תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
ננו-חלקיקי אינסולין (NPs) בעלי תכולת טעינה גבוהה מצאו יישומים שונים בצורות מינון שונות. עבודה זו שואפת להעריך את ההשפעה של תהליכי ייבוש בהקפאה וייבוש בהתזה על מבנה ננו-חלקיקי כיטוזן טעונים באינסולין, עם או בלי מניטול כקריופרוטקטנט. כמו כן, הערכנו את איכות הננו-חלקיקים הללו על ידי המסתם מחדש. לפני ההתייבשות, גודל החלקיקים של הננו-חלקיקים המקושרים מצולבים בין כיטוזן/נתרן טריפוליפוספט/אינסולין עבר אופטימיזציה ל-318 ננומטר, ה-PDI היה 0.18, יעילות הקפסולציה הייתה 99.4% והטעינה הייתה 25.01%. לאחר השחזור, כל הננו-חלקיקים, למעט אלו שיוצרו בשיטת ייבוש בהקפאה ללא שימוש במניטול, שמרו על מבנה החלקיקים הכדורי שלהם. בהשוואה לננו-חלקיקים המכילים מניטול שהתייבשו באמצעות התזה, ננו-חלקיקים מיובשים בהתזה ללא מניטול הראו גם את גודל החלקיקים הממוצע הקטן ביותר (376 ננומטר) ואת תכולת הטעינה הגבוהה ביותר. (25.02%) עם שיעור אנקפסולציה דומה (98.7%) ו-PDI (0.20) דומה בטכניקות ייבוש או ייבוש בהקפאה. הננו-חלקיקים המיובשים על ידי ייבוש בהתזה ללא מניטול הביאו גם לשחרור המהיר ביותר של אינסולין וליעילות הגבוהה ביותר של קליטה תאית. עבודה זו מראה כי ייבוש בהתזה יכול לייבש ננו-חלקיקי אינסולין ללא צורך בחומרי קריופרוטקציה בהשוואה לשיטות ייבוש בהקפאה קונבנציונליות, מה שיוצר קיבולת טעינה גדולה יותר, דרישות תוספים נמוכות יותר ועלויות תפעול יתרון משמעותי.
מאז גילויו בשנת 19221,2,3, אינסולין ותכשיריו הפרמצבטיים הצילו את חייהם של חולי סוכרת מסוג 1 (T1DM) וסוכרת מסוג 2 (T1DM). עם זאת, בשל תכונותיו כחלבון בעל משקל מולקולרי גבוה, אינסולין מתפרק בקלות, מתפרק על ידי אנזימים פרוטאוליטיים ומסולק על ידי אפקט המעבר הראשון. אנשים שאובחנו עם סוכרת מסוג 1 זקוקים לזריקות אינסולין למשך שארית חייהם. חולים רבים שאובחנו בתחילה עם סוכרת מסוג 2 זקוקים גם הם לזריקות אינסולין ארוכות טווח. זריקות אינסולין יומיות הן מקור רציני לכאב ואי נוחות יומיומיים עבור אנשים אלה, עם השפעות שליליות על בריאות הנפש. כתוצאה מכך, צורות אחרות של מתן אינסולין הגורמות פחות אי נוחות, כגון מתן אינסולין דרך הפה, נחקרות בהרחבה5 מכיוון שיש להן פוטנציאל לשקם את איכות חייהם של כ-5 מיליארד אנשים עם סוכרת ברחבי העולם.
טכנולוגיית ננו-חלקיקים סיפקה התקדמות משמעותית בניסיונות ליטול אינסולין דרך הפה4,6,7. אינסולין שעוטף ביעילות את האינסולין ומגן עליו מפני פירוק, לצורך אספקה ​​ממוקדת לאתרים ספציפיים בגוף. עם זאת, לשימוש בניסוחים של ננו-חלקיקים יש מספר מגבלות, בעיקר בשל בעיות יציבות של תרחיפים של חלקיקים. צבירה מסוימת עשויה להתרחש במהלך האחסון, מה שמפחית את הזמינות הביולוגית של ננו-חלקיקים טעוני אינסולין8. בנוסף, יש לקחת בחשבון גם את היציבות הכימית של מטריצת הפולימר של ננו-חלקיקים ואינסולין כדי להבטיח את יציבותם של ננו-חלקיקי אינסולין (NPs). כיום, טכנולוגיית ייבוש בהקפאה היא תקן הזהב ליצירת NPs יציבים תוך מניעת שינויים לא רצויים במהלך האחסון9.
עם זאת, ייבוש בהקפאה דורש הוספת חומרים קריופרוטקטיבים כדי למנוע מהמבנה הכדורי של ננו-חלקיקי האינסולין להיות מושפע מהמאמץ המכני של גבישי קרח. זה מפחית משמעותית את העומס של ננו-חלקיקי אינסולין לאחר הליופיליזציה, מכיוון שהקריופרוטקט תופס את רוב יחס המשקל. לכן, ננו-חלקיקי האינסולין המיוצרים נמצאים לעתים קרובות כלא מתאימים לייצור פורמולציות אבקה יבשות, כגון טבליות דרך הפה וסרטים דרך הפה, עקב הצורך בכמויות גדולות של ננו-חלקיקים יבשים כדי להשיג את החלון הטיפולי של אינסולין.
ייבוש בהתזה הוא תהליך תעשייתי ידוע וזול לייצור אבקות יבשות מפאזות נוזליות בתעשיית התרופות10,11. שליטה על תהליך יצירת החלקיקים מאפשרת אנקפסולציה נכונה של מספר תרכובות ביו-אקטיביות12, 13. יתר על כן, היא הפכה לטכניקה יעילה להכנת חלבונים אנקפסולריים למתן דרך הפה. במהלך ייבוש בהתזה, מים מתאדים מהר מאוד, מה שעוזר לשמור על טמפרטורת ליבת החלקיקים נמוכה11,14, מה שמאפשר את יישומם לאנקפסולציה של רכיבים רגישים לחום. לפני ייבוש בהתזה, יש להומוגניזציה ביסודיות של חומר הציפוי עם התמיסה המכילה את המרכיבים האנקפסולריים11,14. בניגוד לייבוש בהקפאה, הומוגניזציה לפני אנקפסולציה בייבוש בהתזה משפרת את יעילות האנקפסולציה במהלך התייבשות. מכיוון שתהליך האנקפסולציה של ייבוש בהתזה אינו דורש חומרי קריוגן, ניתן להשתמש בייבוש בהתזה לייצור ננו-חלקיקים מיובשים עם תכולת טעינה גבוהה.
מחקר זה מדווח על ייצור ננו-חלקיקים עמוסי אינסולין על ידי קישור צולב של כיטוזן ונתרן טריפוליפוספט בשיטת ג'ל יונים. ג'לציה של יונים היא שיטת הכנה המאפשרת ייצור של ננו-חלקיקים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין שני מינים יוניים או יותר בתנאים מסוימים. ייבוש בהקפאה וייבוש בהתזה שימשו גם לטכניקות ייבוש בהקפאה וגם לייבוש בהתזה כדי לייבש את הננו-חלקיקים המקושרים צולבים של כיטוזן/נתרן טריפוליפוספט/אינסולין שעברו אופטימיזציה. לאחר הייבוש, המורפולוגיה שלהם נותחה על ידי SEM. יכולת הרקומבינציה שלהם הוערכה על ידי מדידת פיזור הגודל שלהם, מטען פני השטח, PDI, יעילות אנקפסולציה ותכולת הטעינה. איכות הננו-חלקיקים שעברו מסיסות מחדש שיוצרו בשיטות ייבוש שונות הוערכה גם על ידי השוואת ההגנה שלהם מפני אינסולין, התנהגות השחרור ויעילות הספיגה התאית.
רמת החומציות (pH) של התמיסה המעורבת והיחס בין כיטוזן לאינסולין הם שני גורמים מרכזיים המשפיעים על גודל החלקיקים ויעילות האנקפסולציה (EE) של הננו-חלקיקים הסופיים, שכן הם משפיעים ישירות על תהליך הג'לציה היונוטרופית. רמת החומציות של התמיסה המעורבת הוכחה כקשורה מאוד לגודל החלקיקים ויעילות האנקפסולציה (איור 1א'). כפי שמוצג באיור 1א', ככל שה-pH עלה מ-4.0 ל-6.0, גודל החלקיקים הממוצע (nm) ירד וה-EE גדל משמעותית, בעוד שכאשר ה-pH עלה ל-6.5, גודל החלקיקים הממוצע החל לעלות וה-EE נותר ללא שינוי. ככל שהיחס בין כיטוזן לאינסולין עולה, גם גודל החלקיקים הממוצע עולה. יתר על כן, לא נצפה שינוי ב-EE כאשר ננו-חלקיקים הוכנו ביחס מסה של כיטוזן/אינסולין גבוה מ-2.5:1 (w/w) (איור 1ב'). לכן, נעשה שימוש בתנאי ההכנה האופטימליים במחקר זה (pH 6.0, יחס מסה של כיטוזן/אינסולין של 2.5:1). כדי להכין ננו-חלקיקים טעונים באינסולין למחקר נוסף. תחת תנאי הכנה אלה, גודל החלקיקים הממוצע של ננו-חלקיקי האינסולין עבר אופטימיזציה ל-318 ננומטר (איור 1c), ה-PDI היה 0.18, יעילות ההטמעה הייתה 99.4%, פוטנציאל הזטה היה 9.8 mV, וטעינת האינסולין הייתה 25.01% (m/m). בהתבסס על תוצאות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM), הננו-חלקיקים הממוטבים היו כדוריים בקירוב ובדידים עם גודל אחיד יחסית (איור 1d).
אופטימיזציה של פרמטרים של ננו-חלקיקי אינסולין: (א) השפעת ה-pH על הקוטר הממוצע ויעילות הקפסולציה (EE) של ננו-חלקיקי אינסולין (הוכנו ביחס מסה של 5:1 בין כיטוזן לאינסולין); (ב) כיטוזן והשפעת יחס המסה של אינסולין על הקוטר הממוצע ויעילות הקפסולציה (EE) של ננו-חלקיקי אינסולין (הוכנו ב-pH 6); (ג) התפלגות גודל החלקיקים של ננו-חלקיקי אינסולין ממוטבים; (ד) מיקרוסקופ TEM של ננו-חלקיקי אינסולין ממוטבים.
ידוע היטב כי כיטוזן הוא פוליאלקטרוליט חלש עם pKa של 6.5. הוא טעון באופן חיובי בסביבה חומצית מכיוון שקבוצת האמינו העיקרית שלו מופרזת על ידי יוני מימן15. לכן, הוא משמש לעתים קרובות כנשא לכיסוי מקרומולקולות טעונות שליליות. במחקר זה, כיטוזן שימש לכיסוי אינסולין עם נקודה איזואלקטרית של 5.3. מכיוון שכיטוזן משמש כחומר ציפוי, עם העלייה בפרופורציה שלו, עובי השכבה החיצונית של הננו-חלקיקים עולה בהתאם, וכתוצאה מכך גודל חלקיקים ממוצע גדול יותר. בנוסף, רמות גבוהות יותר של כיטוזן יכולות לכיסוי יותר אינסולין. במקרה שלנו, EE היה הגבוה ביותר כאשר היחס בין כיטוזן לאינסולין הגיע ל-2.5:1, ולא היה שינוי משמעותי ב-EE כאשר היחס המשיך לעלות.
מלבד היחס בין כיטוזן לאינסולין, גם ל-pH היה תפקיד מכריע בהכנת ננו-חלקיקים. גאן ועמיתיו [17] חקרו את השפעת ה-pH על גודל החלקיקים של ננו-חלקיקי כיטוזן. הם מצאו ירידה מתמשכת בגודל החלקיקים עד שה-pH הגיע ל-6.0, ועלייה משמעותית בגודל החלקיקים נצפתה ב-pH > 6.0, דבר התואם את התצפיות שלנו. תופעה זו נובעת מהעובדה שעם עליית ה-pH, מולקולת האינסולין רוכשת מטען פני שטח שלילי, ובכך מעדיפה אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם קומפלקס כיטוזן/נתרן טריפוליפוספט (TPP), וכתוצאה מכך גודל חלקיקים קטן ו-EE גבוה. עם זאת, כאשר ה-pH הותאם ל-6.5, קבוצות האמינו על הכיטוזן עברו דה-פרוטונציה, וכתוצאה מכך קיפול כיטוזן. לפיכך, pH גבוה גורם לחשיפה פחותה של יוני אמינו ל-TPP ולאינסולין, וכתוצאה מכך קישור צולב נמוך יותר, גודל חלקיקים ממוצע סופי גדול יותר ו-EE נמוך יותר.
ניתוח התכונות המורפולוגיות של ננו-חלקיקים מיובשים בהקפאה ובריסוס יכול להנחות את בחירת טכניקות טובות יותר להתייבשות ויצירת אבקה. השיטה המועדפת צריכה לספק יציבות תרופה, צורת חלקיקים אחידה, עומס תרופה גבוה ומסיסות טובה בתמיסה המקורית. במחקר זה, כדי להשוות טוב יותר בין שתי הטכניקות, נעשה שימוש בננו-חלקיקים של אינסולין עם או בלי 1% מניטול במהלך ההתייבשות. מניטול משמש כחומר תפיחה או כמגן קריוגני בניסוחים שונים של אבקה יבשה לייבוש בהקפאה וייבוש ריסוס. עבור ננו-חלקיקי אינסולין שעברו ליופיליזציה ללא מניטול, כפי שמוצג באיור 2א', נצפה מבנה אבקה נקבובי ביותר עם משטחים גדולים, לא סדירים ומחוספסים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). מעט חלקיקים נפרדים זוהו באבקה לאחר ההתייבשות (איור 2ה'). תוצאות אלו מצביעות על כך שרוב הננו-חלקיקים התפרקו במהלך ייבוש בהקפאה ללא כל מגן קריוגני. עבור ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בהקפאה ובריסוס המכילים 1% מניטול, נצפו ננו-חלקיקים כדוריים עם משטחים חלקים (איור 2ב',ד',ו',ח'). אינסולין ננו-חלקיקים שיובשו בריסוס ללא מניטול נותרו כדוריים אך מקומטים על פני השטח (איור 2ג). משטחים כדוריים ומקומטים נדונים בהרחבה בבדיקות התנהגות השחרור והקליטה התאית להלן. בהתבסס על המראה הנראה לעין של הננו-חלקיקים המיובשים, הן ננו-חלקיקים שיובשו בריסוס ללא מניטול והן ננו-חלקיקים שיובשו בהקפאה ויובשו בריסוס עם מניטול הניבו אבקות ננו-חלקיקים דקות (איור 2ו, ז, ח). ככל ששטח הפנים בין משטחי החלקיקים גדול יותר, כך המסיסות גבוהה יותר ולכן קצב השחרור גבוה יותר.
מורפולוגיה של ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים שונים: (א) תמונת SEM של ננו-חלקיקי אינסולין שעברו ליופיליזציה ללא מניטול; (ב) תמונת SEM של ננו-חלקיקי אינסולין שעברו ליופיליזציה עם מניטול; (ג) ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בהתזה ללא מניטול תמונת SEM של; (ד) תמונת SEM של ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בהתזה עם מניטול; (ה) תמונה של אבקת ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בהתזה ללא מניטול; (ו) תמונה של ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בהתזה עם מניטול; (ז) תמונה של אבקת ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בהתזה ללא מניטול; (ח) תמונה של אבקת ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בהתזה עם מניטול.
במהלך ייבוש בהקפאה, מניטול פועל כמגן קריוגן, שומר על ננו-חלקיקים בצורה אמורפית ומונע נזק מגבישי קרח19. לעומת זאת, אין שלב הקפאה במהלך ייבוש ריסוס. לכן, מניטול אינו נדרש בשיטה זו. למעשה, ננו-חלקיקים מיובשים בהתזה ללא מניטול הניבו ננו-חלקיקים עדינים יותר כפי שתואר קודם לכן. עם זאת, מניטול עדיין יכול לשמש כחומר מילוי בתהליך ייבוש הריסוס כדי לתת לננו-חלקיקים מבנה כדורי יותר20 (איור 2ד), מה שעוזר להשיג התנהגות שחרור אחידה של ננו-חלקיקים ארוזים כאלה. בנוסף, ברור שניתן לזהות חלקיקים גדולים הן בננו-חלקיקים מיובשים בהקפאה והן בננו-חלקיקים מיובשים בהתזה המכילים מניטול (איור 2ב,ד), דבר שעשוי להיות עקב הצטברות של מניטול בליבת החלקיק יחד עם האינסולין הארוז. שכבת כיטוזן. ראוי לציין שבמחקר זה, על מנת להבטיח שהמבנה הכדורי יישאר שלם לאחר התייבשות, היחס בין מניטול לכיטוזן נשמר על 5:1, כך שכמות גדולה של חומר מילוי יכולה גם להגדיל את גודל החלקיקים של הננו-חלקיקים המיובשים.
ספקטרוסקופיית FTIR-ATR (השתקפות כוללת מוחלשת באינפרא אדום טרנספורמציית פורייה) אפיינתה את התערובת הפיזיקלית של אינסולין חופשי, כיטוזן, כיטוזן, TPP ואינסולין. כל הננו-חלקיקים המיובשים אופיינו באמצעות ספקטרוסקופיית FTIR-ATR. ראוי לציין כי עוצמות פסים של 1641, 1543 ו-1412 ס"מ-1 נצפו בננו-חלקיקים אנקפסולריים מיובשים בהקפאה עם מניטול ובננו-חלקיקים מיובשים בהתזה עם ובלי מניטול (איור 3). כפי שדווח בעבר, עליות אלו בחוזק היו קשורות לקישור צולב בין כיטוזן, TPP ואינסולין. חקירת האינטראקציה בין כיטוזן לאינסולין הראתה שבספקטרום FTIR של ננו-חלקיקי כיטוזן טעונים באינסולין, פס הכיטוזן חופף לפס של אינסולין, מה שהגדיל את עוצמת הקרבוניל (1641 ס"מ-1) וחגורת האמין (1543 ס"מ-1). קבוצות הטריפוליפוספט של TPP מקושרות לקבוצות אמוניום בכיטוזן, ויוצרות פס ב 1412 ס"מ-1.
ספקטרום FTIR-ATR של אינסולין חופשי, כיטוזן, תערובות פיזיקליות של כיטוזן/TPP/אינסולין ו-NPs מיובשים בשיטות שונות.
יתר על כן, תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם אלו שהוצגו ב-SEM, שהראו כי חלקיקים אנקפסולריים נותרו שלמים הן לאחר ריסוס והן לאחר ייבוש בהקפאה עם מניטול, אך בהיעדר מניטול, רק ייבוש בהתזה יצר חלקיקים אנקפסולריים. לעומת זאת, תוצאות הספקטרליות של FTIR-ATR של חלקיקים אנקפסולריים מיובשים בהקפאה ללא מניטול היו דומות מאוד לתערובת הפיזיקלית של כיטוזן, TPP ואינסולין. תוצאה זו מצביעה על כך שהקשרים הצולבים בין כיטוזן, TPP ואינסולין אינם קיימים עוד ב-NPs מיובשים בהקפאה ללא מניטול. מבנה ה-NPs נהרס במהלך ייבוש בהקפאה ללא חומר קריופרוטקטיב, כפי שניתן לראות בתוצאות ה-SEM (איור 2א). בהתבסס על המורפולוגיה ותוצאות FTIR של חלקיקים אנקפסולריים של אינסולין מיובשים, רק חלקיקים אנקפסולריים שעברו ליופיליזציה, מיובשים בהקפאה וללא מניטול שימשו לניסויי שחזור, ורק חלקיקים אנקפסולריים ללא מניטול עקב פירוק של חלקיקים אנקפסולריים ללא מניטול במהלך התייבשות.
התייבשות משמשת לאחסון ארוך טווח ולעיבוד מחדש לתכשירים אחרים. היכולת של ננו-חלקיקים יבשים להתחדש לאחר האחסון היא קריטית לשימושם בתכשירים שונים כמו טבליות וסרטים. שמנו לב שגודל החלקיקים הממוצע של ננו-חלקיקי האינסולין המיובשים בריסוס בהיעדר מניטול גדל רק במעט לאחר החימום. מצד שני, גודל החלקיקים של ננו-חלקיקי האינסולין המיובשים בריסוס ומיובשים בהקפאה עם מניטול גדל משמעותית (טבלה 1). PDI ו-EE לא השתנו משמעותית (p > 0.05) לאחר רקומבינציה של כל הננו-חלקיקים במחקר זה (טבלה 1). תוצאה זו מצביעה על כך שרוב החלקיקים נותרו שלמים לאחר המסה מחדש. עם זאת, הוספת המניטול הביאה להפחתה משמעותית של עומס האינסולין של ננו-חלקיקי מניטול שעברו ליופיליזציה ומיובשים בריסוס (טבלה 1). לעומת זאת, תכולת עומס האינסולין של ננו-חלקיקי מניטול מיובשים בריסוס ללא מניטול נותרה זהה לבעבר (טבלה 1).
ידוע היטב כי טעינת ננו-חלקיקים היא קריטית כאשר משתמשים בהם למטרות מתן תרופות. עבור ננו-חלקיקים בעלי טעינות נמוכה, נדרשות כמויות גדולות מאוד של חומר כדי להגיע לסף הטיפולי. עם זאת, הצמיגות הגבוהה של ריכוזי ננו-חלקיקים גבוהים כאלה מובילה לאי נוחות וקושי במתן פומי ובפורמולציות להזרקה, בהתאמה 22. בנוסף, ניתן להשתמש בננו-חלקיקים של אינסולין גם לייצור טבליות וביו-פילמים צמיגים 23, 24, דבר הדורש שימוש בכמויות גדולות של ננו-חלקיקים ברמות טעינה נמוכות, וכתוצאה מכך טבליות גדולות וביו-פילמים עבים שאינם מתאימים ליישומים פומיים. לכן, ננו-חלקיקים מיובשים עם עומס אינסולין גבוה הם רצויים מאוד. תוצאותינו מצביעות על כך שעומס האינסולין הגבוה של ננו-חלקיקים מיובשים בהתזה ללא מניטול יכול להציע יתרונות אטרקטיביים רבים עבור שיטות מתן חלופיות אלו.
כל הננו-חלקיקים המיובשים נשמרו במקרר למשך שלושה חודשים. תוצאות SEM הראו כי המורפולוגיה של כל הננו-חלקיקים המיובשים לא השתנתה באופן משמעותי במהלך תקופת האחסון של שלושת חודשי המחקר (איור 4). לאחר שחזור במים, כל הננו-חלקיקים הראו ירידה קלה ב-EE ושחררו כמות קטנה בערך (~5%) של אינסולין במהלך תקופת האחסון של שלושת חודשי המחקר (טבלה 2). עם זאת, גודל החלקיקים הממוצע של כל הננו-חלקיקים גדל. גודל החלקיקים של הננו-חלקיקים המיובשים בריסוס ללא מניטול גדל ל-525 ננומטר, בעוד שגודל החלקיקים של הננו-חלקיקים המיובשים בריסוס ומיובשים בהקפאה עם מניטול גדל ל-872 ו-921 ננומטר, בהתאמה (טבלה 2).
מורפולוגיה של ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים שונים שאוחסנו במשך שלושה חודשים: (א) תמונת SEM של ננו-חלקיקי אינסולין שעברו ליופיליזציה עם מניטול; (ב) תמונת SEM של ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בריסוס ללא מניטול; (ג) תמונות SEM של ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בריסוס ללא מניטול.
יתר על כן, נצפו משקעים בחלקיקי הננו-אינסולין המשוחזרים לאחר ייבוש בריסוס עם מניטול ויובש בהקפאה (איור S2). ייתכן שהדבר נגרם עקב חוסר השעיה של חלקיקים גדולים במים. כל התוצאות הנ"ל מראות כי טכניקת ייבוש הריסוס יכולה להגן על חלקיקי הננו-אינסולין מפני התייבשות וכי ניתן להשיג כמות גבוהה של חלקיקי ננו-אינסולין ללא חומרי מילוי או חומרי קריוגן.
אצירת אינסולין נבדקה במדיום pH = 2.5 עם פפסין, טריפסין ו-α-כימוטריפסין כדי להדגים את יכולת ההגנה של ננו-חלקיקים מפני עיכול אנזימטי לאחר התייבשות. אצירת האינסולין של ננו-חלקיקים מיובשים הושוותה לזו של ננו-חלקיקים שהוכנו טריים, ואינסולין חופשי שימש כביקורת שלילית. במחקר זה, אינסולין חופשי הראה סילוק מהיר של אינסולין תוך 4 שעות בכל שלושת הטיפולים האנזימטיים (איור 5a-c). לעומת זאת, בדיקת סילוק אינסולין של ננו-חלקיקים מיובשים בהקפאה עם מניטול וננו-חלקיקים מיובשים בריסוס עם או בלי מניטול הראה הגנה גבוהה משמעותית של ננו-חלקיקים אלה מפני עיכול אנזימטי, בדומה לזו של ננו-חלקיקים אינסוליניים שהוכנו טריים (איור 1). 5a-c). בעזרת ננו-חלקיקים בפפסין, טריפסין ו-α-כימוטריפסין, ניתן היה להגן על יותר מ-50%, 60% ו-75% מהאינסולין תוך 4 שעות, בהתאמה (איור 5a-c). יכולת הגנה זו מפני אינסולין עשויה להגביר את הסיכוי לספיגת אינסולין גבוהה יותר. לזרם הדם25. תוצאות אלו מצביעות על כך שייבוש בהתזה עם או בלי מניטול וייבוש בהקפאה עם מניטול יכולים לשמר את יכולת ההגנה מפני אינסולין של ננו-חלקיקים לאחר התייבשות.
הגנה והתנהגות שחרור של ננו-חלקיקים מיובשים באינסולין: (א) הגנה על אינסולין בתמיסת פפסין; (ב) הגנה על אינסולין בתמיסת טריפסין; (ג) הגנה על אינסולין על ידי תמיסת α-כימוטריפסין; (ד) התנהגות שחרור של ננו-חלקיקים מיובשים בתמיסה של pH 2.5; (ה) התנהגות שחרור של ננו-חלקיקים מיובשים בתמיסה של pH 6.6; (ו) התנהגות שחרור של ננו-חלקיקים מיובשים בתמיסה של pH 7.0.
ננו-חלקיקי אינסולין יבשים שהוכנו ומשוחזרים טריים הודגרו במגוון בופרים (pH = 2.5, 6.6, 7.0) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך הדמיה של סביבת ה-pH של הקיבה, התריסריון והמעי הדק העליון, כדי לבחון את השפעת האינסולין על עמידות לאינסולין. התנהגות שחרור בסביבות שונות. מקטע של מערכת העיכול. ב-pH = 2.5, ננו-חלקיקים טעונים באינסולין וננו-חלקיקים אינסולין יבשים שעברו מסיסות חוזרת הראו שחרור התפרצות ראשוני בתוך השעה הראשונה, ולאחר מכן שחרור איטי במהלך 5 השעות הבאות (איור 5ד). שחרור מהיר זה בהתחלה הוא ככל הנראה תוצאה של ספיחה מהירה על פני השטח של מולקולות חלבון שאינן מקובעות לחלוטין במבנה הפנימי של החלקיק. ב-pH = 6.5, ננו-חלקיקים טעונים באינסולין וננו-חלקיקים אינסולין יבשים שעברו משוחזר הראו שחרור חלק ואיטי במשך 6 שעות, מכיוון ש-pH של תמיסת הבדיקה היה דומה לזה של התמיסה שהוכנה עם ננו-חלקיקים (איור 5ה). ב-pH = 7, הננו-חלקיקים היו לא יציבים וכמעט התפרקו לחלוטין בתוך השעתיים הראשונות (איור 5ו). הסיבה לכך היא שדה-פרוטונציה של כיטוזן מתרחשת ב-pH גבוה יותר, מה שמביא לרשת פולימרית פחות קומפקטית ולשחרור של אינסולין טעון.
יתר על כן, ננו-חלקיקי האינסולין המיובשים בריסוס ללא מניטול הראו פרופיל שחרור מהיר יותר בהשוואה לננו-חלקיקים מיובשים אחרים (איור 5ד-ו). כפי שתואר קודם לכן, ננו-חלקיקי האינסולין המשוחזרים המיובשים ללא מניטול הראו את גודל החלקיקים הקטן ביותר. חלקיקים קטנים מספקים שטח פנים גדול יותר, כך שרוב התרופה הרלוונטית תהיה על פני החלקיק או בסמוך להם, וכתוצאה מכך שחרור תרופה מהיר .
הציטוטוקסיות של ננו-חלקיקים נחקרה באמצעות בדיקת MTT. כפי שמוצג באיור S4, נמצא כי לכל הננו-חלקיקים המיובשים לא הייתה השפעה משמעותית על כדאיות התאים בריכוזים של 50-500 מיקרוגרם/מ"ל, דבר המצביע על כך שניתן להשתמש בבטחה בכל הננו-חלקיקים המיובשים כדי להגיע לחלון הטיפולי.
הכבד הוא האיבר העיקרי שדרכו האינסולין מפעיל את תפקידיו הפיזיולוגיים. תאי HepG2 הם קו תאי הפטומה אנושיים המשמשים בדרך כלל כמודל קליטה של ​​הפטוציטים במבחנה. כאן, תאי HepG2 שימשו להערכת קליטה תאית של ננו-חלקיקים מיובשים באמצעות שיטות ייבוש בהקפאה וייבוש בהתזה. קליטה תאית על ידי סריקת לייזר קונפוקלית באמצעות ציטומטריית זרימה וראייה לאחר מספר שעות של דגירה עם אינסולין FITC חופשי בריכוז של 25 מיקרוגרם/מ"ל, ננו-חלקיקים טריים טעונים באינסולין FITC שהוכנו וננו-חלקיקים מיובשים טעונים באינסולין FITC בריכוזי אינסולין שווים. בוצעו תצפיות מיקרוסקופיות כמותיות (CLSM). ננו-חלקיקים ליופיליזים ללא מניטול נהרסו במהלך ההתייבשות ולא הוערכו בבדיקה זו. עוצמות הקרינה התוך-תאיות של ננו-חלקיקים טריים טעונים באינסולין, ננו-חלקיקים ליופיליזים עם מניטול וננו-חלקיקים מיובשים בהתזה עם ובלי מניטול (איור 6א) היו גבוהות פי 4.3, 2.6, 2.4 ו-4.1 מהחופשיות. אינסולין FITC קבוצה, בהתאמה (איור 6b). תוצאות אלו מצביעות על כך שאינסולין אנקפסוללי חזק יותר בקליטה תאית מאשר אינסולין חופשי, בעיקר בשל גודלם הקטן יותר של הננו-חלקיקים טעוני האינסולין שיוצרו במחקר.
קליטת תאי HepG2 לאחר דגירה של 4 שעות עם ננו-חלקיקים טריים ועם ננו-חלקיקים מיובשים: (א) התפלגות קליטת אינסולין FITC על ידי תאי HepG2. (ב) ממוצע גיאומטרי של עוצמות פלואורסצנציה מנותח על ידי ציטומטריית זרימה (n = 3), *P < 0.05 בהשוואה לאינסולין חופשי.
באופן דומה, תמונות CLSM הראו שעוצמות הפלואורסצנציה של FITC של ננו-חלקיקים טעונים באינסולין ב-FITC שהוכנו טריים ושל ננו-חלקיקים מיובשים בריסוס ב-FITC (ללא מניטול) היו חזקות בהרבה מאלה של הדגימות האחרות (איור 6a). יתר על כן, עם תוספת של מניטול, הצמיגות הגבוהה יותר של התמיסה הגבירה את העמידות לקליטה תאית, וכתוצאה מכך פחתה בהתפשטות האינסולין. תוצאות אלו מצביעות על כך שננו-חלקיקים מיובשים בריסוס ללא מניטול הציגו את יעילות הקליטה התאית הגבוהה ביותר מכיוון שגודל החלקיקים שלהם היה קטן יותר מזה של ננו-חלקיקים מיובשים בהקפאה לאחר המסה מחדש.
כיטוזן (משקל מולקולרי ממוצע 100 KDa, 75-85% דה-אצטילציה) נרכש מסיגמא-אלדריץ' (אוקוויל, אונטריו, קנדה). נתרן טריפוליפוספט (TPP) נרכש מ-VWR (רדנור, פנסילבניה, ארה"ב). אינסולין אנושי רקומביננטי ששימש במחקר זה היה מפישר סיינטיפיק (וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב). אינסולין אנושי המסומן בפלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) ו-4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול דיהידרוכלוריד (DAPI) נרכשו מסיגמא-אלדריץ' (אוקוויל, אונטריו, קנדה). קו התאים HepG2 התקבל מ-ATCC (מנאסאס, וירג'יניה, ארה"ב). כל שאר הריאגנטים היו בדרגה אנליטית או כרומטוגרפית.
הכינו תמיסת CS בריכוז 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסתה במים מזוקקים כפולים (מים DD) המכילים 0.1% חומצה אצטית. הכינו תמיסות של 1 מ"ג/מ"ל של TPP ואינסולין על ידי המסתם במים DD וב-0.1% חומצה אצטית, בהתאמה. קדם-אמולסיה הוכנה באמצעות הומוגניזר מהיר פוליטרון PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, ניו יורק, ארה"ב). תהליך ההכנה הוא כדלקמן: ראשית, מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת TPP ל-4 מ"ל של תמיסת אינסולין, והתערובת מערבבת במשך 30 דקות ומעורבבת לחלוטין. לאחר מכן, התמיסה המעורבבת נוספה טיפה אחר טיפה לתמיסת CS באמצעות מזרק תחת ערבוב במהירות גבוהה (10,000 סל"ד). התערובות נשמרו תחת ערבוב במהירות גבוהה (15,000 סל"ד) באמבט קרח למשך 30 דקות, והן הותאמו ל-pH מסוים כדי לקבל ננו-חלקיקי אינסולין מקושרים צולבים. כדי להומוגני עוד יותר ולהקטין את גודל החלקיקים של ננו-חלקיקי האינסולין, הן עברו סוניקציה למשך... 30 דקות נוספות באמבט קרח באמצעות סוניקטור מסוג גשוש (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, גרמניה).
נבדקו ננו-חלקיקי אינסולין (NPS) לקוטר ממוצע Z, מדד פולידיספזריות (PDI) ופוטנציאל זטה באמצעות מדידות פיזור אור דינמי (DLS) באמצעות Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) על ידי דילולם במים DD בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. מורפולוגיה ופיזור גודל אופיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) מדגם Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Japan), ולאחר מכן נותחו התמונות באמצעות תוכנת הדמיה של Hitachi (Hitachi, Tokyo, Japan). כדי להעריך את יעילות הקפסולציה (EE) ואת קיבולת הטעינה (LC) של ננו-חלקיקי אינסולין, נבדקו באמצעות פיפטה לתוך צינורות אולטרה-סינון עם סף משקל מולקולרי של 100 kDa ועברו צנטריפוגה ב-500 xg למשך 30 דקות. אינסולין לא קפסול בתסנין נמדד כמותית באמצעות מערכת HPLC מסדרת Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, California, USA) המורכבת ממשאבה רביעית, דוגם אוטומטי, מחמם עמודה ו-DAD. גלאי. אינסולין נותח באמצעות עמודת C18 (Zorbax, 3.5 מיקרומטר, 4.6 מ"מ × 150 מ"מ, Agilent, ארה"ב) וזוהה ב-214 ננומטר. הפאזה הניידת הייתה אצטוניטריל ומים, המכילים 0.1% TFA, יחסי גרדיאנט מ-10/90 עד 100/0, והופעלה במשך 10 דקות. הפאזה הניידת נשאבה בקצב זרימה של 1.0 מ"ל/דקה. טמפרטורת העמודה נקבעה ל-20 מעלות צלזיוס. חשב את האחוזים של EE ו-LC באמצעות המשוואות (1) ומשוואה (2).
יחסים שונים של CS/אינסולין, הנעים בין 2.0 ל-4.0, נבדקו כדי לייעל את הננו-חלקיקי האינסולין. כמויות שונות של תמיסת CS נוספו במהלך ההכנה, בעוד שתערובת האינסולין/TPP נשמרה קבועה. ננו-חלקיקי אינסולין הוכנו בטווח pH של 4.0 עד 6.5 על ידי שליטה מדוקדקת ב-pH של התערובת לאחר הוספת כל התמיסות (אינסולין, TPP ו-CS). ה-EE וגודל החלקיקים של ננו-חלקיקי האינסולין הוערכו בערכי pH שונים וביחסי מסת CS/אינסולין כדי לייעל את היווצרות ננו-חלקיקי האינסולין.
ננו-חלקיקי האינסולין המותאמים הונחו על מיכל האלומיניום וכוסו בטישו והודקו בעזרת מעט סרט דביק. לאחר מכן, המיכלים המוברגים הונחו במייבש הקפאה FreeZone של Labconco (Labconco, קנזס סיטי, מיזורי, ארה"ב) המצויד במייבש מגשים. הטמפרטורה ולחץ הוואקום נקבעו על -10 מעלות צלזיוס, 0.350 טור במשך השעתיים הראשונות, ו-0 מעלות צלזיוס ו-0.120 טור במשך 22 השעות הנותרות מתוך 24 השעות כדי להשיג ננו-חלקיקי אינסולין יבשים.
מייבש הריסוס המיני Buchi B-290 (BÜCHI, Flawil, שוויץ) שימש לייצור אינסולין בכמוסה. פרמטרי הייבוש שנבחרו היו: טמפרטורה 100 מעלות צלזיוס, זרימת הזנה 3 ליטר/דקה וזרימת גז 4 ליטר/דקה.
חלקיקי ננו-חלקיקים של אינסולין לפני ואחרי התייבשות אופיינו באמצעות ספקטרוסקופיית FTIR-ATR. חלקיקים ננו-מיובשים, כמו גם אינסולין חופשי וצ'יטוזן, נותחו באמצעות ספקטרופוטומטר Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) המצויד באביזר דגימה אוניברסלי ל-ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). ממוצעי אותות התקבלו מ-16 סריקות ברזולוציה של 4 סמ"ר בטווח תדרים של 4000-600 סמ"ר.
המורפולוגיה של ננו-חלקיקי אינסולין יבשים הוערכה באמצעות תמונות SEM של ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בהקפאה ומיובשים בריסוס, שצולמו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן יונים ממוקדת Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, הילסבורו, אורגון, ארה"ב). הפרמטר העיקרי בו נעשה שימוש היה מתח של 5 keV וזרם של 30 mA.
כל ננו-חלקיקי האינסולין המיובשים הומסו מחדש במים טהורים. גודל החלקיקים, PDI, EE ו-LC נבדקו שוב באותה שיטה שהוזכרה קודם לכן כדי להעריך את איכותם לאחר התייבשות. יציבותם של ננו-חלקיקי אהידרו-אינסולין נמדדה גם על ידי בדיקת תכונות הננו-חלקיקים לאחר אחסון ממושך. במחקר זה, כל הננו-חלקיקים לאחר התייבשות אוחסנו במקרר למשך שלושה חודשים. לאחר שלושה חודשי אחסון, נבדקו הננו-חלקיקים עבור גודל חלקיקים מורפולוגי, PDI, EE ו-LC.
יש להמיס 5 מ"ל של ננו-חלקיקים משוחזרים ב-45 מ"ל המכילים נוזל קיבה מדומה (pH 1.2, המכיל 1% פפסין), נוזל מעיים (pH 6.8, המכיל 1% טריפסין) או תמיסת כימוטריפסין (100 גרם/מ"ל, בבופר פוספט, pH 7.8) כדי להעריך את יעילות האינסולין בהגנה על ננו-חלקיקים לאחר התייבשות. הם הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס במהירות ערבוב של 100 סל"ד. 500 מיקרוליטר מהתמיסה נאספו בנקודות זמן שונות וריכוז האינסולין נקבע באמצעות HPLC.
התנהגות השחרור במבחנה של ננו-חלקיקי אינסולין טריים ומיובשים נבדקה בשיטת שק הדיאליזה (סף משקל מולקולרי 100 kDa, Spectra Por Inc.). ננו-חלקיקים יבשים טריים שהוכנו ומשוחזרים עברו דיאליזה בנוזלים ב-pH 2.5, pH 6.6 ו-pH 7.0 (0.1 M תמיסת מלח מבוקרת פוספט, PBS) כדי לדמות את סביבת ה-pH של הקיבה, התריסריון והמעי הדק העליון, בהתאמה. כל הדגימות הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס תוך ניעור רציף במהירות של 200 סל"ד. שאבו את הנוזל מחוץ לשקית הדיאליזה של 5 מ"ל בזמנים הבאים: 0.5, 1, 2, 3, 4 ו-6 שעות, ומלאו מיד את הנפח בדיאליזט טרי. זיהום אינסולין בנוזל נותח על ידי HPLC, וקצב שחרור האינסולין מהננו-חלקיקים חושב מהיחס בין אינסולין חופשי ששוחרר לבין סך האינסולין העטוף בננו-חלקיקים (משוואה 3).
תאי HepG2 מקו תאי קרצינומה הפטוצלולרית אנושיים גודלו בצלחות בקוטר 60 מ"מ באמצעות מצע Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) המכיל 10% סרום בקר עוברי, 100 יחב"ל/מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין29. התרביות נשמרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 95% ו-5% CO2. עבור מבחני ספיגה, תאי HepG2 נזרעו בריכוז של 1 × 105 תאים/מ"ל על גבי מערכת שקופיות Nunc Lab-Tek בעלת 8 בארות (Thermo Fisher, ניו יורק, ארה"ב). עבור מבחני ציטוטוקסיות, הם נזרעו לפלטות בעלות 96 בארות (Corning, ניו יורק, ארה"ב) בצפיפות של 5 × 104 תאים/מ"ל.
מבחן ה-MTT שימש להערכת הציטוטוקסיות של ננו-חלקיקי אינסולין טריים שהוכנו ומיובשים30. תאי HepG2 נזרעו בצלחות עם 96 בארות בצפיפות של 5 × 104 תאים/מ"ל וגודלו במשך 7 ימים לפני הבדיקה. ננו-חלקיקי אינסולין דוללו לריכוזים שונים (50 עד 500 מיקרוגרם/מ"ל) במדיום תרבית ולאחר מכן ניתנו לתאים. לאחר 24 שעות של דגירה, התאים נשטפו 3 פעמים עם PBS והודגרו עם מדיום המכיל 0.5 מ"ג/מ"ל MTT למשך 4 שעות נוספות. ציטוטוקסיות הוערכה על ידי מדידת הרדוקציה האנזימטית של טטרזוליום MTT צהוב לפורמזן סגול ב-570 ננומטר באמצעות קורא לוחות ספקטרופוטומטר Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, שוויץ).
יעילות הקליטה התאית של ננו-חלקיקים נבדקה באמצעות מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית וניתוח ציטומטריית זרימה. כל באר במערכת שקופיות התא Nunc Lab-Tek טופלה באינסולין FITC חופשי, ננו-חלקיקים עמוסי אינסולין ב-FITC, ושוחזרה 25 מיקרוגרם/מ"ל של ננו-חלקיקים מיובשים של אינסולין FITC באותו ריכוז והודגרו במשך 4 שעות. התאים נשטפו 3 פעמים עם PBS וקיבעו עם 4% פאראפורמלדהיד. הגרעינים נצבעו ב-4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI). לוקליזציה של אינסולין נצפתה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Olympus FV1000 לסריקת לייזר/שני פוטונים (Olympus, שינג'וקו סיטי, טוקיו, יפן). לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה, אותם ריכוזים של 10 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין FITC חופשי, ננו-חלקיקים עמוסי אינסולין ב-FITC וננו-חלקיקים מיובשים של אינסולין FITC מומס מחדש נוספו לצלחות של 96 בארות עם תאי HepG2 והודגרו במשך 4 שעות. שעות. לאחר 4 שעות של דגירה, התאים הוסרו ונשטפו 3 פעמים עם FBS. 5 × 104 תאים לדגימה נותחו באמצעות ציטומטר זרימה BD LSR II (BD, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארצות הברית).
כל הערכים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן. השוואות בין כל הקבוצות הוערכו באמצעות ANOVA חד-כיווני או מבחן t על ידי IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, ניו יורק, ארה"ב) ו-p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.
מחקר זה מדגים את הגמישות והיכולת של ייבוש בהתזה לייבש חלקיקי ננו של כיטוזן/TPP/אינסולין מקושרים מצולבים עם שחזור טוב יותר בהשוואה לשיטות ייבוש בהקפאה סטנדרטיות המשתמשות בחומרי תפיחה או חומרי קריופרוטקציה וקיבולת טעינה גבוהה יותר. חלקיקי הננו של האינסולין שעברו אופטימיזציה הניבו גודל חלקיקים ממוצע של 318 ננומטר ויעילות אנקפסולציה של 99.4%. תוצאות SEM ו-FTIR לאחר התייבשות הראו כי המבנה הכדורי נשמר רק בננו-חלקיקים מיובשים בהתזה עם ובלי מניטול ועברו ליופיליזציה עם מניטול, אך ננו-חלקיקים שעברו ליופיליזציה ללא מניטול התפרקו במהלך ההתייבשות. במבחן יכולת השחזור, חלקיקי ננו של אינסולין שיובשו בהתזה ללא מניטול הראו את גודל החלקיקים הממוצע הקטן ביותר ואת העומס הגבוה ביותר לאחר השחזור. התנהגויות השחרור של כל הננו-חלקיקים המיובשים הללו הראו שהם שוחררו במהירות בתמיסות של pH = 2.5 ו-pH = 7, ויציבים מאוד בתמיסה של pH = 6.5. בהשוואה לננו-חלקיקים מיובשים אחרים שהומסו מחדש, הננו-חלקיקים... ייבוש בהתזה ללא מניטול הראה את השחרור המהיר ביותר. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם זו שנצפתה במבחן הספיגה התאית, שכן ננו-חלקיקי אינסולין מיובשים בהתזה בהיעדר מניטול שמרו כמעט לחלוטין על יעילות הספיגה התאית של ננו-חלקיקי אינסולין טריים שהוכנו. תוצאות אלו מצביעות על כך שננו-חלקיקי אינסולין יבשים שהוכנו על ידי ייבוש בהתזה ללא מניטול מתאימים ביותר לעיבוד נוסף לצורות מינון אחרות ללא מים, כגון טבליות דרך הפה או סרטים ביו-דבקיים.
עקב בעיות קניין רוחני, מערכי הנתונים שנוצרו ו/או נותחו במהלך המחקר הנוכחי אינם זמינים לציבור, אך זמינים מהמחברים הרלוונטיים על פי בקשה סבירה.
קגן, א. סוכרת מסוג 2: מקורות חברתיים ומדעיים, סיבוכים רפואיים והשלכות על חולים ואחרים (מקפרלן, 2009).
סינג, AP, גואו, י., סינג, א., שיה, וו. וג'יאנג, פ. פיתוח אנקפסולציה של אינסולין: האם מתן פומי אפשרי כעת? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
וונג, סי.איי., אל-סלאמי, ה. ודאס, סי.אר. התקדמות אחרונה במערכות להובלת ליפוזומים דרך הפה עמוסות באינסולין לטיפול בסוכרת. פרשנות. ג'יי. פארמה. 549, 201–217 (2018).