של כל אורגניזם, ההבדל העיקרי בתחזית בין שתי התיאוריות (כלומר, כיוון השינויים המטבוליים) נותר לבחינה. כאן, אנו מספקים ניתוח כזה.
אחד המאפיינים המשמעותיים ביותר של מטבוליטים ספציפיים לצמחים הוא הגיוון המבני הקיצוני שלהם בכל הרמות, החל מצמחים בודדים ואוכלוסיות ועד מינים דומים (20). שינויים כמותיים רבים במטבוליטים מיוחדים ניתן לראות בקנה מידה של אוכלוסייה, בעוד שהבדלים איכותיים חזקים נשמרים בדרך כלל ברמת המין (20). לכן, גיוון מטבולי בצמחים הוא ההיבט העיקרי של גיוון תפקודי, המשקף את יכולת ההסתגלות לנישות שונות, במיוחד נישות עם אפשרויות פלישה שונות על ידי חרקים מיוחדים ואוכלי עשב נפוצים (21). מאז המאמר פורץ הדרך של פרנקל (22) על הסיבות לקיומם של מטבוליטים ספציפיים לצמחים, אינטראקציות עם חרקים שונים נחשבו ללחצי ברירה חשובים, ומאמינים כי אינטראקציות אלו עיצבו צמחים במהלך האבולוציה. מסלול מטבולי (23). הבדלים בין-מיניים בגיוון המטבוליטים המיוחדים עשויים לשקף גם את האיזון הפיזיולוגי הקשור להגנה מכוננת וניתנת ליצירת צמחים מפני אסטרטגיות של אוכלי עשב, שכן שני המינים נמצאים לעתים קרובות בקורלציה שלילית זה עם זה (24). למרות שייתכן שיהיה מועיל לשמור על הגנה טובה בכל עת, שינויים מטבוליים בזמן הקשורים להגנה מספקים יתרונות ברורים בכך שהם מאפשרים לצמחים להקצות משאבים יקרי ערך להשקעות פיזיולוגיות אחרות (19, 24), ולמנוע את הצורך בסימביוזה. נזק משני (25). בנוסף, ארגון מחדש זה של מטבוליטים מיוחדים הנגרם על ידי אוכלי עשב חרקים עלול להוביל להתפלגות הרסנית באוכלוסייה (26), ועשוי לשקף קריאות ישירות של שינויים טבעיים משמעותיים באות חומצה יסמונית (JA), אשר עשוי להישמר באוכלוסייה. אותות JA גבוהים ונמוכים הם פשרות בין הגנה מפני אוכלי עשב לבין תחרות עם מינים ספציפיים (27). בנוסף, מסלולי ביוסינתזה של מטבוליטים מיוחדים יעברו אובדן וטרנספורמציה מהירים במהלך האבולוציה, וכתוצאה מכך התפלגות מטבולית לא אחידה בין מינים קרובים (28). פולימורפיזמים אלה יכולים להתבסס במהירות בתגובה לשינוי דפוסי אוכלי עשב (29), מה שאומר שהתנודות בקהילות אוכלי עשב הן גורם מפתח המניע הטרוגניות מטבולית.
כאן, פתרנו באופן ספציפי את הבעיות הבאות. (I) כיצד חרק אוכל עשב יוצר מחדש את מטבולום הצמח? (Ii) מהם רכיבי המידע העיקריים של גמישות מטבולית שניתן לכמת כדי לבחון את התחזיות של תיאוריית ההגנה לטווח ארוך? (Giii) האם יש לתכנת מחדש את מטבולום הצמח באופן ייחודי לתוקף, אם כן, איזה תפקיד ממלא הורמון הצמח בהתאמת תגובה מטבולית ספציפית, ואילו מטבוליטים תורמים לספציפיות של המין להגנה? (Div) מכיוון שניתן להרחיב את התחזיות שנעשו על ידי תיאוריות הגנה רבות על פני כל רמות הרקמות הביולוגיות, שאלנו עד כמה עקבית התגובה המטבולית הנגרמת מהשוואה פנימית להשוואה בין-מינית? לשם כך, חקרנו באופן שיטתי את המטבולום של ניקוטין בעלי טבק, שהוא צמח מודל אקולוגי בעל מטבוליזם עשיר ומתמחה, והוא יעיל כנגד הזחלים של שני אוכלי עשב מקומיים, Lepidoptera Datura (Ms) (אגרסיבי מאוד, נאכל בעיקר). בסולנציה ובספודופטרה ליטורליס (Sl), תולעי עלי כותנה הן מעין "סוג", כאשר צמחי הפונדקאי של הסולנציה ופונדקאים אחרים מסוגים ומשפחות אחרות הם מזון צמחי. ניתחנו את ספקטרום המטבולומיקה MS/MS וחילצנו תיאורים סטטיסטיים של תורת המידע כדי להשוות תיאוריות OD ו-MT. יצרנו מפות ספציפיות כדי לחשוף את זהותם של מטבוליטים מרכזיים. הניתוח הורחב לאוכלוסייה המקומית של N. nasi ולמיני טבק קרובים כדי לנתח עוד יותר את השונות המשותפת בין איתות הורמוני צמחים לבין אינדוקציה של OD.
על מנת ללכוד מפה כוללת של הפלסטיות והמבנה של המטבולום של עלי טבק אוכלי עשב, השתמשנו בתהליך עבודה של ניתוח וחישוב שפותח קודם לכן כדי לאסוף ולפרק באופן מקיף ספקטרום MS/MS ברזולוציה גבוהה מתמציות צמחים (9). שיטה בלתי ממוינת זו (הנקראת MS/MS) יכולה לבנות ספקטרום תרכובות לא מיותרות, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהן עבור כל הניתוחים ברמת התרכובת המתוארים כאן. מטבוליטים צמחיים מפורקים אלה הם מסוגים שונים, המורכבים ממאות עד אלפי מטבוליטים (כ-500-1000 שניות/MS/MS כאן). כאן, אנו בוחנים פלסטיות מטבולית במסגרת תורת המידע, ומכמתים את הגיוון והמקצועיות של המטבולום על סמך האנטרופיה של שאנון של התפלגות התדירות המטבולית. באמצעות הנוסחה המיושמת קודם לכן (8), חישבנו קבוצת אינדיקטורים בהם ניתן להשתמש כדי לכמת גיוון מטבולי (אינדיקטור Hj), התמחות בפרופיל מטבולי (אינדיקטור δj) וספציפיות מטבולית של מטבוליט יחיד (אינדיקטור Si). בנוסף, יישמנו את מדד הפלסטיות של המרחק היחסי (RDPI) כדי לכמת את יכולת ההשראה של המטבולים של אוכלי עשב (איור 1A) (30). במסגרת סטטיסטית זו, אנו מתייחסים לספקטרום MS/MS כיחידת המידע הבסיסית, ומעבדים את השפע היחסי של MS/MS למפת התפלגות תדרים, ולאחר מכן משתמשים באנטרופיה של שאנון כדי להעריך את גיוון המטבולים ממנו. ההתמחות המטבולים נמדדת על ידי הספציפיות הממוצעת של ספקטרום MS/MS יחיד. לכן, העלייה בשפע של חלק מקבוצות MS/MS לאחר אינדוקציה של אוכלי עשב הופכת להשראה ספקטרלית, RDPI והתמחות, כלומר, העלייה במדד δj, מכיוון שמיוצרים מטבוליטים מיוחדים יותר ומיוצר מדד Si גבוה. הירידה במדד הגיוון Hj משקפת שמספר ה-MS/MS שנוצר מצטמצם, או שהתפלגות התדרים של הפרופיל משתנה בכיוון פחות אחיד, תוך הפחתת אי הוודאות הכוללת שלו. באמצעות חישוב מדד Si, ניתן להדגיש אילו MS/MS מושרים על ידי אוכלי עשב מסוימים, לעומת זאת, אילו MS/MS אינם מגיבים לאינדוקציה, שהוא אינדיקטור מפתח להבחנה בין ניבוי MT ו-OD.
(א) תיאורים סטטיסטיים המשמשים עבור מושרה של נתונים של MS/MS (RDPI) באוכלי עשב (H1 עד Hx), גיוון (אינדקס Hj), התמחות (אינדקס δj) וספציפיות למטבוליטים (אינדקס Si). עלייה במידת ההתמחות (δj) מצביעה על כך שבממוצע, ייוצרו יותר מטבוליטים ספציפיים לאוכלי עשב, בעוד שירידה בגיוון (Hj) מצביעה על ירידה בייצור מטבוליטים או פיזור לא אחיד של מטבוליטים במפת הפיזור. ערך ה-Si מעריך האם המטבוליט ספציפי למצב נתון (כאן, אוכלי עשב) או להפך, נשמר באותה רמה. (ב) תרשים מושגי של ניבוי תורת ההגנה באמצעות ציר תורת המידע. תורת ה-OD מנבאת כי התקפת אוכלי עשב תגדיל את מטבוליטי ההגנה, ובכך תגדיל את δj. במקביל, Hj יורד מכיוון שהפרופיל מאורגן מחדש לקראת אי-הוודאות המופחתת של מידע מטבולי. תיאוריית ה-MT צופה כי התקפה של אוכלי עשב תגרום לשינויים לא כיווניים במטבולום, ובכך תגדיל את ה-Hj כאינדיקטור לעלייה באי ודאות במידע מטבולי ותגרום להתפלגות אקראית של Si. הצענו גם מודל מעורב, ה-MT הטוב ביותר, שבו מטבוליטים מסוימים עם ערכי הגנה גבוהים יותר יהיו מוגברים במיוחד (ערך Si גבוה), בעוד שאחרים יציגו תגובות אקראיות (ערך Si נמוך יותר).
באמצעות תיאורי תורת המידע, אנו מפרשים את תורת ה-OD לחזות ששינויים במטבוליטים מיוחדים המושרים על ידי אוכלי עשב במצב מכונן לא מושרה יובילו ל-(i) עלייה בספציפיות המטבולית (אינדקס Si) שתניע ספציפיות מטבונומית (אינדקס δj). עלייה של קבוצות מטבוליטים מיוחדות מסוימות בעלות ערך הגנה גבוה יותר, ו-(ii) ירידה בגיוון המטבולי (אינדקס Hj) עקב שינוי בהתפלגות התדירות המטבולית לפיזור לפטין רב יותר בגוף. ברמה של מטבוליט בודד, צפויה התפלגות Si מסודרת, שבה המטבוליט יגדיל את ערך ה-Si בהתאם לערך ההגנה שלו (איור 1B). בכיוון זה, אנו מסבירים את תורת ה-MT לחזות שעירור יוביל ל-(i) שינויים לא כיווניים במטבוליטים שיובילו לירידה במדד δj, ו-(ii) עלייה במדד Hj עקב עלייה באי הוודאות המטבולית. או אקראיות, שניתן לכמת על ידי אנטרופיה של שאנון בצורה של גיוון כללי. באשר להרכב המטבולי, תורת ה-MT תחזה את ההתפלגות האקראית של Si. בהתחשב בכך שמטבוליטים מסוימים נמצאים בתנאים ספציפיים תחת תנאים ספציפיים, ותנאים אחרים אינם נמצאים תחת תנאים ספציפיים, וערך ההגנה שלהם תלוי בסביבה, הצענו גם מודל הגנה מעורב, שבו δj ו-Hj מפוזרים בשניים לאורך העלייה ב-Si בכל הכיוונים, רק קבוצות מטבוליטים מסוימות, בעלות ערכי הגנה גבוהים יותר, יגדילו את ה-Si במיוחד, בעוד שאחרות יהיו בעלות התפלגות אקראית (איור 1B).
על מנת לבחון את ניבוי תורת ההגנה המוגדר מחדש על ציר מתאר תורת המידע, גידלנו זחלי צמחוניים מומחים (Ms) או גנרליסטים (Sl) על עלי Nepenthes pallens (איור 2A). באמצעות ניתוח MS/MS, שלפנו 599 ספקטרום MS/MS לא-יתיר (קובץ נתונים S1) מתמציות מתנול של רקמת עלה שנאספה לאחר האכלת זחל. שימוש באינדקסים RDPI, Hj ו-δj כדי להמחיש את שינוי התצורה של תוכן המידע בקבצי תצורה של MS/MS מגלה דפוסים מעניינים (איור 2B). המגמה הכללית היא שכפי שתואר על ידי מתאר המידע, ככל שהזחלים ממשיכים לאכול עלים, מידת כל הארגון מחדש המטבולי עולה עם הזמן: 72 שעות לאחר שהצמחוני אוכל, ה-RDPI עולה משמעותית. בהשוואה לקבוצת הביקורת שלא ניזוקה, Hj ירד משמעותית, כתוצאה ממידת ההתמחות המוגברת של הפרופיל המטבולי, אשר כומתה על ידי אינדקס δj. מגמה לכאורה זו עולה בקנה אחד עם תחזיות תיאוריית ה-OD, אך אינה עולה בקנה אחד עם התחזיות העיקריות של תיאוריית ה-MT, המאמינה כי שינויים אקראיים (לא כיווניים) ברמות המטבוליטים משמשים כהסוואה הגנתית (איור 1B). למרות שתכולת מעורר ההפרשה הפראית (OS) והתנהגות התזונה של שני אוכלי עשב אלה שונים, האכלתם הישירה הביאה לשינויים דומים בכיוונים של Hj ו-δj במהלך תקופות הקציר של 24 שעות ו-72 שעות. ההבדל היחיד התרחש לאחר 72 שעות של RDPI. בהשוואה לזה שנגרם על ידי האכלה עם Ms, המטבוליזם הכולל המושרה על ידי האכלה עם Sl היה גבוה יותר.
(א) תכנון ניסויי: אוכלי עשב חזירים מצויים (S1) או מומחים (Ms) מוזנים בעלים מותפלים של צמחי קנקן, בעוד שבסימולציה של אוכלי עשב, נעשה שימוש ב-OS של Ms (W + OSMs) לטיפול בניקוב פצע במיקומי עלים סטנדרטיים. זחלי S1 (W + OSSl) או מים (W + W). קבוצת הביקורת (C) היא עלה שלא ניזוק. (ב) אינדוקבילות (RDPI בהשוואה לתרשים הבקרה), גיוון (אינדקס Hj) והתמחות (אינדקס δj) שחושבו עבור מפת המטבוליטים המיוחדת (599 MS/MS; קובץ נתונים S1). כוכביות מציינות הבדלים משמעותיים בין האכלה ישירה של אוכלי עשב לבין קבוצת הביקורת (מבחן t של סטודנט עם מבחן t מזווג, *P<0.05 ו-***P<0.001). ns, לא חשוב. (ג) מדד רזולוציית זמן של הספקטרום העיקרי (קופסה כחולה, חומצת אמינו, חומצה אורגנית וסוכר; קובץ נתונים S2) וספקטרום מטבוליטים מיוחדים (קופסה אדומה 443 MS/MS; קובץ נתונים S1) לאחר טיפול מדומה באוכלי עשב. פס הצבעים מתייחס לרווח בר-סמך של 95%. הכוכבית מציינת את ההבדל המשמעותי בין הטיפול לקבוצת הביקורת [ניתוח שונות ריבועי (ANOVA), ולאחר מכן ההבדל המשמעותי ההוגן של טוקי (HSD) עבור השוואות מרובות לאחר המחקר, *P<0.05, **P<0.01 ו-*** P <0.001]. (ד) התמחות של דיאגרמות פיזור ופרופילי מטבוליטים מיוחדים (דגימות חוזרות עם טיפולים שונים).
כדי לבחון האם השיפוץ המושרה על ידי אוכלי עשב ברמת המטבולום משתקף בשינויים ברמת המטבוליטים האינדיבידואליים, התמקדנו תחילה במטבוליטים שנחקרו בעבר בעלים של Nepenthes pallens עם עמידות מוכחת לאוכלי עשב. אמידים פנוליים הם מצמדים של הידרוקסי-צינמאמיד-פוליאמין המצטברים במהלך תהליך האכילה של חרקים וידועים כמפחיתים את ביצועי החרקים (32). חיפשנו את המקדימים של MS/MS המתאימים ושרטטנו את עקומות הקינטיות המצטברות שלהם (איור S1). באופן לא מפתיע, נגזרות פנול שאינן מעורבות ישירות בהגנה מפני אוכלי עשב, כגון חומצה כלורוגנית (CGA) ורוטין, מווסתות כלפי מטה לאחר האכילה. לעומת זאת, אוכלי עשב יכולים להפוך את אמידי הפנול לחזקים ביותר. האכלה רציפה של שני אוכלי העשב הביאה לספקטרום עירור כמעט זהה של פנולמידים, ודפוס זה היה בולט במיוחד עבור סינתזה דה נובו של פנולמידים. אותה תופעה תיצפה בעת בחינת מסלול גליקוזידים של דיטרפן 17-הידרוקסיגרניל נוננדיול (17-HGL-DTGs), המייצר מספר רב של דיטרפנים אציקליים בעלי פונקציות יעילות נגד אוכלי עשב (33), אשר אכילת Ms עם Sl עוררה פרופיל ביטוי דומה (איור S1)).
החיסרון האפשרי של ניסויי האכלה ישירה של אוכלי עשב הוא ההבדל בקצב צריכת העלים ובזמן האכלה של אוכלי עשב, מה שמקשה על ביטול ההשפעות הספציפיות לאוכלי עשב הנגרמות על ידי פצעים ואוכלי עשב. על מנת לפתור טוב יותר את הספציפיות למין אוכלי עשב של התגובה המטבולית המושרת על העלים, ביצענו סימולציה של האכלת זחלי Ms ו-Sl על ידי יישום מיידי של OS שנאסף טרי (OSM ו-OSS1) על הדקירה הסטנדרטית W של מיקומי עלים עקביים. הליך זה נקרא טיפול W + OS, והוא סטנדרטיזציה של האינדוקציה על ידי תזמון מדויק של תחילת התגובה שמעורר אוכל העשב מבלי לגרום להשפעות מבלבלות של הבדלים בקצב או בכמות אובדן הרקמות (איור 2A) (34). באמצעות צינור הניתוח והחישוב של MS/MS, שלפנו 443 ספקטרום MS/MS (קובץ נתונים S1), אשר חפפו לספקטרום שהורכב בעבר מניסויי האכלה ישירה. ניתוח תורת המידע של מערך נתונים זה באמצעות MS/MS הראה כי תכנות מחדש של מטבולים המתמחים בעלים על ידי סימולציית אוכלי עשב הראה תמריצים ספציפיים ל-OS (איור 2C). בפרט, בהשוואה לטיפול ב-OSS1, OSM גרם לשיפור ההתמחות המטבולית לאחר 4 שעות. ראוי לציין כי בהשוואה למערך הנתונים הניסיוני של האכלה ישירה של אוכלי עשב, הקינטיקה המטבולית הוצגה במרחב דו-ממדי באמצעות Hj ו-δj כקואורדינטות וכיווניות ההתמחות המטבולית בתגובה לטיפול מדומה של אוכלי עשב לאורך זמן גדלה באופן עקבי (איור 2D). במקביל, כימתנו את תכולת חומצות האמינו, חומצות אורגניות וסוכרים (קובץ נתונים S2) כדי לבדוק האם עלייה ממוקדת זו במומחיות המטבולית נובעת מתצורה מחדש של מטבוליזם פחמן מרכזי בתגובה לאוכלי עשב מדומים (איור S2). כדי להסביר טוב יותר דפוס זה, עקבנו עוד יותר אחר קינטיקה של הצטברות מטבולית של מסלולי הפנולמיד ו-17-HGL-DTG שנדונו קודם לכן. האינדוקציה הספציפית ל-OS של אוכלי עשב הופכת לדפוס סידור מחדש דיפרנציאלי בתוך מטבוליזם הפנולמיד (איור S3). אמידים פנוליים המכילים קומרין וקבוצות קפאויל מושרים באופן מועדף על ידי OSS1, בעוד שאמידים מסוג OSM מפעילים אינדוקציה ספציפית של צמדים של פרוליל. עבור מסלול 17-HGL-DTG, זוהתה אינדוקציה דיפרנציאלית של OS על ידי תוצרי מלונילציה ודימלונילציה במורד הזרם (איור S3).
לאחר מכן, חקרנו את הפלסטיות של הטרנסקריפטום המושרה על ידי OS באמצעות מערך נתוני microarray של מהלך זמן, המדמה את השימוש ב-OSM לטיפול בעלים של צמח הרוזטה באוכלי עשב. קינטיקה של הדגימה חופפת בעיקרה לקינטיקה ששימשה במחקר מטבולומיקה זה (35). בהשוואה לקונפיגורציה מחדש של המטבולום, שבה הפלסטיות המטבולית עולה במיוחד לאורך זמן, אנו צופים בפרצי שעתוק חולפים בעלים המושרים על ידי Ms, כאשר השראת הטרנסקריפטום (RDPI) וההתמחות (δj) נמצאות ב-1. בנקודת זמן זו חלה עלייה משמעותית בשעות ובגיוון (Hj), הביטוי של BMP1 הופחת משמעותית, ולאחר מכן הרפיה של ההתמחות של הטרנסקריפטום (איור S4). משפחות גנים מטבוליות (כגון P450, גליקוזילטרנספראז ואצילטרנספראז BAHD) משתתפות בתהליך הרכבת מטבוליטים מיוחדים מיחידות מבניות הנגזרות ממטבוליזם ראשוני, בהתאם למודל ההתמחות הגבוהה המוקדם שהוזכר לעיל. כמקרה מחקר, נותח מסלול הפנילאלנין. הניתוח אישר כי הגנים המרכזיים במטבוליזם של פנולמיד מושרים במידה רבה על ידי OS באוכלי עשב בהשוואה לצמחים שאינם נמשכים, והם מיושרים זה עם זה בדפוסי הביטוי שלהם. גורם התעתוק MYB8 והגנים המבניים PAL1, PAL2, C4H ו-4CL במעלה הזרם של מסלול זה הראו התחלה מוקדמת של שעתוק. אצילטרנספראזות הממלאות תפקיד בהרכבה הסופית של פנולמיד, כגון AT1, DH29 ו-CV86, מציגות דפוס עלייה ממושך (איור S4). התצפיות לעיל מצביעות על כך שההתחלה המוקדמת של התמחות הטרנסקריפטום והשיפור המאוחר יותר של התמחות מטבולומיקה הן מצב מצומד, שעשוי להיות תוצאה של מערכת הרגולציה הסינכרונית היוזמת תגובת הגנה חזקה.
שינוי התצורה באיתות הורמוני צמחים משמש כשכבה רגולטורית המשלבת מידע מאוכלי עשב כדי לתכנת מחדש את הפיזיולוגיה של הצמחים. לאחר סימולציית אוכלי העשב, מדדנו את הדינמיקה המצטברת של קטגוריות מפתח של הורמוני צמחים והצגנו את הביטוי המשותף הזמני ביניהן [מקדם המתאם פירסון (PCC) > 0.4] (איור 3A). כצפוי, הורמוני צמחים הקשורים לביוסינתזה מקושרים בתוך רשת הביטוי המשותף של הורמוני צמחים. בנוסף, ספציפיות מטבולית (אינדקס Si) ממופה לרשת זו כדי להדגיש את הורמוני הצמח המושרים על ידי טיפולים שונים. מצוירים שני תחומים עיקריים של תגובה ספציפית לאוכלי עשב: האחד נמצא באשכול JA, שבו JA (צורתו הפעילה ביולוגית JA-Ile) ונגזרות JA אחרות מראות את ציון ה-Si הגבוה ביותר; השני הוא אתילן (ET). גיבברלין הראה רק עלייה מתונה ספציפית לאוכלי עשב, בעוד שהורמוני צמחים אחרים, כגון ציטוקינין, אוקסין וחומצה אבציסית, היו בעלי ספציפיות אינדוקציה נמוכה עבור אוכלי עשב. בהשוואה לשימוש ב-W + W בלבד, הגברת ערך השיא של נגזרות JA באמצעות יישום OS (W + OS) יכולה למעשה להפוך לאינדיקטור ספציפי חזק של JAs. באופן בלתי צפוי, OSM ו-OSS1 עם תכולת אליקטור שונה ידועים כגורמים להצטברות דומה של JA ו-JA-Ile. בניגוד ל-OSS1, OSM מושרה באופן ספציפי וחזק על ידי OSMs, בעוד ש-OSS1 אינו מגביר את התגובה של פצעים בסיסיים (איור 3B).
(א) ניתוח רשת ביטוי משותף המבוסס על חישוב PCC של סימולציית קינטיקה של הצטברות הורמונים צמחיים המושרה על ידי אוכלי עשב. הצומת מייצג הורמון צמחי יחיד, וגודל הצומת מייצג את מדד ה-Si הספציפי להורמון הצמחי בין טיפולים. (ב) הצטברות של JA, JA-Ile ו-ET בעלים הנגרמת על ידי טיפולים שונים, המסומנת על ידי צבעים שונים: משמש, W + OSM; כחול, W + OSSl; שחור, W + W; אפור, C (ביקורת). כוכביות מציינות הבדלים משמעותיים בין טיפול לבקרה (ANOVA דו-כיווני ואחריו השוואה מרובה פוסט-הוק של Tukey HSD, *** P <0.001). ניתוח תורת המידע של (C)697 MS/MS (קובץ נתונים S1) בביוסינתזה של JA וספקטרום תפיסה לקוי (irAOC ו-irCOI1) ו-(D)585 MS/MS (קובץ נתונים S1) ב-ETR1 עם אות ET לקוי. שני טיפולים מדומים של אוכלי עשב הפעילו קווי צמחים וצמחי בקרה של כלי רכב ריקים (EV). כוכביות מציינות הבדלים משמעותיים בין טיפול W+OS לבין קבוצת ביקורת שלא נפגעה (ANOVA דו-כיוונית ואחריה השוואה מרובה פוסט-הוק של Tukey HSD, *P<0.05, **P<0.01 ו-***P<0.001). (E) גרפים מפוזרים של התנגדות מפוזרת להתמחות. הצבעים מייצגים זנים מהונדסים גנטית שונים; הסמלים מייצגים שיטות טיפול שונות: משולש, W + OSS1; מלבן, W + OSM; עיגול C
לאחר מכן, אנו משתמשים בזן מהונדס גנטית של Nepenthes מוחלש (irCOI1 ו-sETR1) בשלבים המרכזיים של ביוסינתזה של JA ו-ET (irAOC ו-irACO) ותפיסה (irCOI1 ו-sETR1) כדי לנתח את חילוף החומרים של שני הורמוני צמחים אלה על אוכלי עשב. התרומה היחסית של תכנות מחדש. בהתאם לניסויים קודמים, אישרנו את האינדוקציה של herbivore-OS בצמחי נשאים ריקים (EV) (איור 3, C עד D) ואת הירידה הכוללת במדד Hj הנגרמת על ידי OSM, בעוד שמדד δj גדל. התגובה בולטת יותר מהתגובה המופעלת על ידי OSS1. גרף בן שתי שורות המשתמש ב-Hj ו-δj כקואורדינטות מראה את הדה-רגולציה הספציפית (איור 3E). המגמה הברורה ביותר היא שבזנים חסרי אות JA, גיוון המטבולים וההתמחות הנגרמים על ידי אוכלי עשב כמעט בוטלו לחלוטין (איור 3C). לעומת זאת, תפיסת ה-ET השקטה בצמחי sETR1, למרות שההשפעה הכוללת על שינויים בחילוף החומרים של אוכלי עשב נמוכה בהרבה מזו של איתות JA, מקטינה את ההבדל במדדי Hj ו-δj בין עירורים של OSM ו-OSS1 (איור 3D ואיור S5). זה מצביע על כך שבנוסף לתפקוד הליבה של התמרת אות JA, התמרת אות ET משמשת גם ככוונון עדין של התגובה המטבולית הספציפית למין של אוכלי עשב. בהתאם לתפקוד כוונון עדין זה, לא חל שינוי במושרה הכוללת של המטבולום בצמחי sETR1. מצד שני, בהשוואה לצמחי sETR1, צמחי irACO גרמו לאמפליטודות דומות של שינויים מטבוליים שנגרמו על ידי אוכלי עשב, אך הראו ציוני Hj ו-δj שונים משמעותית בין אתגרי OSM ו-OSS1 (איור S5).
על מנת לזהות מטבוליטים מיוחדים בעלי תרומה חשובה לתגובה הספציפית למין של אוכלי עשב ולכוונן את ייצורם באמצעות אותות ET, השתמשנו בשיטת MS/MS מבנית שפותחה בעבר. שיטה זו מסתמכת על שיטת אשכולות דו-צדדיים כדי להסיק מחדש את משפחת המטבוליזם משברי MS/MS [מכפלת נקודות מנורמלת (NDP)] וציון דמיון המבוסס על אובדן ניטרלי (NL). מערך הנתונים MS/MS שנבנה באמצעות ניתוח של קווים טרנסגניים של ET ייצר 585 MS/MS (קובץ נתונים S1), אשר נפתר על ידי קיבוצם בשבעה מודולי MS/MS עיקריים (M) (איור 4A). חלק מהמודולים הללו ארוזים בצפיפות עם מטבוליטים מיוחדים שאופיינו בעבר: לדוגמה, M1, M2, M3, M4 ו-M7 עשירים בנגזרות פנול שונות (M1), גליקוזידים פלבנואידים (M2), סוכרים אציליים (M3 ו-M4) ו-17-HGL-DTG (M7). בנוסף, מחושב המידע המטבולי הספציפי (אינדקס Si) של מטבוליט בודד בכל מודול, וניתן לראות באופן אינטואיטיבי את פיזור ה-Si שלו. בקצרה, ספקטרום MS/MS המציג ספציפיות גבוהה לאכילת עשב וספציפיות גנוטיפ מאופיין בערכי Si גבוהים, וסטטיסטיקות קורטוזיס מצביעות על פיזור הפרווה בפינה הימנית של הזנב. פיזור קולואיד רזה כזה זוהה ב-M1, שבו פנול אמיד הראה את שבר ה-Si הגבוה ביותר (איור 4B). 17-HGL-DTG המושרה על ידי אוכלי עשב שהוזכר קודם לכן ב-M7 הראה ציון Si בינוני, דבר המצביע על דרגה בינונית של ויסות דיפרנציאלי בין שני סוגי OS. לעומת זאת, רוב המטבוליטים המיוחדים המיוצרים באופן קונסטיטוטיבי, כגון רוטין, CGA וסוכרים אציליים, הם בין ציוני ה-Si הנמוכים ביותר. על מנת לחקור טוב יותר את המורכבות המבנית ואת פיזור ה-S בין מטבוליטים מיוחדים, נבנתה רשת מולקולרית עבור כל מודול (איור 4B). ניבוי חשוב של תיאוריית ה-OD (מסוכם באיור 1B) הוא שארגון מחדש של מטבוליטים מיוחדים לאחר אכילת עשב אמור להוביל לשינויים חד כיווניים במטבוליטים בעלי ערך הגנה גבוה, במיוחד על ידי הגדלת הספציפיות שלהם (בניגוד להתפלגות אקראית) מטבוליט הגנה כפי שניבא תיאוריית ה-MT. רוב נגזרות הפנול המצטברות ב-M1 קשורות פונקציונלית לירידה בביצועי החרקים (32). כאשר משווים את ערכי ה-Si במטבוליטים של M1 בין העלים המושרים לעלים המרכיבים את צמחי הבקרה EV לאחר 24 שעות, צפינו כי הספציפיות המטבולית של מטבוליטים רבים לאחר חרקים אוכלי עשב נמצאת במגמת עלייה משמעותית (איור 4C). העלייה הספציפית בערך Si זוהתה רק בפנולמידים הגנתיים, אך לא זוהתה עלייה בערך Si בפנולים אחרים ובמטבוליטים לא ידועים הקיימים יחד במודול זה. זהו מודל מיוחד, הקשור לתיאוריית ה-OD. התחזיות העיקריות לשינויים מטבוליים הנגרמים על ידי אוכלי עשב הן עקביות. על מנת לבדוק האם ייחוד זה של ספקטרום הפנולמיד הושרה על ידי ET ספציפי ל-OS, שרטטנו את מדד Si של המטבוליטים וגרמנו לערך ביטוי דיפרנציאלי בין OSM ל-OSS1 בגנוטיפים EV ו-sETR1 (איור 4D). ב-sETR1, ההבדל המושרה על ידי פנולמיד בין OSM ל-OSS1 הופחת במידה ניכרת. שיטת האשכול הדו-צדדי יושמה גם על נתוני MS/MS שנאספו בזנים עם JA לא מספיק כדי להסיק את המודולים העיקריים של MS/MS הקשורים להתמחות מטבולית המווסתת על ידי JA (איור S6).
(א) תוצאות האשכול של 585 MS/MS בהתבסס על מקטע משותף (דמיון NDP) ואובדן ניטרלי משותף (דמיון NL) גורמות לכך שהמודול (M) עקבי עם משפחת התרכובות הידועה, או על ידי הרכב מטבוליטים לא ידוע או שעבר מטבוליזם גרוע. ליד כל מודול מוצגת ההתפלגות הספציפית (Si) למטבוליט (MS/MS). (ב) רשת מולקולרית מודולרית: צמתים מייצגים MS/MS וקצוות, ציוני MS/MS של NDP (אדום) ו-NL (כחול) (סף, > 0.6). מדד הספציפיות המטבוליט המדורג (Si) צבוע בהתבסס על המודול (משמאל) וממופה לרשת המולקולרית (מימין). (ג) מודול M1 של צמח EV במצב מכונן (ביקורת) ומושרה (אוכלי עשב מדומה) לאחר 24 שעות: דיאגרמת רשת מולקולרית (ערך Si הוא גודל הצומת, פנולמיד הגנתי מודגש בכחול). (ד) דיאגרמת הרשת המולקולרית M1 של קו הספקטרום sETR1 עם תפיסה לקויה של EV ו-ET: התרכובת הפנולית המיוצגת על ידי הצומת העיגול הירוק, וההבדל המשמעותי (ערך P) בין טיפולי W + OSM ו-W + OSS1 כגודל הצומת. CP, N-קפאויל-טירוזין; CS, N-קפאויל-ספרמידין; FP, N-פרוליל חומצה אסטר-חומצה אוריק; FS, N-פרוליל-ספרמידין; CoP, N', N “-קומארוליל-טירוזין; DCS, N', N”-דיקפאויל-ספרמידין; CFS, N', N”-קפאויל, פרולואיל-ספרמידין; Lycium barbarum ב-wolfberry Son; Nick. O-AS, O-acyl sugar.
הרחבנו את הניתוח מגנוטיפ מוחלש יחיד של Nepenthes לאוכלוסיות טבעיות, שבהן שינויים תוך-ספציפיים חזקים ברמות JA אוכלי עשב ורמות מטבוליטים ספציפיים תוארו בעבר באוכלוסיות טבעיות (26). השתמשו במערך נתונים זה כדי לכסות 43 נבט-פלזמות. נבט-פלזמות אלו מורכבות מ-123 מיני צמחים מ-N. pallens. צמחים אלו נלקחו מזרעים שנאספו בבתי גידול מקומיים שונים ביוטה, נבאדה, אריזונה וקליפורניה (איור S7), חישבנו את גיוון המטבולים (כאן נקרא רמת אוכלוסייה) גיוון β) ואת ההתמחות הנגרמת על ידי OSM. בהתאם למחקרים קודמים, צפינו במגוון רחב של שינויים מטבוליים לאורך צירי Hj ו-δj, דבר המצביע על כך שלנבט-פלזמות יש הבדלים משמעותיים בפלסטיות של תגובותיהן המטבוליות לאוכלי עשב (איור S7). ארגון זה מזכיר תצפיות קודמות על טווח דינמי של שינויי JA הנגרמים על ידי אוכלי עשב, ושמר על ערך גבוה מאוד באוכלוסייה אחת (26, 36). באמצעות JA ו-JA-Ile לבדיקת המתאם הכולל בין Hj ל-δj, מצאנו כי קיים מתאם חיובי משמעותי בין JA לבין מדד הגיוון וההתמחות של מטבולימי β (איור S7). ממצא זה מצביע על כך שההטרוגניות הנגרמת על ידי אוכלי עשב באינדוקציה של JAs שזוהתה ברמת האוכלוסייה עשויה לנבוע מפולימורפיזמים מטבוליים מרכזיים הנגרמים מברירה מחרקים אוכלי עשב.
מחקרים קודמים הראו שסוגי טבק נבדלים מאוד בסוגם ובתלות היחסית שלהם בהגנות מטבוליות מושרות וקונסטיטטיביות. ההערכה היא ששינויים אלה בהעברת אותות ויכולות הגנה נגד אוכלי עשב מווסתים על ידי לחץ אוכלוסיית חרקים, מחזור חיי הצמח ועלויות ייצור ההגנה בנישה שבה גדל מין נתון. חקרנו את העקביות של עיצוב מחדש של מטבולום העלים המושרה על ידי אוכלי עשב של שישה מיני Nicotiana ילידי צפון אמריקה ודרום אמריקה. מינים אלה קרובים קשר הדוק ל-Nepenthes צפון אמריקה, כלומר Nicolas Bociflo.La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, טבק ליניארי, טבק (Nicotiana spegazzinii) וטבק עלי טבק (Nicotiana obtusifolia) (איור 5A) (37). שישה ממינים אלה, כולל המין המאופיין היטב N. please, הם צמחים חד-שנתיים של קבוצת הפטוניה, ו-obtusifolia N. הם צמחים רב שנתיים של קבוצת האחות Trigonophyllae (38). לאחר מכן, בוצעה אינדוקציה של W + W, W + OSM ו- W + OSS1 על שבעת המינים הללו כדי לחקור את הסידור מחדש המטבולי של תזונה של חרקים ברמת המין.
(א) עץ פילוגנטי bootstrap המבוסס על סבירות מקסימלית [לסינתזת גלוטמין גרעיני (38)] והתפלגות גיאוגרפית של שבעה מיני ניקוטיאנה קרובים (צבעים שונים) (37). (ב) תרשים פיזור של גיוון מיוחד עבור הפרופילים המטבוליים של שבעה מיני ניקוטיאנה (939 MS/MS; קובץ נתונים S1). ברמת המין, גיוון המטבולים נמצא בקורלציה שלילית עם מידת ההתמחות. ניתוח המתאם ברמת המין בין גיוון מטבולי והתמחות לבין הצטברות JA מוצג באיור 2. S9. צבע, סוגים שונים; משולש, W + OSS1; מלבן, W + OSM; (ג) הדינמיקה של JA ו-JA-Ile של ניקוטיאנה מדורגות לפי אמפליטודת עירור OS (ANOVA דו-כיוונית ו-Tukey HSD לאחר השוואה מרובה, * P <0.05, ** P <0.01 ו-* ** להשוואה של W + OS ו-W + W, P <0.001). תרשים קופסה של (D) גיוון ו-(E) התמחות של כל מין לאחר סימולציה של JA אוכלי עשב ומתיל (MeJA). הכוכבית מציינת את ההבדל המשמעותי בין W + OS לבין W + W או לנולין בתוספת W (Lan + W) או Lan בתוספת MeJA (Lan + MeJa) ובקרת Lan (ניתוח שונות דו-כיווני, ולאחר מכן השוואה מרובה פוסט-הוק של Tukey HSD, *P<0.05, **P<0.01 ו- ***P<0.001).
באמצעות שיטת האשכול הכפול, זיהינו 9 מודולים של 939 MS/MS (קובץ נתונים S1). הרכב ה-MS/MS שעברו הגדרה מחדש על ידי טיפולים שונים משתנה מאוד בין מודולים שונים בין מינים (איור S8). ויזואליזציה של Hj (המכונה כאן מגוון γ ברמת המין) ו-δj מגלה שמינים שונים מתאגדים לקבוצות שונות מאוד במרחב המטבולי, שבו חלוקה ברמת המין בדרך כלל בולטת יותר מעירור. למעט N. linear ו-N. obliquus, הם מציגים טווח דינמי רחב של השפעות אינדוקציה (איור 5B). לעומת זאת, למינים כמו N. purpurea ו-N. obtusifolia יש תגובה מטבולית פחות ברורה לטיפול, אך המטבולום מגוון יותר. ההתפלגות הספציפית למין של התגובה המטבולית המושרה הביאה לקורלציה שלילית משמעותית בין התמחות לגיוון גמא (PCC = -0.46, P = 4.9×10-8). שינויים ברמות JAs הנגרמים על ידי OS נמצאים בקורלציה חיובית עם התמחות מטבולי, וקורלציה שלילית עם גיוון גמא מטבולי שמוצג על ידי כל מין (איור 5B ואיור S9). ראוי לציין כי המינים המכונים בלשון הדיבור מיני "תגובת אות" באיור 5C, כגון נמטודות Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute ו-Nepenthes attenuated, גרמו לסימנים משמעותיים לאחר 30 דקות. התפרצויות JA ו-JA-Ile האחרונות ספציפיות ל-OS, בעוד שחיידקים אחרים המכונים "unresponsive signal", כגון Nepenthes mills, Nepenthes powdery ו-N. obtusifolia, מראים רק אינדוקציה של JA-Ile Edge ללא כל ספציפיות ל-OS (איור 5C). ברמה המטבולית, כפי שצוין לעיל, עבור Nepenthes מוחלש, החומרים המגיבים לאות הראו ספציפיות ל-OS והגדילו משמעותית את δj, תוך הפחתת Hj. אפקט התחלתי ספציפי זה ל-OS לא זוהה במינים המסווגים כמינים שאינם מגיבים לאות (איור 5, D ו-E). מטבוליטים ספציפיים ל-OS משותפים בתדירות גבוהה יותר בין מינים המגיבים לאות, ואשכולות אותות אלה מתקבצים עם מינים עם תגובות אותות חלשות יותר, בעוד שמינים עם תגובות אותות חלשות יותר מראים פחות תלות הדדית (איור S8). תוצאה זו מצביעה על כך שהאינדוקציה הספציפית ל-OS של JAs והקונפיגורציה הספציפית ל-OS של המטבולום במורד הזרם קשורות ברמת המין.
לאחר מכן, השתמשנו במשחת לנולין המכילה מתיל JA (MeJA) לטיפול בצמחים כדי לבדוק האם מצבי צימוד אלה מוגבלים על ידי זמינות ה-JA המופעלת על ידי JA אקסוגני, שיהיה בציטופלזמה של הצמחים. דה-אסטריפיקציה מהירה היא JA. מצאנו את אותה מגמה של שינוי הדרגתי ממינים מגיבים לאות למינים שאינם מגיבים לאות הנגרמים על ידי אספקה ​​רציפה של JA (איור 5, D ו-E). בקיצור, טיפול ב-MeJA תכנת מחדש באופן משמעותי את המטבולים של נמטודות ליניאריות, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens ו-N. mikimotoi, וכתוצאה מכך לעלייה משמעותית ב-δj ולירידה ב-Hj. N. purpurea הראה רק עלייה ב-δj, אך לא ב-Hj. N. obtusifolia, אשר הוכח בעבר כצובר רמות נמוכות במיוחד של JAs, גם הוא מגיב בצורה גרועה לטיפול ב-MeJA מבחינת קונפיגורציה מחדש של מטבולים. תוצאות אלו מצביעות על כך שייצור JA או התמרת אותות מוגבלים פיזיולוגית במינים שאינם מגיבים לאות. כדי לבחון השערה זו, חקרנו את ארבעת המינים (N. pallens, N. mills, N. pink ו-N. microphylla) המושרים על ידי W + W, W + OSMs ו-W + OSS1 Transcriptome (39). בהתאם לדפוס של עיצוב מחדש של מטבולומים, המינים מופרדים היטב במרחב הטרנסקריפטום, שביניהם N. attenuated הראה את ה-RDPI הגבוה ביותר המושרה על ידי OS, בעוד ש-N. gracilis הראה את הנמוך ביותר (איור 6A). עם זאת, נמצא כי גיוון הטרנסקריפטומים המושרה על ידי N. oblonga היה הנמוך ביותר מבין ארבעת המינים, בניגוד לגיוון המטבונומי הגבוה ביותר של N. oblonga שהוצג בעבר בשבעה מינים. מחקרים קודמים הראו כי קבוצת גנים הקשורים לאותות הגנה מוקדמים, כולל אותות JA, מסבירה את הספציפיות של תגובות הגנה מוקדמות המושרות על ידי גורמי אנרגיה הקשורים לאוכלי עשב במיני Nicotiana (39). השוואת מסלולי האיתות של JA בין ארבעת המינים הללו חשפה דפוס מעניין (איור 6B). רוב הגנים במסלול זה, כגון AOC, OPR3, ACX ו-COI1, הראו רמות גבוהות יחסית של אינדוקציה בארבעת המינים הללו. עם זאת, גן מפתח, JAR4, ממיר JA לצורתו הפעילה ביולוגית של תעתיקים מצטברים של JA-Ile, ורמת התעתוק שלו נמוכה מאוד, במיוחד ב-N. mills, Nepenthes pieris ו-N. microphylla. בנוסף, רק התעתיק של גן אחר AOS לא זוהה ב-N. bifidum. שינויים אלה בביטוי גנים עשויים להיות אחראים לפנוטיפים הקיצוניים הנגרמים על ידי ייצור JA נמוך במינים אנרגטיים לאותות ולאינדוקציה של N. gracilis.
(א) ניתוח תורת המידע של תכנות מחדש של תגובות תעתוק מוקדמות של ארבעה מיני טבק קרובים שנדגמו 30 דקות לאחר אינדוקציה של אכילת עשב. RDPI מחושב על ידי השוואת העלים המושרים על ידי מערכת העיכול של אוכלי העשב עם בקרת הפצע. הצבעים מציינים מינים שונים, והסמלים מציינים שיטות טיפול שונות. (ב) ניתוח ביטוי גנים במסלולי איתות של JA בקרב ארבעה מינים. נתיב JA הפשוט מוצג ליד תרשים הקופסאות. צבעים שונים מציינים שיטות עיבוד שונות. הכוכבית מציינת שיש הבדל משמעותי בין הטיפול W + OS לבין בקרת W + W (עבור מבחן t של סטודנט עבור הבדלים זוגיים, *P<0.05, **P<0.01 ו- ***P<0.001). OPDA, חומצה 12-אוקסופיטודיאנואית; OPC-8: חומצה 0,3-אוקסו-2(2′(Z)-פנטניל)-ציקלופנטן-1-אוקטנואית.
בחלק האחרון, חקרנו כיצד עיצוב מחדש ספציפי למין חרקים של המטבולום של מיני צמחים שונים יכול להיות עמיד בפני אוכלי עשב. מחקרים קודמים הדגישו את הסוג Nicotiana. עמידותם ל-Ms ולזחלים שונה מאוד (40). כאן, חקרנו את הקשר בין מודל זה לפלסטיות המטבולית שלהם. באמצעות ארבעת מיני הטבק הנ"ל, ובדיקת המתאם בין הגיוון וההתמחות של המטבולום הנגרם על ידי אוכלי עשב לבין עמידות הצמחים ל-Ms ול-Sl, מצאנו שהעמידות, הגיוון וההתמחות ל-Sl הכללי נמצאים בקורלציה חיובית, בעוד שהמתאם בין עמידות ל-expert ladies להתמחות חלש, והמתאם עם הגיוון אינו מובהק (איור S10). בנוגע לעמידות S1, גם ל-N. chinensis המוחלש וגם ל-N. gracilis, אשר הוכחו בעבר כמפגינים הן רמות התמרת אותות JA והן פלסטיות מטבולומן, היו תגובות שונות מאוד לאינדוקציה של אוכלי עשב, והם גם הראו עמידות גבוהה דומה.
בשישים השנים האחרונות, תיאוריית הגנת הצמחים סיפקה מסגרת תיאורטית, על בסיסה ניבאו חוקרים מספר ניכר של התפתחות ותפקודים של מטבוליטים מיוחדים בצמחים. רוב התיאוריות הללו אינן פועלות לפי ההליך הרגיל של הסקות חזקות (41). הן מציעות תחזיות מפתח (3) באותה רמת ניתוח. כאשר בדיקת תחזיות מפתח מאפשרת ניתוח של תיאוריות ספציפיות, הדבר יגרום לתמיכה, אך דחייה של אחרות (42). במקום זאת, התיאוריה החדשה מבצעת תחזיות ברמות ניתוח שונות ומוסיפה שכבה חדשה של שיקולים תיאוריים (42). עם זאת, ניתן להסביר בקלות את שתי התיאוריות המוצעות ברמה התפקודית, MT ו-OD, כניבויות חשובות של שינויים מטבוליים מיוחדים הנגרמים על ידי אוכלי עשב: תיאוריית OD מאמינה ששינויים ב"מרחב" מטבולי מיוחד הם כיווניים מאוד. תיאוריית MT מאמינה ששינויים אלה יהיו לא כיווניים וממוקמים באופן אקראי במרחב המטבולי, ונוטים להיות בעלי מטבוליטים בעלי ערך הגנה גבוה. בדיקות קודמות של תחזיות OD ו-MT נבדקו באמצעות קבוצה מצומצמת של תרכובות "הגנה" אפריוריות. בדיקות אלו, המתמקדות במטבוליטים, מונעות את היכולת לנתח את היקף ומסלול שינוי התצורה המטבולי במהלך אכילת עשב, ואינן מאפשרות בדיקות במסגרת סטטיסטית עקבית כדי לדרוש תחזיות מפתח שניתן להתייחס אליהן כמכלול לכמת שינויים במטבוליום של צמחים. כאן, השתמשנו בטכנולוגיה חדשנית במטבולומיקה המבוססת על MS חישובית וביצענו ניתוח MS דקונבולוציה בתיאורי תיאוריית המידע הכללית כדי לבחון את ההבדל בין השניים המוצעים ברמת המטבולומיקה הגלובלית. התחזית המרכזית של תיאוריה זו. תיאוריית המידע יושמה בתחומים רבים, במיוחד בהקשר של מגוון ביולוגי ומחקר זרימת חומרי הזנה (43). עם זאת, ככל הידוע לנו, זהו היישום הראשון המשמש לתיאור מרחב המידע המטבולי של צמחים ולפתרון בעיות אקולוגיות הקשורות לשינויים מטבוליים זמניים בתגובה לרמזים סביבתיים. בפרט, יכולתה של שיטה זו טמונה ביכולתה להשוות דפוסים בתוך ובין מיני צמחים כדי לבחון כיצד אוכלי עשב התפתחו ממינים שונים לדפוסים מאקרו-אבולוציוניים בין-מינים ברמות שונות של אבולוציה. מטבוליזם.
ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) ממיר מערך נתונים רב-משתני למרחב צמצום ממדיות כך שניתן להסביר את המגמה העיקרית של הנתונים, ולכן הוא משמש בדרך כלל כטכניקת חקר לניתוח מערך הנתונים, כגון מטבולום של פירוק. עם זאת, צמצום ממדיות יאבד חלק מתוכן המידע במערך הנתונים, ו-PCA אינו יכול לספק מידע כמותי על מאפיינים הרלוונטיים במיוחד לתיאוריה האקולוגית, כגון: כיצד אוכלי עשב מגדירים מחדש גיוון בתחומים מיוחדים (לדוגמה, עושר, תפוצה ושפע) של מטבוליטים? אילו מטבוליטים הם גורמים מנבאים למצב המושרה של אוכל עשב נתון? מנקודת מבט של ספציפיות, גיוון והשריה, תוכן המידע של פרופיל המטבוליטים הספציפי לעלה מפורק, ונמצא שאכילת אוכלי עשב יכולה להפעיל מטבוליזם ספציפי. באופן בלתי צפוי, ראינו כי, כפי שתואר באינדיקטורי תורת המידע שיושמו, למצב המטבולי שנוצר יש חפיפה גדולה לאחר התקפותיהם של שני אוכלי העשב (הגנרליסט שניזון בלילה Sl) ומומחית הסולניים Ms. למרות שהתנהגות האכילה והריכוז שלהם שונים באופן משמעותי. יוזם חומצת שומן-חומצת אמינו מצומדת (FAC) ב-OS (31). באמצעות OS אוכלי עשב לטיפול בפצעי דקירה סטנדרטיים, טיפול מדומה של אוכלי עשב הראה גם הוא מגמה דומה. הליך סטנדרטי זה לסימולציה של תגובת צמחים להתקפות אוכלי עשב מבטל את הגורמים המבלבלים הנגרמים משינויים בהתנהגות האכילה של אוכלי עשב, המובילים לדרגות שונות של נזק בזמנים שונים (34). FAC, הידוע כגורם העיקרי ל-OSM, מפחית JAS ותגובות הורמוני צמחים אחרים ב-OSS1, בעוד ש-OS1 מופחת פי מאות (31). עם זאת, OSS1 גרם לרמות דומות של הצטברות JA בהשוואה ל-OSM. בעבר הודגם כי תגובת JA ב-Nepenthes מוחלש רגישה מאוד ל-OSM, כאשר FAC יכול לשמור על פעילותו גם אם מדולל במים ביחס של 1:1000 (44). לכן, בהשוואה ל-OSM, למרות ש-FAC ב-OSS1 נמוך מאוד, הוא מספיק כדי לגרום להתפרצות מספקת של JA. מחקרים קודמים הראו כי חלבונים דמויי פורין (45) ואוליגוסכרידים (46) יכולים לשמש כרמזים מולקולריים להפעלת תגובות הגנה צמחיות ב-OSS1. עם זאת, עדיין לא ברור האם מעוררי מחלה אלו ב-OSS1 אחראים להצטברות של JA שנצפתה במחקר הנוכחי.
למרות שישנם מעט מחקרים המתארים את טביעות האצבע המטבוליות השונות הנגרמות על ידי שימוש באוכלי עשב שונים או חומצה סליצילית (JA) או חומצה סליצילית (SA) אקסוגניים (47), איש לא הפריע את ההפרעה הספציפית למין אוכלי העשב ברשת העשב של הצמח ואת השפעותיה על המידע האישי הספציפי. ניתוח זה אישר עוד כי הקשר של רשת ההורמונים הפנימית עם הורמוני צמחים אחרים מלבד JA מעצב את הספציפיות של הארגון מחדש המטבולי הנגרם על ידי אוכלי עשב. בפרט, זיהינו כי ET הנגרם על ידי OSM היה גדול משמעותית מזה הנגרם על ידי OSS1. מצב זה עולה בקנה אחד עם תכולת FAC רבה יותר ב-OSM, שהוא תנאי הכרחי ומספיק להפעלת פרץ ET (48). בהקשר של האינטראקציה בין צמחים לאוכלי עשב, פונקציית האיתות של ET על דינמיקת מטבוליטים ספציפיים לצמח עדיין ספורדית ומכוונת רק לקבוצת תרכובות אחת. בנוסף, רוב המחקרים השתמשו ביישום אקסוגני של ET או של קודמיו או מעכבים שונים כדי לחקור את ויסות ה-ET, שביניהן יישומים כימיים אקסוגניים אלה ייצרו תופעות לוואי רבות ולא ספציפיות. למיטב ידיעתנו, מחקר זה מייצג את הבדיקה השיטתית הראשונה בקנה מידה גדול של תפקיד ה-ET בשימוש ב-ET לייצור ותפיסה של צמחים טרנסגניים פגומים כדי לתאם את הדינמיקה של מטבולום צמחי. אינדוקציה של ET ספציפית לאוכלי עשב יכולה בסופו של דבר לווסת את תגובת המטבולומה. המשמעותי ביותר הוא המניפולציה הטרנסגנית של גנים של ביוסינתזה (ACO) ותפיסה (ETR1) של ET שחשפה את הצטברות הפנולאמידים הספציפית לאוכלי עשב דה נובו. בעבר הוכח כי ET יכול לכוונן את הצטברות הניקוטין הנגרמת על ידי JA על ידי ויסות פוטרסין N-מתילטרנספראז (49). עם זאת, מנקודת מבט מכנית, לא ברור כיצד ET מכוון את האינדוקציה של פנולאמיד. בנוסף לתפקוד העברת האותות של ET, ניתן גם להפנות את השטף המטבולי ל-S-אדנוזיל-1-מתיונין כדי לווסת את ההשקעה באמידים של פוליאמינופנול. S-אדנוזיל-1-מתיונין הוא ET ותוצר ביניים נפוץ במסלול ביוסינתזה של פוליאמין. המנגנון שבו אות ET מווסת את רמת הפנולמיד זקוק למחקר נוסף.
במשך זמן רב, עקב המספר הרב של מטבוליטים מיוחדים בעלי מבנה לא ידוע, תשומת הלב העזה לקטגוריות מטבוליות ספציפיות לא הצליחה להעריך באופן מדויק את השינויים הזמניים בגיוון המטבולי לאחר אינטראקציות ביולוגיות. נכון לעכשיו, בהתבסס על ניתוח תורת המידע, התוצאה העיקרית של רכישת ספקטרום MS/MS המבוססת על מטבוליטים בלתי מוטים היא שאוכלי עשב שאוכלים או מדמים אוכלי עשב ממשיכים להפחית את הגיוון המטבולי הכולל של מטבולום העלה תוך הגברת מידת ההתמחות שלו. עלייה זמנית זו בספציפיות המטבולומית הנגרמת על ידי אוכלי עשב קשורה לעלייה סינרגיסטית בספציפיות הטרנסקריפטומית. התכונה התורמת ביותר להתמחות מטבולומית גדולה יותר זו (בעלת ערך Si גבוה יותר) היא המטבוליט המיוחד בעל תפקוד העשבוני שאופיין קודם לכן. מודל זה עולה בקנה אחד עם ניבוי תורת ה-OD, אך ניבוי MT הקשור לאקראיות של תכנות מחדש של מטבולומית אינו עקבי. עם זאת, נתונים אלה עולים בקנה אחד גם עם ניבוי המודל המעורב (MT הטוב ביותר; איור 1B), מכיוון שמטבוליטים אחרים שלא אופיינו בעלי תפקודי הגנה לא ידועים עדיין עשויים לעקוב אחר התפלגות Si אקראית.
דפוס ראוי לציון נוסף שנתפס עוד במחקר זה הוא שמרמת המיקרו-אבולוציה (צמח בודד ואוכלוסיית טבק) ועד לקנה מידה אבולוציוני גדול יותר (מיני טבק קרובים), רמות שונות של ארגון אבולוציוני הן "ההגנה הטובה ביותר". ישנם הבדלים משמעותיים ביכולותיהם של אוכלי עשב. מור ואחרים (20) וקסלר וקאלסקה (1) הציעו באופן עצמאי להמיר את שלוש הרמות התפקודיות של המגוון הביולוגי שהובחנו במקור על ידי ויטאקר (50) לשינויים הזמניים המכוננים והמושרים של המגוון הכימי; מחברים אלה לא סיכמו. ההליכים לאיסוף נתוני מטבולום בקנה מידה גדול גם אינם מתארים כיצד לחשב את המגוון המטבולי מנתונים אלה. במחקר זה, התאמות קלות לסיווג התפקודי של ויטאקר יתייחסו למגוון α-מטבולי כמגוון של ספקטרום MS/MS בצמח נתון, ולמגוון β-מטבולי כמטבוליזם התוך-ספציפי הבסיסי של קבוצת אוכלוסיות בחלל, וגיוון γ-מטבולי יהיה הרחבה של הניתוח של מינים דומים.
אות ה-JA חיוני למגוון רחב של תגובות מטבוליות של אוכלי עשב. עם זאת, קיים מחסור בבדיקות כמותיות קפדניות של תרומת הרגולציה התוך-ספציפית של ביוסינתזה של JA לגיוון מטבולי, והאם אות ה-JA הוא אתר כללי לגיוון מטבולי המושרה על ידי עקה בקנה מידה מאקרו-אבולוציוני גבוה יותר עדיין חמקמק. צפינו כי האופי העשבוני של Nepenthes העשבוני גורם להתמחות מטבולי, והשונות של התמחות מטבולי בתוך אוכלוסיית מיני Nicotiana ובקרב מיני Nicotiana קרובים זה לזה מתואמת באופן חיובי באופן שיטתי עם אות ה-JA. בנוסף, כאשר אות ה-JA נפגע, הספציפיות המטבולית הנגרמת על ידי אוכלי עשב גנוטיפ יחיד תבוטל (איור 3, C ו-E). מכיוון שהשינויים בספקטרום המטבולי של אוכלוסיות Nepenthes המוחלשות באופן טבעי הם בעיקר כמותיים, השינויים בגיוון β ובספציפיות המטבולית בניתוח זה עשויים להיגרם במידה רבה על ידי עירור חזק של קטגוריות תרכובות עשירות במטבוליטים. קבוצות תרכובות אלו שולטות בחלק מפרופיל המטבולי ומובילות לקורלציה חיובית עם אותות ה-JA.
מכיוון שהמנגנונים הביוכימיים של מיני הטבק הקשורים אליו באופן הדוק שונים מאוד, המטבוליטים מזוהים באופן ספציפי בהיבט האיכותני, כך שהוא אנליטי יותר. עיבוד הפרופיל המטבולי שנלכד על ידי תורת האינפורמציה מגלה כי אינדוקציה של אוכלי עשב מחריפה את האיזון בין גיוון גמא מטבולי לבין התמחות. אות ה-JA ממלא תפקיד מרכזי באיזון זה. העלייה בהתמחות המטבולומית עולה בקנה אחד עם ניבוי ה-OD העיקרי והיא מתואמת באופן חיובי עם אות ה-JA, בעוד שאות ה-JA מתואם באופן שלילי עם גיוון גמא מטבולי. מודלים אלה מצביעים על כך שקיבולת ה-OD של צמחים נקבעת בעיקר על ידי הפלסטיות של ה-JA, בין אם בקנה מידה מיקרו-אבולוציוני ובין אם בקנה מידה אבולוציוני גדול יותר. ניסויים אקסוגניים ביישום JA שעוקפים פגמים בביוסינתזה של JA מגלים עוד כי ניתן להבחין בין מיני טבק קרובים למינים מגיבים לאות ומינים שאינם מגיבים לאות, בדיוק כמו אופן ה-JA שלהם ופלסטיות המטבולומית המושרת על ידי אוכלי עשב. מינים שאינם מגיבים לאות אינם יכולים להגיב עקב חוסר יכולתם לייצר JA אנדוגני ולכן כפופים למגבלות פיזיולוגיות. ייתכן שזה נגרם על ידי מוטציות בכמה גנים מרכזיים במסלול האיתות של JA (AOS ו-JAR4 ב-N. crescens). תוצאה זו מדגישה כי דפוסי מאקרו-אבולוציוניים בין-מיניים אלה עשויים להיות מונעים בעיקר על ידי שינויים בתפיסה פנימית של הורמונים ותגובתיות.
בנוסף לאינטראקציה בין צמחים לאוכלי עשב, חקר הגיוון המטבולי קשור לכל ההתקדמות התיאורטית החשובה במחקר ההסתגלות הביולוגית לסביבה ובאבולוציה של תכונות פנוטיפיות מורכבות. עם העלייה בכמות הנתונים שנרכשו על ידי מכשירי MS מודרניים, בדיקת השערות על גיוון מטבולי יכולה כעת להתעלות מעל הבדלים מטבוליטים אינדיבידואליים/קטגוריות ולבצע ניתוח גלובלי כדי לחשוף דפוסים בלתי צפויים. בתהליך הניתוח בקנה מידה גדול, מטאפורה חשובה היא הרעיון של יצירת מפות משמעותיות בהן ניתן להשתמש כדי לחקור נתונים. לכן, תוצאה חשובה של השילוב הנוכחי של מטבולומיקה MS/MS בלתי מוטה ותורת המידע היא שהוא מספק מדד פשוט שניתן להשתמש בו כדי לבנות מפות כדי לעיין בגיוון המטבולי בקני מידה טקסונומיים שונים. זוהי הדרישה הבסיסית של שיטה זו. חקר אבולוציה מיקרו/מאקרו ואקולוגיה קהילתית.
ברמה המקרו-אבולוציונית, ליבת תיאוריית האבולוציה המשותפת של צמחים וחרקים של ארליך ורייבן (51) היא לחזות כי השונות בגיוון המטבולי הבין-מינים היא הגורם לגיוון של שושלות צמחים. עם זאת, בחמישים השנים שחלפו מאז פרסום עבודה פורצת דרך זו, השערה זו נבדקה לעיתים רחוקות (52). זאת בעיקר בשל המאפיינים הפילוגנטיים של מאפיינים מטבוליים דומים בין שושלות צמחים למרחקים ארוכים. ניתן להשתמש בנדירות זו כדי לעגן שיטות ניתוח מטרות. זרימת העבודה הנוכחית של MS/MS המעובדת על ידי תורת המידע מכמתת את הדמיון המבני של MS/MS של מטבוליטים לא ידועים (ללא בחירת מטבוליטים מוקדמת) וממירה את ה-MS/MS הללו לקבוצה של MS/MS, וכך במטבוליזם מקצועי מודלים מקרו-אבולוציוניים אלה מושווים בסולם סיווג. אינדיקטורים סטטיסטיים פשוטים. התהליך דומה לניתוח פילוגנטי, שיכול להשתמש ביישור רצפים כדי לכמת את קצב הגיוון או התפתחות האופי ללא ניבוי מוקדם.
ברמה הביוכימית, השערת הסינון של Firn ו-Jones (53) מראה כי גיוון מטבולי נשמר ברמות שונות כדי לספק חומרי גלם להפעלת הפעילויות הביולוגיות של מטבוליטים שלא היו קשורים בעבר או שהוחלפו. שיטות תורת המידע מספקות מסגרת שבה ניתן לכמת את המעברים האבולוציוניים הספציפיים למטבוליטים המתרחשים במהלך התמחות מטבוליטים כחלק מתהליך הסינון האבולוציוני המוצע: הסתגלות פעילה ביולוגית מסגוליות נמוכה לסגוליות גבוהה מטבוליטים מעוכבים של סביבה נתונה.
בסך הכל, בימיה הראשונים של הביולוגיה המולקולרית פותחו תיאוריות חשובות להגנה על צמחים, ושיטות דדוקטיביות המבוססות על השערות נחשבות באופן נרחב לאמצעי היחיד להתקדמות מדעית. זאת בעיקר בשל המגבלות הטכניות של מדידת המטבולום כולו. למרות ששיטות המבוססות על השערות שימושיות במיוחד בבחירת מנגנונים סיבתיים אחרים, יכולתן לקדם את הבנתנו את הרשתות הביוכימיות מוגבלת יותר משיטות החישוב הזמינות כיום במדע עכשווי עתיר נתונים. לכן, תיאוריות שלא ניתן לחזות הן הרבה מעבר לתחום הנתונים הזמינים, כך שלא ניתן לבטל את מחזור הנוסחה/מבחן ההיפותטי של ההתקדמות בתחום המחקר (4). אנו צופים כי זרימת העבודה החישובית של מטבולומיקה המוצגת כאן יכולה לעורר מחדש את העניין בנושאים האחרונים (איך) והסופיים (למה) של גיוון מטבולי, ולתרום לעידן חדש של מדע נתונים מוכוון תיאורטית. העידן בחן מחדש את התיאוריות החשובות שהיוו השראה לדורות קודמים.
האכלה ישירה של אוכלי עשב מתבצעת על ידי גידול זחל בשלב שני או זחל Sl על עלה בודד של צמח כד בצבע בהיר של צמח בודד הפורח ורדים, עם 10 שכפולים של צמח לכל צמח. זחלי החרקים נלכדו באמצעות מלחציים, ורקמת העלה הנותרת נאספה 24 ו-72 שעות לאחר ההדבקה והוקפאה במהירות, והמטבוליטים חולצו.
הדמיית טיפול באוכלי עשב בצורה מסונכרנת ביותר. השיטה היא להשתמש בגלגלי תבנית בד כדי לנקב שלוש שורות של קוצים בכל צד של הצלע האמצעית של שלושת העלים שהתפשטו במלואם של הצמח במהלך שלב הצמיחה של זר הבד, וליישם מיד Ms מדוללת ביחס של 1:5. או להשתמש באצבעות עטויות כפפות כדי להחדיר S1 OS לפצע הדקירה. לקצור ולעבד עלה כמתואר לעיל. להשתמש בשיטה שתוארה קודם לכן כדי לחלץ מטבוליטים ראשוניים והורמוני צמחים (54).
עבור יישומים חיצוניים של JA, שלושת עלי הפטוטרת של כל אחד מששת צמחי פורח הוורדים מכל מין מטופלים ב-20 מיקרוליטר של משחת לנולין המכילה 150 מיקרוגרם MeJA (Lan + MeJA), ו-20 מיקרוליטר של לנולין בתוספת טיפול לפצעים (Lan + W), או להשתמש ב-20 מיקרוליטר לנולין טהור כביקורת. העלים נקצרו 72 שעות לאחר הטיפול, הוקפאו במהירות בחנקן נוזלי ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
ארבעה קווים טרנסגניים של JA ו-ET, דהיינו irAOC (36), irCOI1 (55), irACO ו-sETR1 (48), זוהו בקבוצת המחקר שלנו. irAOC הראה ירידה משמעותית ברמות JA ו-JA-Ile, בעוד ש-irCOI1 לא היה רגיש ל-JAs. בהשוואה ל-EV, הצטברות JA-Ile גדלה. באופן דומה, irACO יפחית את ייצור ה-ET, ובהשוואה ל-EV, sETR1, שאינו רגיש ל-ET, יגביר את ייצור ה-ET.
ספקטרומטר לייזר פוטו-אקוסטי (חיישן ET בזמן אמת מדגם Sensor Sense ETD-300) משמש לביצוע מדידת ET באופן לא פולשני. מיד לאחר הטיפול, מחצית מהעלים נחתכו והועברו לבקבוקון זכוכית אטום בנפח 4 מ"ל, וחלל העלים הותר להצטבר תוך 5 שעות. במהלך המדידה, כל בקבוקון נשטף בזרם של 2 ליטר/שעה של אוויר טהור למשך 8 דקות, שעבר קודם לכן דרך זרז שסופק על ידי Sensor Sense להסרת CO2 ומים.
נתוני המיקרו-מערך פורסמו במקור ב-(35) ונשמרו במאגר הנתונים המקיף של ביטוי גנים של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) (מספר גישה GSE30287). הנתונים התואמים לעלים שנגרמו כתוצאה מטיפול W + OSMs ולקבוצת הבקרה שלא ניזוקה חולצו עבור מחקר זה. עוצמת הגולמית היא log2. לפני הניתוח הסטטיסטי, קו הבסיס הומר ונורמל לאחוזון ה-75 שלו באמצעות חבילת התוכנה R.
נתוני ריצוף ה-RNA המקוריים (RNA-seq) של מיני Nicotiana נלקחו מארכיון הקריאה הקצר (SRA) של NCBI, מספר הפרויקט הוא PRJNA301787, אשר דווח על ידי Zhou ואחרים (39) והמשיכו כמתואר ב-(56). הנתונים הגולמיים שעובדו על ידי W + W, W + OSM ו-W + OSS1 התואמים למיני Nicotiana נבחרו לניתוח במחקר זה, ועובדו באופן הבא: ראשית, קריאות ה-RNA-seq הגולמיות הומרו לפורמט FASTQ. HISAT2 ממיר FASTQ ל-SAM, ו-SAMtools ממיר קבצי SAM לקבצי BAM ממוינים. StringTie משמש לחישוב ביטוי גנים, ושיטת הביטוי שלו היא שישנם מקטעים לכל אלף מקטעי בסיס לכל מיליון מקטעי שעתוק מרוצפים.
עמודת הכרומטוגרפיה Acclaim (150 מ"מ x 2.1 מ"מ; גודל חלקיקים 2.2 מיקרומטר) ששימשה בניתוח ועמודת ה-Guard בגודל 4 מ"מ x 4 מ"מ עשויות מאותו חומר. הגרדיאנט הבינארי הבא משמש במערכת כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC) Dionex UltiMate 3000: 0 עד 0.5 דקות, איזוקרטי 90% A [מים מזוקקים, 0.1% (v/v) אצטוניטריל ו-0.05% חומצה פורמית], 10% B (אצטוניטריל ו-0.05% חומצה פורמית); 0.5 עד 23.5 דקות, פאזת הגרדיאנט היא 10% A ו-90% B, בהתאמה; 23.5 עד 25 דקות, איזוקרטי 10% A ו-90% B. קצב הזרימה הוא 400 מיקרוליטר/דקה. עבור כל ניתוחי ה-MS, יש להזריק את נוזל האלואנט של העמודה לתוך מנתח קוואדרופול וזמן טיסה (qTOF) המצויד במקור אלקטרוספרייס הפועל במצב יינון חיובי (מתח קפילרי, 4500 וולט; יציאה קפילרית 130 וולט; טמפרטורת ייבוש 200 מעלות צלזיוס; זרימת אוויר לייבוש 10 ליטר/דקה).
בצעו ניתוח מקטעי MS/MS (להלן MS/MS) שאינם רלוונטיים או שאינם ניתנים להבחנה מהנתונים כדי לקבל מידע מבני על הפרופיל המטבולי הכולל הניתן לזיהוי. הרעיון של שיטת MS/MS חסרת ההבחנה מסתמך על העובדה שלקוואדרופול יש חלון בידוד מסה גדול מאוד [לכן, יש להתייחס לכל אותות יחס המסה-למטען (m/z) כשברים]. מסיבה זו, מכיוון שמכשיר ה-Impact II לא הצליח ליצור הטיה של CE, בוצעו מספר ניתוחים בלתי תלויים תוך שימוש בערכי אנרגיית התנגשות דיסוציאציה (CE) מוגברים. בקיצור, ראשית, נתחו את הדגימה באמצעות יינון אלקטרוספריי UHPLC/qTOF-MS באמצעות מצב ספקטרומטריית מסה יחידה (תנאי פרגמנטציה נמוכה שנוצרים על ידי פרגמנטציה במקור), סריקה מ-m/z 50 עד 1500 בתדר חזרה של 5 הרץ. השתמשו בחנקן כגז התנגשות לניתוח MS/MS, ובצעו מדידות בלתי תלויות בארבעת מתחי הדיסוציאציה השונים הבאים: 20, 30, 40 ו-50 eV. לאורך תהליך המדידה, לקוואדרופול יש את חלון בידוד המסה הגדול ביותר, מ-m/z 50 עד 1500. כאשר ניסוי m/z של הגוף הקדמי ורוחב הבידוד מוגדרים ל-200, טווח המסה מופעל אוטומטית על ידי תוכנת ההפעלה של המכשיר ו-0 Da. סרוק אחר שברי מסה כמו במצב מסה יחידה. השתמש בפורמט נתרן (50 מ"ל איזופרופנול, 200 מיקרוליטר חומצה פורמית ו-1 מ"ל תמיסת מימית 1M NaOH) לכיול המסה. באמצעות אלגוריתם הכיול הדיוק הגבוה של Bruker, קובץ הנתונים מכויל לאחר הרצת הספקטרום הממוצע בפרק זמן נתון. השתמש בפונקציית הייצוא של תוכנת Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Germany) כדי להמיר את קבצי הנתונים הגולמיים לפורמט NetCDF. מערך הנתונים MS/MS נשמר במסד הנתונים המטבולומיקה הפתוח MetaboLights (www.ebi.ac.uk) עם מספר הגישה MTBLS1471.
ניתן לממש הרכבת MS/MS באמצעות ניתוח קורלציה בין אותות איכות MS1 ו-MS/MS עבור אנרגיית התנגשות נמוכה וגבוהה וכללים חדשים המיושמים. סקריפט R משמש למימוש ניתוח הקורלציה של התפלגות הקודמן למוצר, וסקריפט C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) משמש ליישום הכללים.
על מנת להפחית שגיאות חיוביות שגויות הנגרמות מרעשי רקע וקורלציה כוזבת הנגרמת מגילוי מאפייני m/z מסוימים במספר מצומצם של דגימות, אנו משתמשים בפונקציית "filled peak" של חבילת R XCMS (לתיקון רעשי רקע). יש להשתמש בה כדי להחליף את עוצמת ה-"NA" (שיא בלתי מזוהה). כאשר משתמשים בפונקציית fill peak, עדיין ישנם ערכי עוצמה רבים של "0" במערך הנתונים שישפיעו על חישוב הקורלציה. לאחר מכן, אנו משווים את תוצאות עיבוד הנתונים שהתקבלו כאשר נעשה שימוש בפונקציית fill peak וכאשר לא נעשה שימוש בפונקציית fill peak, ומחשבים את ערך רעש הרקע על סמך הערך המשוער המתוקן הממוצע, ולאחר מכן מחליפים את ערכי העוצמה של 0 הללו בערך הרקע המחושב. כמו כן, שקלנו רק מאפיינים שעוצמתם עלתה פי שלושה מערך הרקע וראינו אותם כ"שיאים אמיתיים". עבור חישובי PCC, נלקחים בחשבון רק אותות m/z של קודמן הדגימה (MS1) וקבוצות נתוני הפרגמנט עם לפחות שמונה שיאים אמיתיים.
אם עוצמת מאפיין האיכות של המבשר בדגימה כולה מתואמת באופן משמעותי עם העוצמה המופחתת של אותו מאפיין איכות הנתון לאנרגיית התנגשות נמוכה או גבוהה, והמאפיין אינו מתויג כשיא איזוטופי על ידי CAMERA, ניתן להגדירו עוד יותר. לאחר מכן, על ידי חישוב כל זוגות המבשר-תוצר האפשריים בתוך 3 שניות (חלון זמן השמירה המשוער לשמירת שיא), מתבצע ניתוח המתאם. רק כאשר ערך m/z נמוך מערך המבשר ופרגמנטציה של MS/MS מתרחשת באותו מיקום דגימה במערך הנתונים כמו המבשר שממנו הוא נגזר, הוא נחשב פרגמנט.
בהתבסס על שני כללים פשוטים אלה, אנו שוללים את השברים שצוינו עם ערכי m/z גדולים מ-m/z של המבשר שזוהה, ובהתבסס על מיקום הדגימה שבו מופיע המבשר ועל השבר שצוין. ניתן גם לבחור את מאפייני האיכות שנוצרו על ידי שברים רבים במקור שנוצרו במצב MS1 כמבשרים מועמדים, ובכך ליצור תרכובות MS/MS מיותרות. על מנת להפחית את יתירות הנתונים הזו, אם דמיון ה-NDP של הספקטרום עולה על 0.6, והם שייכים לכרומטוגרמה "pcgroup" המבוארת על ידי CAMERA, נמזג אותם. לבסוף, אנו ממזגים את כל ארבע תוצאות ה-CE הקשורות למבשר ולשברים לספקטרום המרוכב הסופי המפורק על ידי בחירת שיא העוצמה הגבוהה ביותר מבין כל השברים המועמדים עם אותו ערך m/z באנרגיות התנגשות שונות. שלבי העיבוד הבאים מבוססים על מושג הספקטרום המרוכב ולוקחים בחשבון את תנאי ה-CE השונים הנדרשים כדי למקסם את ההסתברות לפיצול, מכיוון שניתן לזהות שברים מסוימים רק תחת אנרגיית התנגשות ספציפית.
RDPI (30) שימש לחישוב ההשראות של הפרופיל המטבולי. גיוון הספקטרום המטבולי (אינדקס Hj) נגזר משפע של תוצרי MS/MS באמצעות האנטרופיה של שאנון של התפלגות התדרים MS/MS באמצעות המשוואה הבאה שתוארה על ידי מרטינז ואחרים (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) כאשר Pij מתאים לתדירות היחסית של ה-MS/MS ה-i בדגימה ה-j (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
ספציפיות מטבולית (אינדקס Si) מוגדרת כזהות הביטוי של MS/MS נתון ביחס לתדירות בין הדגימות הנבחנות. ספציפיות MS/MS מחושבת כ-Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
השתמשו בנוסחה הבאה כדי למדוד את מדד δj הספציפי למטבולום של כל דגימה j, ואת הממוצע של ספציפיות MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
ספקטרומי MS/MS מיושרים בזוגות, והדמיון מחושב על סמך שני הציונים. ראשית, באמצעות NDP סטנדרטי (הידועה גם כשיטת קורלציה קוסינוס), השתמשו במשוואה הבאה כדי לדרג את דמיון המקטע בין הספקטרומים: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 כאשר S1 ו-S2. בהתאמה, עבור ספקטרום 1 וספקטרום 2, כמו גם WS1, i ו-WS2, i מייצג את המשקל המבוסס על עוצמת השיא שבו ההפרש של השיא המשותף ה-i בין שני הספקטרומים קטן מ-0.01 Da. המשקל מחושב באופן הבא: W = [עוצמת שיא] m [איכות] n, m = 0.5, n = 2, כפי שהוצע על ידי MassBank.
יושמה שיטת ניקוד שנייה, שכללה ניתוח ה-NL המשותף בין MS/MS. לשם כך, השתמשנו ב-52 רשימות NL הנפוצות בתהליך הפרגמנטציה של MS במקביל, וב-NL הספציפי יותר (קובץ נתונים S1) שסומן בעבר עבור ספקטרום MS/MS של המטבוליטים המשניים של מיני Nepenthes המוחלשים (9, 26). צור וקטור בינארי של 1 ו-0 עבור כל MS/MS, התואם את הנוכחי ולאי-קיים של NL כלשהו בהתאמה. בהתבסס על דמיון המרחק האוקלידי, מחושב ציון הדמיון של NL עבור כל זוג של וקטורי NL בינאריים.
כדי לבצע אשכול כפול, השתמשנו בחבילת R DiffCoEx, המבוססת על הרחבה של Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). באמצעות מטריצות הניקוד NDP ו-NL של ספקטרום MS/MS, השתמשנו ב-DiffCoEx כדי לחשב את מטריצת המתאם ההשוואתית. אשכול בינארי מתבצע על ידי הגדרת הפרמטר "cutreeDynamic" ל-method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, ו-minClusterSize = 10. קוד המקור של R של DiffCoEx הורד מקובץ נוסף 1 על ידי Tesson et al. (57); ניתן למצוא את חבילת התוכנה הנדרשת של R WGCNA בכתובת https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
על מנת לבצע ניתוח רשת מולקולרית MS/MS, חישבנו קישוריות ספקטרלית מזווגת המבוססת על סוגי דמיון NDP ו-NL, והשתמשנו בתוכנת Cytoscape כדי להמחיש טופולוגיית רשת באמצעות פריסה אורגנית ביישום הרחבת אלגוריתם הפריסה CyFilescape yFiles.
השתמשו בגרסה 3.0.1 של R כדי לבצע ניתוח סטטיסטי על הנתונים. משמעות סטטיסטית הוערכה באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני (ANOVA), ולאחר מכן מבחן פוסט-הוק של Tukey's Honestly Significant Difference (HSD). על מנת לנתח את ההבדל בין הטיפול העשבוני לבין הביקורת, נותחה ההתפלגות הדו-צדדית של שתי קבוצות הדגימות עם אותה שונות באמצעות מבחן t של Student.
לחומרים משלימים למאמר זה, אנא עיינו בכתובת http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
זהו מאמר גישה פתוחה המופץ תחת תנאי רישיון Creative Commons Attribution-Non-Commercial, המאפשר שימוש, הפצה ורבייה בכל מדיום, כל עוד השימוש הסופי אינו למטרות רווח מסחרי וההנחה היא שהיצירה המקורית נכונה. הפניה.
הערה: אנו מבקשים שתספקו את כתובת הדוא"ל שלכם רק כדי שהאדם שאתם ממליצים עליו לדף ידע שאתם רוצים שהוא יראה את האימייל ושזה אינו ספאם. לא נאסוף כתובות דוא"ל.
שאלה זו משמשת לבדיקת האם אתה מבקר ולמניעת שליחת דואר זבל אוטומטי.
תורת המידע מספקת מטבע אוניברסלי להשוואה של מטבולומים מיוחדים ולניבוי תיאוריות הגנה על מבחנים.
תורת המידע מספקת מטבע אוניברסלי להשוואה של מטבולומים מיוחדים ולניבוי תיאוריות הגנה על מבחנים.
©2021 האגודה האמריקאית לקידום המדע. כֹּל הַזְכוּיוֹת שְׁמוּרוֹת. AAAS הוא שותף של HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ו-COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.