המאמר הוא חלק מנושא המחקר "שיפור עמידות קטניות לפתוגנים ומזיקים", ראה את כל 5 המאמרים.
הגורם למחלת הנמק של הצמחים הפטרייתיים Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary משתמש באסטרטגיה רב-שכבתית להדבקת צמחי פונדקאים שונים. מחקר זה מציע שימוש בדיאמין L-אורניטין, חומצת אמינו שאינה חלבונית המגרה את הסינתזה של חומצות אמינו חיוניות אחרות, כאסטרטגיית ניהול חלופית לשיפור התגובות המולקולריות, הפיזיולוגיות והביוכימיות של Phaseolus vulgaris L. לעובש לבן הנגרם על ידי Pseudomonas sclerotiorum. ניסויים חוץ גופיים הראו כי L-אורניטין עיכב באופן משמעותי את צמיחת התפטיר של S. pyrenoidosa באופן תלוי מינון. יתר על כן, הוא יכול להפחית באופן משמעותי את חומרת העובש הלבן בתנאי חממה. יתר על כן, L-אורניטין עודד את צמיחת הצמחים המטופלים, דבר המצביע על כך שריכוזי L-אורניטין שנבדקו לא היו פיטוטוקסיים לצמחים המטופלים. בנוסף, L-אורניטין הגביר את הביטוי של נוגדי חמצון לא אנזימטיים (פנולים ופלבנואידים מסיסים לחלוטין) ונוגדי חמצון אנזימטיים (קטלז (CAT), פרוקסידאז (POX) ופוליפנול אוקסידאז (PPO)), והגביר את הביטוי של שלושה גנים הקשורים לנוגדי חמצון (PvCAT1, PvSOD ו-PvGR). יתר על כן, ניתוח in silico גילה את נוכחותו של חלבון אוקסלואצטט אצטילהידרולאז (SsOAH) משוער בגנום של S. sclerotiorum, אשר היה דומה מאוד לחלבוני אוקסלואצטט אצטילהידרולאז (SsOAH) של Aspergillus fijiensis (AfOAH) ו-Penicillium sp. (PlOAH) מבחינת ניתוח פונקציונלי, דומיינים משומרים וטופולוגיה. מעניין לציין, כי הוספת L-אורניטין למצע ציר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDB) הפחיתה משמעותית את הביטוי של הגן SsOAH בתפטיר של S. sclerotiorum. באופן דומה, יישום אקסוגני של L-אורניטין הפחית משמעותית את הביטוי של גן SsOAH בתפטיר פטרייתי שנאסף מצמחים שטופלו. לבסוף, יישום L-אורניטין הפחית משמעותית את הפרשת חומצה אוקסלית הן במדיום PDB והן בעלים נגועים. לסיכום, L-אורניטין ממלא תפקיד מפתח בשמירה על סטטוס חמצון-חיזור וכן בשיפור תגובת ההגנה של צמחים נגועים. תוצאות מחקר זה עשויות לסייע בפיתוח שיטות חדשניות וידידותיות לסביבה לשליטה בעובש לבן ולמיתון השפעתו על ייצור שעועית וגידולים אחרים.
עובש לבן, הנגרמת על ידי הפטרייה הנקרוטרופית Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, היא מחלה הרסנית ופוגעת ביבול המהווה איום רציני על ייצור השעועית העולמית (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum היא אחת הפתוגנים הצמחיים הפטרייתיים הקשים ביותר לשליטה, עם מגוון רחב של פונדקאים של למעלה מ-600 מיני צמחים ויכולת להרוס במהירות רקמות פונדקאים בצורה לא ספציפית (Liang and Rollins, 2018). בתנאים לא נוחים, היא עוברת שלב קריטי במחזור חייה, ונשארת רדומה לפרקי זמן ארוכים כמבנים שחורים, קשים, דמויי זרעים, הנקראים 'סקלרוטיה', באדמה או כגידולים לבנים ואווריריים בתפטיר או בשתן הגבעול של צמחים נגועים (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum מסוגל ליצור סקלרוטיה, מה שמאפשר לו לשרוד בשדות נגועים במשך תקופות ארוכות ולהתמיד במהלך מחלה (Schwartz et al., 2005). סקלרוטיה עשירה בחומרים מזינים, יכולה להתקיים בקרקע במשך תקופות ארוכות, ולשמש כחומרי הבידוד העיקריים לזיהומים נוספים (Schwartz et al., 2005). בתנאים נוחים, סקלרוטיה נובטת ומייצרת נבגים הנישאים באוויר שיכולים להדביק את כל חלקי הצמח מעל הקרקע, כולל אך לא רק פרחים, גבעולים או תרמילים (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum משתמש באסטרטגיה רב-שכבתית כדי להדביק את צמחי הפונדקאי שלו, הכוללת סדרה של אירועים מתואמים החל מנביטת סקלרוטיאלית ועד להתפתחות תסמינים. בתחילה, S. sclerotiorum מייצר נבגים תלויים (הנקראים אסקוספורים) ממבנים דמויי פטריות הנקראים אפוטציה, אשר הופכים לאוויריים ומתפתחים לסקלרוטיה לא ניידת על פסולת צמחית נגועה (Bolton et al., 2006). לאחר מכן הפטרייה מפרישה חומצה אוקסלית, גורם אלימות, כדי לשלוט ב-pH של דופן תא הצמח, לקדם פירוק אנזימטי ופלישה לרקמות (Hegedus and Rimmer, 2005), ולדכא את התפרצות החמצון של צמח הפונדקאי. תהליך החמצה זה מחליש את דופן תא הצמח, ומספק סביבה נוחה לפעילות תקינה ויעילה של אנזימים המפרקים דופן תא פטרייתיים (CWDEs), ומאפשר לפתוגן להתגבר על המחסום הפיזי ולחדור לרקמות הפונדקאי (Marciano et al., 1983). לאחר חדירתו, S. sclerotiorum מפריש מספר חומצות שומן מעורבות (CWDEs), כגון פוליגלקטורונאז וצלולאז, אשר מקלות על התפשטותו ברקמות נגועות וגורמות לנמק רקמות. התקדמות הנגעים והמשטחים ההיפאליים מובילה לתסמינים האופייניים לעובש לבן (Hegedus and Rimmer, 2005). בינתיים, צמחי מארח מזהים דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגנים (PAMPs) באמצעות קולטני זיהוי תבניות (PRRs), מה שמפעיל סדרה של אירועי איתות שבסופו של דבר מפעילים תגובות הגנה.
למרות עשרות שנים של מאמצי בקרת מחלות, עדיין קיים מחסור בגידולים עמידים נאותים של עובש בשעועית, כמו בגידולים מסחריים אחרים, עקב העמידות, ההישרדות ויכולת ההסתגלות של הפתוגן. לכן, ניהול מחלות הוא מאתגר ביותר ודורש אסטרטגיה משולבת ורב-גונית הכוללת שילוב של שיטות תרבותיות, הדברה ביולוגית וקוטלי פטריות כימיים (O'Sullivan et al., 2021). הדברה כימית של עובש לבן היא היעילה ביותר מכיוון שקוטלי פטריות, כאשר מיושמים בצורה נכונה ובזמן הנכון, יכולים לשלוט ביעילות בהתפשטות המחלה, להפחית את חומרת הזיהום ולמזער את הפסדי היבול. עם זאת, שימוש יתר והסתמכות יתר על קוטלי פטריות יכולים להוביל להופעת זנים עמידים של S. sclerotiorum ולהשפיע לרעה על אורגניזמים שאינם מטרה, בריאות הקרקע ואיכות המים (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). לכן, מציאת חלופות ידידותיות לסביבה הפכה לעדיפות עליונה.
פוליאמינים (PAs), כגון פוטרסצין, ספרמידין, ספרמין וקדברין, יכולים לשמש כחלופות מבטיחות כנגד פתוגנים צמחיים הנישאים בקרקע, ובכך להפחית לחלוטין או חלקית את השימוש בקוטלי פטריות כימיים מסוכנים (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). בצמחים גבוהים, PAs מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל, אך לא רק, חלוקת תאים, התמיינות ותגובה ללחצים אביוטיים וביוטיים (Killiny and Nehela, 2020). הם יכולים לפעול כנוגדי חמצון, לסייע בפינוי מיני חמצן פעילים (ROS), לשמור על הומאוסטזיס של חמצון-חיזור (Nehela and Killiny, 2023), לגרום לגנים הקשורים להגנה (Romero et al., 2018), לווסת מסלולים מטבוליים שונים (Nehela and Killiny, 2023), לווסת הורמוני פיטו אנדוגניים (Nehela and Killiny, 2019), ליצור עמידות נרכשת מערכתית (SAR), ולווסת אינטראקציות בין צמחים לפתוגנים (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). ראוי לציין כי המנגנונים והתפקידים הספציפיים של PAs בהגנה על צמחים משתנים בהתאם למין הצמח, לפתוגנים ולתנאי הסביבה. ה-PA הנפוץ ביותר בצמחים מסונתז ביולוגית מהפוליאמין החיוני L-אורניטין (Killiny and Nehela, 2020).
ל-אורניטין תפקידים מרובים בגדילה והתפתחות של צמחים. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי באורז (Oryza sativa), אורניטין עשוי להיות קשור למחזור חנקן (Liu et al., 2018), תנובת האורז, איכותה וארומה (Lu et al., 2020), ותגובת עקת מים (Yang et al., 2000). יתר על כן, יישום אקסוגני של L-אורניטין שיפר משמעותית את עמידות הבצורת בסלק סוכר (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) והקל על עקת המלח בצמחי בצל (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) וקשיו (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). התפקיד הפוטנציאלי של L-אורניטין בהגנה מפני עקה אביוטית עשוי להיות בשל מעורבותו בהצטברות פרולין בצמחים שטופלו. לדוגמה, גנים הקשורים למטבוליזם של פרולין, כגון גנים של אורניטין דלתא אמינוטרנספראז (delta-OAT) ופרולין דהידרוגנאז (ProDH1 ו-ProDH2), דווחו בעבר כמעורבים בהגנה על Nicotiana benthamiana ו-Arabidopsis thaliana כנגד זני Pseudomonas syringae שאינם מארחים (Senthil-Kumar and Mysore, 2012). מצד שני, אורניטין דקרבוקסילאז פטרייתי (ODC) נדרש לצמיחת פתוגנים (Singh et al., 2020). מיקוד ODC של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici באמצעות השתקת גנים מושרת מארח (HIGS) הגביר משמעותית את עמידותם של צמחי עגבניות לנבילת Fusarium (Singh et al., 2020). עם זאת, התפקיד הפוטנציאלי של יישום אורניטין אקסוגני כנגד לחצים ביוטיים כגון פיטופתוגנים לא נחקר היטב. חשוב מכך, השפעות האורניטין על עמידות למחלות והתופעות הביוכימיות והפיזיולוגיות הנלוות נותרו ברובן בלתי נחקרו.
הבנת מורכבות הזיהום של S. sclerotiorum בקטניות חשובה לפיתוח אסטרטגיות בקרה יעילות. במחקר זה, מטרתנו הייתה לזהות את התפקיד הפוטנציאלי של הדיאמין L-אורניטין כגורם מפתח בשיפור מנגנוני ההגנה והעמידות של צמחי קטניות לזיהום Sclerotinia sclerotiorum. אנו משערים כי בנוסף לשיפור תגובות ההגנה של צמחים נגועים, L-אורניטין ממלא גם תפקיד מפתח בשמירה על מצב חמצון-חיזור. אנו מציעים כי ההשפעות הפוטנציאליות של L-אורניטין קשורות לוויסות מנגנוני הגנה נוגדי חמצון אנזימטיים ולא אנזימטיים ולהפרעה לגורמי פתוגניות/אלימות פטרייתיים וחלבונים נלווים. פונקציונליות כפולה זו של L-אורניטין הופכת אותו למועמד מבטיח לאסטרטגיה בת קיימא למיתון השפעת העובש הלבן ולשיפור עמידותם של גידולי קטניות נפוצים לפתוגן פטרייתי חזק זה. תוצאות המחקר הנוכחי עשויות לסייע בפיתוח שיטות חדשניות וידידותיות לסביבה לשליטה בעובש לבן ולמיתון השפעתו על ייצור קטניות.
במחקר זה, זן מסחרי רגיש של שעועית מצויה, גיזה 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), שימש כחומר ניסיוני. זרעים בריאים סופקו באדיבות מחלקת חקר הקטניות, מכון חקר גידולי שדה (FCRI), מרכז המחקר החקלאי (ARC), מצרים. חמישה זרעים נזרעו בעציצים מפלסטיק (קוטר פנימי 35 ס"מ, עומק 50 ס"מ) מלאים באדמה נגועה ב-S. sclerotiorum בתנאי חממה (25 ± 2 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 75 ± 1%, 8 שעות אור / 16 שעות חושך). 7-10 ימים לאחר הזריעה (DPS), השתילים דיללו כך שיישארו רק שני שתילים עם צמיחה אחידה ושלושה עלים מורחבים במלואם בכל עציץ. כל צמחי העציצים הושקו פעם בשבועיים ודושנו מדי חודש בקצב המומלץ לזן הנתון.
כדי להכין ריכוז של 500 מ"ג/ליטר של L-אורניטין-דיאמין (הידוע גם בשם חומצה (+)-(S)-2,5-דיאמינופנטאנואית; Sigma-Aldrich, דרמשטט, גרמניה), 50 מ"ג הומסו תחילה ב-100 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים. לאחר מכן דוללה תמיסת המקור ונעשה בה שימוש בניסויים הבאים. בקצרה, נבדקו שש סדרות של ריכוזי L-אורניטין (12.5, 25, 50, 75, 100 ו-125 מ"ג/ליטר) במבחנה. בנוסף, נעשה שימוש במים מזוקקים סטריליים כביקורת שלילית (Mock) וקוטל פטריות מסחרי "Rizolex-T" 50% הניתן להרטבה (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, כפר אל זיאת, מחוז ע'רביה, מצרים) שימש כביקורת חיובית. קוטל הפטריות המסחרי "ריזולקס-T" נבדק במבחנה בחמישה ריכוזים (2, 4, 6, 8 ו-10 מ"ג/ליטר).
דגימות של גבעולי ותרמילי שעועית רגילה המראים תסמינים אופייניים לעובש לבן (שיעור נגיעות: 10-30%) נאספו מחוות מסחריות. למרות שרוב חומרי הצמח הנגועים זוהו לפי מין/זן (זן מסחרי רגיש Giza 3), אחרים, במיוחד אלו שהתקבלו משווקים מקומיים, היו מזן לא ידוע. החומרים הנגועים שנאספו עברו תחילה חיטוי שטחי עם תמיסת נתרן היפוכלוריט 0.5% למשך 3 דקות, לאחר מכן נשטפו מספר פעמים במים מזוקקים סטריליים וניגבו יבשים בנייר סינון סטרילי כדי להסיר עודפי מים. האיברים הנגועים נחתכו לאחר מכן לחתיכות קטנות מהרקמה האמצעית (בין הרקמות הבריאות לנגועות), גודלו על מצע אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) והודגרו ב-25 ± 2 מעלות צלזיוס עם מחזור אור של 12 שעות / חושך של 12 שעות למשך 5 ימים כדי לעורר היווצרות סקלוציה. שיטת קצה התפטיר שימשה גם לטיהור בידודי פטריות מתרבויות מעורבות או מזוהמות. הבידוד הפטרייתי המטוהר זוהה תחילה על סמך המאפיינים המורפולוגיים התרבותיים שלו ולאחר מכן אושר כ-S. sclerotiorum על סמך מאפיינים מיקרוסקופיים. לבסוף, כל הבידודים המטוהרים נבדקו לפתוגניות על זן השעועית הנפוצה הרגיש גיזה 3 כדי לעמוד בפוסטולטים של קוך.
בנוסף, הבידוד הפולשני ביותר של S. sclerotiorum (בידוד מס' 3) אושר עוד יותר על סמך ריצוף מרווחים משועת פנימי (ITS) כפי שתואר על ידי White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. בקצרה, הבידודים גודלו בציר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDB) והודגרו בטמפרטורה של 25 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 5-7 ימים. לאחר מכן נאסף תפטיר פטרייתי, סונן דרך בד גבינה, נשטף פעמיים במים סטריליים ויובש בנייר סינון סטרילי. DNA גנומי בודד באמצעות ערכת Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). אזור ה-rDNA של ITS הוגבר לאחר מכן באמצעות זוג הפריימרים הספציפי ITS1/ITS4 ‏(TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; גודל צפוי: 540 בסיסים) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). תוצרי ה-PCR המטוהרים הוגשו לריצוף (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). רצפי ה-rDNA של ITS רוצפו באופן דו-כיווני באמצעות שיטת ריצוף סנגר. רצפי השאילתה שהורכבו הושוו לאחר מכן לנתונים העדכניים ביותר ב-GenBank ובמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) באמצעות תוכנת BLASTn. רצף השאילתה הושווה ל-20 זנים/בידודים אחרים של S. sclerotiorum שנאספו מהנתונים העדכניים ביותר ב-NCBI GenBank (טבלה משלימה S1) באמצעות ClustalW בחבילת ניתוח הגנטיקה המולקולרית האבולוציונית (MEGA-11; גרסה 11) (Kumar et al., 2024). ניתוח אבולוציוני בוצע באמצעות שיטת הסבירות המקסימלית ומודל ההחלפה הכללי של נוקלאוטידים הפיך בזמן (Nei and Kumar, 2000). מוצג העץ בעל הסבירות הלוגריתמית הגבוהה ביותר. העץ ההתחלתי לחיפוש היוריסטי נבחר על ידי בחירת העץ בעל הסבירות הלוגריתמית הגבוהה יותר בין עץ הצטרפות השכן (NJ) (Kumar et al., 2024) לעץ הפרסמוניה המקסימלית (MP). עץ NJ נבנה באמצעות מטריצת מרחק זוגית המחושבת באמצעות המודל הכללי הפיך בזמן (Nei and Kumar, 2000).
הפעילות האנטיבקטריאלית של L-אורניטין וחומר הקוטל החיידקים "Rizolex-T" נקבעה במבחנה בשיטת דיפוזיה של אגר. שיטה: יש לקחת את הכמות המתאימה של תמיסת הבסיס של L-אורניטין (500 מ"ג/ליטר) ולערבב אותה היטב עם 10 מ"ל של מצע התזונה PDA כדי להכין תמיסות בריכוזים סופיים של 12.5, 25, 50, 75, 100 ו-125 מ"ג/ליטר, בהתאמה. חמישה ריכוזים של קוטל הפטריות "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 ו-10 מ"ג/ליטר) ומים מזוקקים סטריליים שימשו כביקורת. לאחר שהמצע התמצק, פקק תפטיר טרי של תרבית Sclerotinia sclerotiorum, בקוטר 4 מ"מ, הועבר למרכז צלחת הפטרי וגודל בטמפרטורה של 25±2°C עד שהתפטיר כיסה את כל צלחת הפטרי, ולאחר מכן נרשמה צמיחת הפטרייה. חשב את אחוז העיכוב של צמיחה רדיאלית של S. sclerotiorum באמצעות משוואה 1:
הניסוי חזר על עצמו פעמיים, עם שש חזרות ביולוגיות לכל קבוצת ביקורת/ניסוי וחמישה עציצים (שני צמחים לכל עציץ) לכל חזרת ביולוגית. כל חזרת ביולוגית נותחה פעמיים (שתי חזרות טכניות) כדי להבטיח את הדיוק, האמינות והיכולת לשחזר את תוצאות הניסוי. בנוסף, נעשה שימוש בניתוח רגרסיה פרוביט לחישוב ריכוז מעכב חצי-מקסימלי (IC50) ו-IC99 (Prentice, 1976).
כדי להעריך את הפוטנציאל של L-אורניטין בתנאי חממה, נערכו שני ניסויים עוקבים בעציצים. בקצרה, העציצים מולאו באדמת חרסית-חול מעוקרת (3:1) והוזנו בתרבית טרייה של S. sclerotiorum. ראשית, הבידוד הפולשני ביותר של S. sclerotiorum (בידוד מס' 3) גודל על ידי חיתוך סקלרוטיום אחד לשניים, הנחתו כשפניו כלפי מטה על PDA ודגירה ב-25 מעלות צלזיוס בחושך מתמיד (24 שעות) למשך 4 ימים כדי לעורר צמיחת תפטיר. לאחר מכן נלקחו ארבעה פקקי אגר בקוטר 5 מ"מ מהקצה הקדמי והוזנו ב-100 גרם של תערובת סטרילית של חיטה וסובין אורז (1:1, v/v) וכל הצלוחיות הודגרו ב-25 ± 2 מעלות צלזיוס תחת מחזור אור של 12 שעות/12 שעות חושך למשך 5 ימים כדי לעורר היווצרות סקלרוטיום. תכולת כל הצלוחיות עורבבה היטב כדי להבטיח הומוגניות לפני הוספת אדמה. לאחר מכן, נוספו 100 גרם מתערובת הסובין המתיישב לכל עציץ כדי להבטיח ריכוז קבוע של פתוגנים. העציצים המחוסנים הושקו כדי להפעיל צמיחת פטריות והוכנסו לתנאי חממה למשך 7 ימים.
חמישה זרעים מזן גיזה 3 נזרעו בכל עציץ. עבור העציצים שטופלו ב-L-אורניתין ובקוטל הפטריות Rizolex-T, הזרעים המעוקרים הושרו תחילה במשך שעתיים בתמיסה מימית של שני התרכובות עם ריכוז IC99 סופי של כ-250 מ"ג/ליטר ו-50 מ"ג/ליטר, בהתאמה, ולאחר מכן יובשו באוויר במשך שעה לפני הזריעה. מצד שני, הזרעים הושרו במים מזוקקים סטריליים כביקורת שלילית. לאחר 10 ימים, לפני ההשקיה הראשונה, השתילים דיללו, ונותרו רק שני שתילים מסודרים בכל עציץ. בנוסף, כדי להבטיח הדבקה ב-S. sclerotiorum, גבעולי צמחי שעועית באותו שלב התפתחותי (10 ימים) נחתכו בשני מקומות שונים באמצעות סכין מנתחים מעוקרת וכ-0.5 גרם מתערובת הסובין המתיישבת הוכנסו לכל פצע, ולאחר מכן לחות גבוהה כדי לעודד זיהום והתפתחות מחלות בכל הצמחים המחוסנים. צמחי בקרה נפצעו באופן דומה וכמות שווה (0.5 גרם) של תערובת סובין סטרילית ולא מושבתת הונחה לפצע ונשמרה תחת לחות גבוהה כדי לדמות את הסביבה להתפתחות המחלה ולהבטיח עקביות בין קבוצות הטיפול.
שיטת טיפול: שתילי שעועית הושקו ב-500 מ"ל של תמיסה מימית של L-אורניטין (250 מ"ג/ליטר) או בקוטל הפטריות Rizolex-T (50 מ"ג/ליטר) על ידי השקיית האדמה, לאחר מכן הטיפול חזר על עצמו שלוש פעמים במרווחים של 10 ימים. קבוצת הביקורת שטופלה בפלצבו הושקה ב-500 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים. כל הטיפולים בוצעו בתנאי חממה (25 ± 2°C, 75 ± 1% לחות יחסית, ותקופת אור של 8 שעות אור/16 שעות חושך). כל העציצים הושקו אחת לשבועיים וטופלו בחודש בדשן NPK מאוזן (20-20-20, עם 3.6% גופרית ומיקרו-יסודות TE; Zain Seeds, מצרים) בריכוז של 3-4 גרם/ליטר על ידי ריסוס עלים בהתאם להמלצות לזן הספציפי ולהוראות היצרן. אלא אם כן צוין אחרת, עלים בוגרים שהתפשטו במלואם (עלים שניים ושלישי מלמעלה) נאספו מכל שכפול ביולוגי 72 שעות לאחר הטיפול (hpt), עברו הומוגניזציה, אוגדו ואוחסנו ב-80°C- לצורך ניתוחים נוספים, כולל, אך לא רק, לוקליזציה היסטוכימית in situ של אינדיקטורים של עקה חמצונית, חמצון שומנים, נוגדי חמצון אנזימטיים ולא אנזימטיים וביטוי גנים.
עוצמת הזיהום בעובש לבן הוערכה מדי שבוע 21 יום לאחר ההדבקה (dpi) באמצעות סולם של 1-9 (טבלה משלימה S2) המבוסס על סולם פטזולדט ודיקסון (1996) שעבר שינוי על ידי טרן ואחרים (2006). בקצרה, נבדקו הגבעולים והענפים של צמחי שעועית החל מנקודת ההדבקה כדי לעקוב אחר התקדמות הנגעים לאורך הפנימיות והצמתים. לאחר מכן נמדד מרחק הנגע מנקודת ההדבקה לנקודה הרחוקה ביותר לאורך הגבעול או הענף וניתן ציון של 1-9 בהתבסס על מיקום הנגע, כאשר (1) מצביע על חוסר זיהום נראה לעין ליד נקודת ההדבקה ו-(2-9) מצביע על עלייה הדרגתית בגודל הנגע ובהתקדמות לאורך הצמתים/האינטרינדות (טבלה משלימה S2). לאחר מכן הומרה עוצמת הזיהום בעובש לבן לאחוזים באמצעות נוסחה 2:
בנוסף, השטח מתחת לעקומת התקדמות המחלה (AUDPC) חושב באמצעות הנוסחה (Shaner and Finney, 1977), אשר הותאמה לאחרונה עבור ריקבון לבן של שעועית רגילה (Chauhan et al., 2020) באמצעות משוואה 3:
כאשר Yi = חומרת המחלה בזמן ti, Yi+1 = חומרת המחלה בזמן הבא ti+1, ti = זמן המדידה הראשונה (בימים), ti+1 = זמן המדידה הבאה (בימים), n = המספר הכולל של נקודות זמן או נקודות תצפית. פרמטרי גדילת צמח השעועית, כולל גובה הצמח (ס"מ), מספר ענפים לצמח ומספר עלים לצמח, נרשמו מדי שבוע במשך 21 ימים בכל הניסויים הביולוגיים.
בכל שכפול ביולוגי, נאספו דגימות עלים (עלים שניים ושלישיים מפותחים במלואם מלמעלה) ביום 45 לאחר הטיפול (15 ימים לאחר הטיפול האחרון). כל שכפול ביולוגי כלל חמישה עציצים (שני צמחים לכל עציץ). כ-500 מ"ג מהרקמה המרוסקת שימשו להפקת פיגמנטים פוטוסינתטיים (כלורופיל a, כלורופיל b וקרוטנואידים) באמצעות אצטון 80% ב-4 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר 24 שעות, הדגימות עברו צנטריפוגה והנוזל העל-תכליתי נאסף לקביעת תכולת כלורופיל a, כלורופיל b וקרוטנואידים באופן קולורימטרי באמצעות ספקטרופוטומטר UV-160A (Shimadzu Corporation, יפן) לפי שיטת (Lichtenthaler, 1987) על ידי מדידת הבליעה בשלושה אורכי גל שונים (A470, A646 ו-A663 ננומטר). לבסוף, תכולת הפיגמנטים הפוטוסינתטיים חושבה באמצעות הנוסחאות 4-6 הבאות שתוארו על ידי Lichtenthaler (1987).
72 שעות לאחר הטיפול (hpt), נאספו עלים (העלים השני והשלישי המפותחים במלואם מלמעלה) מכל שכפול ביולוגי לצורך איתור היסטוכימי באתר של מי חמצן (H2O2) ואניון סופראוקסיד (O2•−). כל שכפול ביולוגי כלל חמישה עציצים (שני צמחים לכל עציץ). כל שכפול ביולוגי נותח בכפילות (שני שכפולים טכניים) כדי להבטיח את הדיוק, האמינות והיכולת לשחזר את השיטה. H2O2 ו-O2•− נקבעו באמצעות 0.1% 3,3′-דיאמינובנזידין (DAB; Sigma-Aldrich, דרמשטט, גרמניה) או ניטרובלו טטרזוליום (NBT; Sigma-Aldrich, דרמשטט, גרמניה), בהתאמה, בהתאם לשיטות שתוארו על ידי Romero-Puertas et al. (2004) ו-Adam et al. (1989) עם שינויים קלים. לצורך אימות היסטוכימי של H2O2 באתר, העלעלים עברו הסננה בוואקום עם 0.1% DAB בתמיסת טריס של 10 mM (pH 7.8) ולאחר מכן הודגרו בטמפרטורת החדר באור למשך 60 דקות. העלעלים מולבנים ב-0.15% (v/v) TCA באתנול:כלורופורם ביחס של 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, קהיר, מצרים) ולאחר מכן נחשפו לאור עד שהחשיכו. באופן דומה, המסתמים עברו הסננה בוואקום עם תמיסת אשלגן פוספט של 10 mM (pH 7.8) המכילה 0.1% w/v HBT לצורך אימות היסטוכימי של O2•− באתר. העלעלים הודגרו באור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, לאחר מכן מולבנים כנ"ל, ולאחר מכן הוארו עד להופעת כתמים כחולים/סגולים כהים. עוצמת הצבע החום (כאינדיקטור H2O2) או הכחול-סגול (כאינדיקטור O2•−) שנוצר הוערכה באמצעות גרסת פיג'י של חבילת עיבוד התמונה ImageJ (http://fiji.sc; גישה ב-7 במרץ 2024).
מלונדיאלדהיד (MDA; כסמן לחמצון שומנים) נקבע לפי שיטת דו ובראמלאג' (1992) עם שינויים קלים. עלים מכל שכפול ביולוגי (עלים שני ושלישי מפותחים במלואם מלמעלה) נאספו 72 שעות לאחר הטיפול (hpt). כל שכפול ביולוגי כלל חמישה עציצים (שני צמחים לכל עציץ). כל שכפול ביולוגי נותח בכפילות (שני שכפולים טכניים) כדי להבטיח את הדיוק, האמינות והיכולת לשחזור של השיטה. בקצרה, 0.5 גרם של רקמת עלה טחונה שימשו למיצוי MDA עם 20% חומצה טריכלורואצטית (TCA; MilliporeSigma, ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב) המכילה 0.01% בוטיל הידרוקסיטולואן (BHT; Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב). תכולת ה-MDA בסופרנטנט נקבעה לאחר מכן קולורימטרית על ידי מדידת הבליעה ב-532 ו-600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-160A (Shimadzu Corporation, יפן) ולאחר מכן בוטאה כ-nmol g−1 FW.
לצורך הערכת נוגדי חמצון אנזימטיים ולא אנזימטיים, נאספו עלים (העלים השני והשלישי המפותחים במלואם מלמעלה) מכל דגימה ביולוגית 72 שעות לאחר הטיפול. כל דגימה ביולוגית כללה חמישה עציצים (שני צמחים בעציץ). כל דגימה ביולוגית נותחה בכפילות (שתי דגימות טכניות). שני עלים נטחנו בחנקן נוזלי ושימשו ישירות לקביעת נוגדי חמצון אנזימטיים ולא אנזימטיים, סך חומצות האמינו, תכולת פרולין, ביטוי גנים וכימות אוקסלט.
סך כל הפנולים המסיסים נקבע באמצעות ריאגנט Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) עם שינויים קלים בשיטה שתוארה על ידי Kahkonen et al. (1999). בקצרה, כ-0.1 גרם של רקמת עלה הומוגנית חולצו עם 20 מ"ל מתנול 80% בחושך למשך 24 שעות והנוזל העליון נאסף לאחר צנטריפוגה. 0.1 מ"ל של תמצית הדגימה עורבבו עם 0.5 מ"ל ריאגנט Folin-Ciocalteu (10%), נוערו במשך 30 שניות והושארו בחושך למשך 5 דקות. לאחר מכן נוספו 0.5 מ"ל של תמיסת נתרן פחמתי 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, קהיר, מצרים) לכל מבחנה, עורבבו היטב והודגרו בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, ספיגת תערובת התגובה נמדדה ב-765 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-160A (Shimadzu Corporation, יפן). ריכוז הפנולים המסיסים הכוללים בתמציות הדגימה נקבע באמצעות עקומת כיול של חומצה גאלית (פישר סיינטיפיק, המפטון, ניו המפשייר, ארה"ב) ובא לידי ביטוי כמיליגרם של שווה ערך חומצה גאלית לגרם של משקל טרי (מ"ג GAE g-1 משקל טרי).
תכולת הפלבנואידים המסיסים הכוללת נקבעה לפי שיטת Djeridane ואחרים (2006) עם שינויים קלים. בקצרה, 0.3 מ"ל מתמצית המתנול הנ"ל עורבבו עם 0.3 מ"ל של תמיסת אלומיניום כלוריד 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), עורבבו במרץ ולאחר מכן הודגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 0.3 מ"ל של תמיסת אשלגן אצטט 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), עורבבו היטב והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. לאחר הדגירה, ספיגת תערובת התגובה נמדדה ב-430 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). ריכוז הפלבנואידים המסיסים הכוללים בתמציות הדגימה נקבע באמצעות עקומת כיול רוטין (TCI America, Portland, OR, USA) ולאחר מכן בוטא כמיליגרם של שווה ערך רוטין לגרם של משקל טרי (mg RE g-1 משקל טרי).
תכולת חומצות האמינו החופשיות הכוללת בעלי שעועית נקבעה באמצעות ריאגנט נינהידרין שעבר שינוי (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) המבוסס על השיטה שהוצעה על ידי Yokoyama and Hiramatsu (2003) ושונתה על ידי Sun et al. (2006). בקצרה, 0.1 גרם של רקמה טחונה חולצו עם בופר pH 5.4, ו-200 מיקרוליטר מהנוזל העלה תגובה עם 200 מיקרוליטר של נינהידרין (2%) ו-200 מיקרוליטר של פירידין (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), הודגרו באמבט מים רותחים למשך 30 דקות, לאחר מכן מקוררו ונמדדו ב-580 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). מצד שני, פרולין נקבע בשיטת Bates (Bates et al., 1973). פרולין חולץ עם 3% חומצה סולפוסליצילית (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ולאחר צנטריפוגה, 0.5 מ"ל מהנוזל העליון עורבב עם 1 מ"ל חומצה אצטית קרחונית (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) וריאגנט נינהידרין, הודגרו ב-90 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות, מקוררו ונמדדו ב-520 ננומטר באמצעות אותו ספקטרופוטומטר כנ"ל. סך חומצות האמינו החופשיות והפרולין בתמציות העלים נקבעו באמצעות עקומות כיול גליצין ופרולין (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), בהתאמה, ובוטאו כ-mg/g משקל טרי.
כדי לקבוע את הפעילות האנזימטית של אנזימים נוגדי חמצון, כ-500 מ"ג של רקמה הומוגנית חולצו באמצעות 3 מ"ל של בופר טריס 50 mM (pH 7.8) המכיל 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) ו-7.5% פוליווינילפירולידון (PVP; Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב), עברו צנטריפוגה ב-10,000 × g למשך 20 דקות תחת קירור (4 מעלות צלזיוס), והנוזל העליון (תמצית אנזים גולמית) נאסף (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). לאחר מכן, קטלאז (CAT) הגיב עם 2 מ"ל של תמיסת נתרן פוספט 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) ו-100 מיקרוליטר של תמיסת H2O2 בריכוז 269 mM כדי לקבוע את הפעילות האנזימטית שלו לפי שיטת Aebi (1984) עם שינויים קלים (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). הפעילות האנזימטית של פראוקסידאז תלוי גואיאקול (POX) נקבעה באמצעות שיטת Harrach et al. (2009). (2008) עם שינויים קלים (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) והפעילות האנזימטית של פוליפנול אוקסידאז (PPO) נקבעה לאחר תגובה עם 2.2 מ"ל של תמיסת נתרן פוספט 100 mM (pH 6.0), 100 מיקרוליטר של גואיאקול (TCI chemicals, פורטלנד, אורגון, ארה"ב) ו-100 מיקרוליטר של 12 mM H2O2. השיטה שונתה מעט מ-(El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). הבדיקה בוצעה לאחר תגובה עם 3 מ"ל של תמיסת קטכול (Thermo Scientific Chemicals, וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב) (0.01 M) שהוכנה טרייה בתמיסת פוספט 0.1 M (pH 6.0). פעילות CAT נמדדה על ידי ניטור פירוק H2O2 ב-240 ננומטר (A240), פעילות POX נמדדה על ידי ניטור העלייה בספיגה ב-436 ננומטר (A436), ופעילות PPO נמדדה על ידי רישום תנודות בספיגה ב-495 ננומטר (A495) כל 30 שניות למשך 3 דקות באמצעות ספקטרופוטומטר UV-160A (Shimadzu, יפן).
RT-PCR בזמן אמת שימש לזיהוי רמות התעתיק של שלושה גנים הקשורים לנוגדי חמצון, כולל קטלאז פראוקסיסומלי (PvCAT1; מספר גישה של GenBank KF033307.1), סופראוקסיד דיסמוטאז (PvSOD; מספר גישה של GenBank XM_068639556.1) וגלוטתיון רדוקטאז (PvGR; מספר גישה של GenBank KY195009.1), בעלי שעועית (העלים השני והשלישי המפותחים במלואם מלמעלה) 72 שעות לאחר הטיפול האחרון. בקצרה, RNA בודד באמצעות ערכת החילוץ Simply P Total RNA Kit (מס' קטלוגי BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, סין) בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר מכן, cDNA סונתז באמצעות ערכת הסינתזה של cDNA TOP script™ בהתאם להוראות היצרן. רצפי הפריימרים של שלושת הגנים הנ"ל מפורטים בטבלה המשלימה S3. PvActin-3 (מספר גישה של GenBank: XM_068616709.1) שימש כגן ניהול הגנים וביטוי הגנים היחסי חושב באמצעות שיטת 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001). יציבות האקטין תחת עקה ביוטית (אינטראקציה לא תואמת בין קטניות נפוצות לפטריית האנתרקנוז Colletotrichum lindemuthianum) ועקה אביוטית (בצורת, מליחות, טמפרטורה נמוכה) הודגמה (Borges et al., 2012).
בתחילה ביצענו ניתוח in silico כלל-גנומי של חלבוני אוקסלואצטט אצטילהידרולאז (OAH) ב-S. sclerotiorum באמצעות כלי protein-protein BLAST ‏(BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). בקצרה, השתמשנו ב-OAH מ-Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; טקסיד: 1191702; מספר גישה GenBank XP_040799428.1; 342 חומצות אמינו) ו-Penicillium lagena (PlOAH; טקסיד: 94218; מספר גישה GenBank XP_056833920.1; 316 חומצות אמינו) כרצפי שאילתה למיפוי החלבון ההומולוגי ב-S. sclerotiorum (טקסיד: 5180). ניתוח BLASTp בוצע כנגד נתוני הגנום האחרונים הזמינים של S. sclerotiorum ב-GenBank באתר האינטרנט של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
בנוסף, הגן OAH החזוי מ-S. sclerotiorum (SsOAH) והניתוח האבולוציוני והעץ הפילוגנטי של AfOAH מ-A. fijiensis CBS 313.89 ו-PlOAH מ-P. lagena הוסקו באמצעות שיטת הסבירות המרבית ב-MEGA11 (Tamura et al., 2021) והמודל מבוסס מטריצת JTT (Jones et al., 1992). העץ הפילוגנטי שולב עם ניתוח יישור מרובה של רצפי חלבונים של כל גני ה-OAH החזויים (SsOAH) מ-S. sclerotiorum ורצף השאילתה באמצעות כלי היישור מבוסס אילוצים (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007). בנוסף, רצפי חומצות האמינו התואמים ביותר של SsOAH מ-S. sclerotiorum יושרו עם רצפי השאילתה (AfOAH ו-PlOAH) (Larkin et al., 2007) באמצעות ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), ואזורים שמורים ביישור הוצגו באמצעות כלי ESPript (גרסה 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
יתר על כן, הדומיינים התפקודיים המייצגים והאתרים השמורים החזויים של SsOAH של S. sclerotiorum סווגו באופן אינטראקטיבי למשפחות שונות באמצעות כלי InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). לבסוף, בוצעה מידול מבנה תלת-ממדי (3D) של SsOAH החזוי של S. sclerotiorum באמצעות מנוע זיהוי הומולוגיה/אנלוגיה של חלבונים (שרת Phyre2 גרסה 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ואומתו באמצעות שרת SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). המבנים התלת-ממדיים החזויים (בפורמט PDB) הוצגו באופן אינטראקטיבי באמצעות חבילת UCSF-Chimera (גרסה 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
PCR פלואורסצנטי כמותי בזמן אמת שימש לקביעת רמת התעתוק של אוקסלואצטט אצטילהידרולאז (SsOAH; מספר גישה של GenBank: XM_001590428.1) בתפטיר של Sclerotinia sclerotiorum. בקצרה, S. sclerotiorum הוכנס לבקבוק המכיל PDB והוכנס לאינקובטור רועד (דגם: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) בטמפרטורה של 25 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות במהירות 150 סל"ד ובחושך מתמיד (24 שעות) כדי לעורר צמיחת תפטיר. לאחר מכן, התאים טופלו ב-L-אורניטין ובקוטל הפטריות Rizolex-T בריכוזי IC50 סופיים (כ-40 ו-3.2 מ"ג/ליטר, בהתאמה) ולאחר מכן גודלו למשך 24 שעות נוספות באותם תנאים. לאחר הדגירה, התרביות עברו צנטריפוגה ב-2500 סל"ד למשך 5 דקות והנוזל העליון (תפטיר פטרייתי) נאסף לניתוח ביטוי גנים. באופן דומה, תפטיר פטרייתי נאסף 0, 24, 48, 72, 96 ו-120 שעות לאחר ההדבקה מצמחים נגועים שיצרו עובש לבן ותפטיר צמר גפן על פני הרקמות הנגועות. RNA חולץ מתפטיר הפטרייתי ולאחר מכן סונתז cDNA כמתואר לעיל. רצפי הפריימרים עבור SsOAH מפורטים בטבלה המשלימה S3. SsActin (מספר גישה של GenBank: XM_001589919.1) שימש כגן ניקיון, וביטוי גנים יחסי חושב באמצעות שיטת 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001).
חומצה אוקסלית נקבעה בציר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDB) ובדגימות צמחים המכילות את הפתוגן הפטרייתי Sclerotinia sclerotiorum לפי שיטתם של שו וג'אנג (2000) עם שינויים קלים. בקצרה, בידודים של S. sclerotiorum הוזרקו לצלוחיות המכילות PDB ולאחר מכן גודלו באינקובטור רועד (דגם I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ב-150 סל"ד ב-25 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 3-5 ימים בחושך מתמיד (24 שעות) כדי לעורר צמיחת תפטיר. לאחר הדגירה, תרבית הפטרייה סוננה תחילה דרך נייר סינון Whatman #1 ולאחר מכן צורפה בצנטריפוגה ב-2500 סל"ד למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות תפטיר. הנוזל העליון נאסף ואוחסן ב-4 מעלות צלזיוס לקביעה כמותית נוספת של אוקסלט. להכנת דגימות הצמח, כ-0.1 גרם של שברי רקמת צמח חולצו שלוש פעמים עם מים מזוקקים (2 מ"ל בכל פעם). לאחר מכן הדגימות עברו צנטריפוגה במהירות של 2500 סל"ד למשך 5 דקות, הנוזל העליון סונן יבש דרך נייר סינון של Whatman מס' 1 ונאסף לניתוח נוסף.
לצורך ניתוח כמותי של חומצה אוקסלית, תערובת התגובה הוכנה במבחנה עם פקק זכוכית בסדר הבא: 0.2 מ"ל של דגימה (או תסנין תרבית PDB או תמיסת חומצה אוקסלית סטנדרטית), 0.11 מ"ל של ברומופנול כחול (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב), 0.198 מ"ל של חומצה גופרתית 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, קהיר, מצרים) ו-0.176 מ"ל של אשלגן דיכרומט 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, פורטלנד, אורגון, ארה"ב), ולאחר מכן התמיסה דוללה ל-4.8 מ"ל עם מים מזוקקים, עורבבה במרץ והוכנסה מיד לאמבט מים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות, התגובה הופסקה על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת נתרן הידרוקסיד (NaOH; 0.75 M). הבליעה (A600) של תערובת התגובה נמדדה ב-600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-160 (Shimadzu Corporation, יפן). PDB ומים מזוקקים שימשו כבקרות לכימות תסניני התרבית ודגימות הצמח, בהתאמה. ריכוזי חומצה אוקסלית בתסניני התרבית, מבוטאים כמיקרוגרים של חומצה אוקסלית למיליליטר של מצע PDB (μg.mL−1), ובתמציות העלים, מבוטאים כמיקרוגרים של חומצה אוקסלית לגרם משקל טרי (μg.g−1 FW), נקבעו באמצעות עקומת כיול חומצה אוקסלית (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
לאורך המחקר, כל הניסויים עוצבו במסגרת ניסוי אקראי לחלוטין (CRD) עם שישה חזרות ביולוגיות לכל טיפול וחמישה עציצים לכל חזרת ביולוגית (שני צמחים לכל עציץ) אלא אם כן צוין אחרת. חזרות ביולוגיות נותחו בכפילות (שתי חזרות טכניות). חזרות טכניות שימשו לבדיקת השחזור של אותו ניסוי אך לא שימשו בניתוח הסטטיסטי כדי להימנע מחזרות כוזבות. הנתונים נותחו סטטיסטית באמצעות ניתוח שונות (ANOVA) ולאחר מכן מבחן הבדל מובהק אמיתי (HSD) של Tukey-Kramer (p ≤ 0.05). עבור ניסויים חוץ גופיים, חושבו ערכי IC50 ו-IC99 באמצעות מודל probit וחושבו רווחי סמך של 95%.
סך של ארבעה בידודים נאספו משדות סויה שונים במחוז אל ע'ביה, מצרים. על מצע PDA, כל הבידודים ייצרו תפטיר לבן קרמי שהפך במהירות ללבן צמר גפן (איור 1A) ולאחר מכן בז' או חום בשלב הסקלרוטיום. הסקלרוטיה בדרך כלל צפופה, שחורה, כדורית או לא סדירה בצורתה, באורך 5.2 עד 7.7 מ"מ ובקוטר 3.4 עד 5.3 מ"מ (איור 1B). למרות שארבעה בידודים פיתחו דפוס שולי של סקלוטיה בקצה מצע הגידול לאחר 10-12 ימי דגירה ב-25 ± 2 מעלות צלזיוס (איור 1A), מספר הסקלרוטיה לצלחת היה שונה באופן משמעותי ביניהן (P < 0.001), כאשר בבידוד 3 היה המספר הגבוה ביותר של סקלוטיה (32.33 ± 1.53 סקלוטיה לצלחת; איור 1C). באופן דומה, בידוד מס' 3 ייצר יותר חומצה אוקסלית ב-PDB מאשר בידודים אחרים (3.33 ± 0.49 מיקרוגרם.מ"ל-1; איור 1D). בידוד מס' 3 הראה מאפיינים מורפולוגיים ומיקרוסקופיים אופייניים לפטרייה הפיטופתוגנית Sclerotinia sclerotiorum. לדוגמה, ב-PDA, מושבות של בידוד מס' 3 גדלו במהירות, היו לבנות שמנת (איור 1A), בצבע בז' הפוך או צהוב-חום סלמון בהיר, ונדרשו 6-7 ימים בטמפרטורה של 25 ± 2°C כדי לכסות לחלוטין את פני השטח של צלחת בקוטר 9 ס"מ. בהתבסס על המאפיינים המורפולוגיים והמיקרוסקופיים הנ"ל, בידוד מס' 3 זוהה כ-Sclerotinia sclerotiorum.
איור 1. מאפיינים ופתוגניות של בידודי S. sclerotiorum מגידולי קטניות נפוצים. (א) גידול תפטיר של ארבעה בידודי S. sclerotiorum על מצע PDA, (ב) סקלוציות של ארבעה בידודי S. sclerotiorum, (ג) מספר סקלוציות (לכל צלחת), (ד) הפרשת חומצה אוקסלית על מצע PDB (μg.mL−1), ו-(ה) חומרת המחלה (%) של ארבעה בידודי S. sclerotiorum על זן קטניות מסחרי רגיש Giza 3 בתנאי חממה. הערכים מייצגים את הממוצע ± סטיית תקן של חמישה חזרות ביולוגיות (n = 5). אותיות שונות מציינות הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הטיפולים (p < 0.05). (F–H) תסמיני עובש לבן אופייניים הופיעו על גבעולים ועל צמחים עיליים, בהתאמה, 10 ימים לאחר ההזרקה עם בידודי מס' 3 (dpi). (I) ניתוח אבולוציוני של אזור המרווח הפנימי המתועתק (ITS) של בידוד מס' 3 של S. sclerotiorum בוצע בשיטת הסבירות המרבית והושווה ל-20 בידודי/זני ייחוס שהתקבלו ממאגר הנתונים של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). המספרים מעל קווי האשכול מציינים את כיסוי האזור (%), והמספרים מתחת לקווי האשכול מציינים את אורך הענף.
יתר על כן, כדי לאשר את הפתוגניות, ארבעה בידודי S. sclerotiorum שהתקבלו שימשו לחיסון זן השעועית המסחרי הרגיש Giza 3 בתנאי חממה, דבר התואם את ההנחות של קוך (איור 1E). למרות שכל בידודי הפטרייה שהתקבלו היו פתוגניים ויכלו להדביק את השעועית הירוקה (cv. Giza 3), ולגרום לתסמינים אופייניים של עובש לבן בכל החלקים מעל הקרקע (איור 1F), במיוחד על הגבעולים (איור 1G) והתרמילים (איור 1H) 10 ימים לאחר ההדבקה (dpi), בידוד 3 היה הבידוד האגרסיבי ביותר בשני ניסויים בלתי תלויים. לבידוד 3 הייתה חומרת המחלה הגבוהה ביותר (%) על צמחי שעועית (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 ו-76.7 ± 3.1 7, 14 ו-21 ימים לאחר ההדבקה, בהתאמה; איור 1F).
זיהוי הבידוד הפולשני ביותר של S. sclerotiorum #3 אושר עוד יותר על סמך ריצוף פנימי של מרווח מתועתק (ITS) (איור 1I). ניתוח פילוגנטי בין בידוד #3 לבין 20 בידודים/זני ייחוס הראה דמיון גבוה (>99%) ביניהם. ראוי לציין כי לבידוד #3 של S. sclerotiorum (533 bp) יש דמיון גבוה לבידוד האמריקאי של S. sclerotiorum LPM36 שבודד מזרעי אפונה יבשה (מספר גישה של GenBank MK896659.1; 540 bp) ולבידוד הסיני של S. sclerotiorum YKY211 (מספר גישה של GenBank OR206374.1; 548 bp), הגורם לריקבון גבעול של סגול (Matthiola incana), שכולם מקובצים בנפרד בחלק העליון של הדנדרוגרמה (איור 1I). הרצף החדש הופקד במסד הנתונים של NCBI ונקרא "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (מספר גישה של GenBank PV202792). ניתן לראות שבידוד 3 הוא הבידוד הפולשני ביותר; לכן, בידוד זה נבחר למחקר בכל הניסויים הבאים.
הפעילות האנטיבקטריאלית של הדיאמין L-אורניטין (Sigma-Aldrich, דרמשטט, גרמניה) בריכוזים שונים (12.5, 25, 50, 75, 100 ו-125 מ"ג/ליטר) כנגד מבודד 3 של S. sclerotiorum נחקרה במבחנה. ראוי לציין כי L-אורניטין הפעיל השפעה אנטיבקטריאלית ועיכב בהדרגה את הצמיחה הרדיאלית של היפות S. sclerotiorum באופן תלוי מינון (איור 2א', ב'). בריכוז הגבוה ביותר שנבדק (125 מ"ג/ליטר), L-אורניטין הדגים את שיעור עיכוב הצמיחה הגבוה ביותר של תפטירים (99.62 ± 0.27%; איור 2ב'), שהיה שווה ערך לקוטל הפטריות המסחרי Rizolex-T (שיעור עיכוב 99.45 ± 0.39%; איור 2ג') בריכוז הגבוה ביותר שנבדק (10 מ"ג/ליטר), דבר המצביע על יעילות דומה.
איור 2. פעילות אנטיבקטריאלית במבחנה של L-אורניטין כנגד Sclerotinia sclerotiorum. (א) השוואה של הפעילות האנטיבקטריאלית של ריכוזים שונים של L-אורניטין כנגד S. sclerotiorum עם קוטל הפטריות המסחרי Rizolex-T (10 מ"ג/ליטר). (ב, ג) שיעור עיכוב (%) של צמיחת תפטיר S. sclerotiorum לאחר טיפול בריכוזים שונים של L-אורניטין (12.5, 25, 50, 75, 100 ו-125 מ"ג/ליטר) או Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ו-10 מ"ג/ליטר), בהתאמה. הערכים מייצגים את הממוצע ± סטיית תקן של חמישה חזרות ביולוגיות (n = 5). אותיות שונות מציינות הבדלים סטטיסטיים בין הטיפולים (p < 0.05). (ד, ה) ניתוח רגרסיה של מודל Probit של L-אורניטין וקוטל הפטריות המסחרי Rizolex-T, בהתאמה. קו הרגרסיה של מודל ה-probit מוצג כקו כחול רציף, ורווח הסמך (95%) מוצג כקו אדום מקווקו.
בנוסף, בוצע ניתוח רגרסיה של פרוביט והגרפים המתאימים מוצגים בטבלה 1 ובאיורים 2D,E. בקצרה, ערך השיפוע המקובל (y = 2.92x − 4.67) וסטטיסטיקות מובהקות נלוות (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 ו-p < 0.0001; איור 2D) של L-אורניטין הצביעו על פעילות אנטי-פטרייתית מוגברת כנגד S. sclerotiorum בהשוואה לקוטל הפטריות המסחרי Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 ו-p < 0.0001) (טבלה 1).
טבלה 1. ערכים של ריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC50) ו-IC99 (מ"ג/ליטר) של L-אורניטין וקוטל הפטריות המסחרי "Rizolex-T" כנגד S. sclerotiorum.
בסך הכל, L-אורניטין (250 מ"ג/ליטר) הפחית משמעותית את התפתחות וחומרת העובש הלבן בצמחי שעועית מצויה שטופלו בהשוואה לצמחים נגועים ב-S. sclerotiorum שלא טופלו (קבוצת ביקורת; איור 3א'). בקצרה, למרות שחומרת המחלה בצמחי ביקורת נגועים שלא טופלו עלתה בהדרגה (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, ו-92.33 ± 3.06%), L-אורניטין הפחית משמעותית את חומרת המחלה (%) לאורך הניסוי (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, ו-26.36 ± 3.07) 7, 14 ו-21 ימים לאחר הטיפול (dpt), בהתאמה (איור 3א'). באופן דומה, כאשר צמחי שעועית נגועים ב-S. sclerotiorum טופלו ב-250 מ"ג/ליטר L-אורניטין, השטח מתחת לעקומת התקדמות המחלה (AUDPC) ירד מ-1274.33 ± 33.13 בקבוצת הביקורת הלא מטופלת ל-281.03 ± 7.95, שהיה נמוך במקצת מזה של קוטל הפטריות Rizolex-T בקבוצת הביקורת החיובית 50 מ"ג/ליטר (183.61 ± 7.71; איור 3B). אותה מגמה נצפתה בניסוי השני.
איור 3. השפעת יישום אקסוגני של L-אורניטין על התפתחות ריקבון לבן של שעועית מצויה הנגרם על ידי Sclerotinia sclerotiorum בתנאי חממה. (א) עקומת התקדמות המחלה של עובש לבן של שעועית מצויה לאחר טיפול ב-250 מ"ג/ליטר L-אורניטין. (ב) השטח מתחת לעקומת התקדמות המחלה (AUDPC) של עובש לבן של שעועית מצויה לאחר טיפול ב-L-אורניטין. הערכים מייצגים את הממוצע ± סטיית תקן של חמש חזרות ביולוגיות (n = 5). אותיות שונות מציינות הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הטיפולים (p < 0.05).
ייבוש אקסוגני של 250 מ"ג/ליטר L-אורניטין הגדיל בהדרגה את גובה הצמח (איור 4A), את מספר הענפים לצמח (איור 4B) ואת מספר העלים לצמח (איור 4C) לאחר 42 ימים. בעוד שקוטל הפטריות המסחרי Rizolex-T (50 מ"ג/ליטר) השפיע בצורה הגדולה ביותר על כל הפרמטרים התזונתיים שנחקרו, ייבוש אקסוגני של 250 מ"ג/ליטר L-אורניטין השפיע בצורה השנייה בגודלה בהשוואה לקבוצת הביקורת שלא טופלה (איורים 4A-C). מצד שני, לטיפול ב-L-אורניטין לא הייתה השפעה משמעותית על תכולת הפיגמנטים הפוטוסינתטיים כלורופיל a (איור 4D) וכלורופיל b (איור 4E), אך הוא הגדיל מעט את תכולת הקרוטנואידים הכוללת (0.56 ± 0.03 מ"ג/גרם לכלורופיל) בהשוואה לקבוצת הביקורת השלילית (0.44 ± 0.02 מ"ג/גרם לכלורופיל) ולקבוצת הביקורת החיובית (0.46 ± 0.02 מ"ג/גרם לכלורופיל; איור 4F). בסך הכל, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-L-אורניטין אינו פיטוטוקסי לקטניות שטופלו ואף עשוי לעורר את צמיחתן.
איור 4. השפעת יישום אקסוגני של L-אורניטין על מאפייני צמיחה ופיגמנטים פוטוסינתטיים של עלי שעועית נגועים ב-Sclerotinia sclerotiorum בתנאי חממה. (א) גובה הצמח (ס"מ), (ב) מספר ענפים לצמח, (ג) מספר עלים לצמח, (ד) תכולת כלורופיל a (מ"ג g-1 למשקל), (ה) תכולת כלורופיל b (מ"ג g-1 למשקל), (ו) תכולת קרוטנואידים כוללת (מ"ג g-1 למשקל). הערכים הם ממוצע ± סטיית תקן של חמישה חזרות ביולוגיות (n = 5). אותיות שונות מציינות הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הטיפולים (p < 0.05).
לוקליזציה היסטוכימית באתר של מיני חמצן פעילים (ROS; המתבטאים כמי חמצן [H2O2]) ורדיקלים חופשיים (המתבטאים כאניוני סופראוקסיד [O2•−]) גילתה כי יישום אקסוגני של L-אורניטין (250 מ"ג/ליטר) הפחית משמעותית את הצטברות ה-H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; איור 5A) ו-O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; איור 5B) בהשוואה להצטברות של צמחים נגועים שלא טופלו (173.31 ± 12.06 ו-149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, בהתאמה) וצמחים שטופלו ב-50 מ"ג/ליטר של קוטל הפטריות המסחרי Rizolex-T (170.12 ± 9.50 ו-157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, בהתאמה) לאחר 72 שעות. רמות גבוהות של H2O2 ו-O2•− הצטברו תחת hpt (איור 5A, B). באופן דומה, בדיקת מלונדיאלדהיד (MDA) מבוססת TCA הראתה שצמחי שעועית נגועים ב-S. sclerotiorum צברו רמות גבוהות יותר של MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g/fr wt) בעלים שלהם (איור 5C). עם זאת, יישום אקסוגני של L-אורניטין הפחית משמעותית את חמצון השומנים כפי שמעידה הירידה בתכולת MDA בצמחים שטופלו (33.08 ± 4.00 nmol.g/fr wt).
איור 5. השפעת מתן L-אורניטין אקסוגני על סמנים עיקריים של עקה חמצונית ומנגנוני הגנה נוגדי חמצון לא אנזימטיים בעלי שעועית נגועים ב-S. sclerotiorum 72 שעות לאחר ההדבקה בתנאי חממה. (א) מי חמצן (H2O2; nmol g−1 FW) ב-72 hpt, (ב) אניון סופראוקסיד (O2•−; nmol g−1 FW) ב-72 hpt, (ג) מלונדיאלדהיד (MDA; nmol g−1 FW) ב-72 hpt, (ד) סך הפנולים המסיסים (mg GAE g−1 FW) ב-72 hpt, (ה) סך הפלבנואידים המסיסים (mg RE g−1 FW) ב-72 hpt, (ו) סך חומצות האמינו החופשיות (mg g−1 FW) ב-72 hpt, ו-(ז) תכולת פרולין (mg g−1 FW) ב-72 hpt. הערכים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן (ממוצע ± סטיית תקן) של 5 חזרות ביולוגיות (n = 5). אותיות שונות מציינות הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הטיפולים (p < 0.05).