תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים תמכה ב-CSS באופן מוגבל. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אנו ממליצים להשתמש בגרסה חדשה יותר של הדפדפן שלכם (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אנו מציגים את האתר ללא עיצוב או JavaScript.
חומצה פרופיונית (PPA) משמשת לחקר תפקידה של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בהפרעות נוירו-התפתחותיות כמו הפרעת הספקטרום האוטיסטי. ידוע כי PPA משבש את הביוגנזה, המטבוליזם והתחלופה המיטוכונדריאלית. עם זאת, השפעות ה-PPA על הדינמיקה, הביקוע והאיחוי המיטוכונדריאלי נותרות בעייתיות עקב האופי הזמני המורכב של מנגנונים אלה. כאן, אנו משתמשים בטכניקות הדמיה כמותיות משלימות כדי לחקור כיצד PPA משפיע על האולטרה-מבנה, המורפולוגיה והדינמיקה המיטוכונדריאלית בתאי SH-SY5Y דמויי נוירונים. PPA (5 mM) גרם לירידה משמעותית בשטח המיטוכונדריה (p < 0.01), בקוטר והיקף החמוס (p < 0.05) ובשטח 2 (p < 0.01). ניתוח איתור אירועים מיטוכונדריאלי הראה עלייה משמעותית (p < 0.05) באירועי ביקוע והאיחוי, ובכך שומר על שלמות הרשת המיטוכונדריאלית בתנאי עקה. בנוסף, ביטוי ה-mRNA של cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) ו-OPA1 (p < 0.05) ירד משמעותית. 01). ממצא זה ממחיש את עיצוב מחדש של המורפולוגיה, הביוגנזה והדינמיקה המיטוכונדריאלית כדי לשמור על תפקוד בתנאי עקה. הנתונים שלנו מספקים תובנות חדשות לגבי השפעות ה-PPA על הדינמיקה המיטוכונדריאלית ומדגישים את התועלת של טכניקות הדמיה לחקר המנגנונים הרגולטוריים המורכבים המעורבים בתגובות עקה מיטוכונדריאליות.
מיטוכונדריה משתתפת באופן בלתי נפרד במגוון תפקודים תאיים מעבר לתפקידיהן הטיפוסיים בייצור אנרגיה וביוסינתזה. מטבוליזם מיטוכונדריאלי הוא מווסת מרכזי של איתות סידן, הומאוסטזיס מטבולי וחיזור-חמצון, איתות דלקתי, שינויים אפיגנטיים, התפשטות תאים, התמיינות ומוות תאי מתוכנת1. בפרט, מטבוליזם מיטוכונדריאלי הוא קריטי להתפתחות, הישרדות ותפקוד נוירונים והוא מעורב באופן נרחב בביטויים שונים של נוירופתולוגיה2,3,4.
במהלך העשור האחרון, מצב מטבולי התפתח כווסת מרכזי של נוירוגנזה, התמיינות, התבגרות ופלסטיות 5,6. לאחרונה, מורפולוגיה ודינמיקה מיטוכונדריאלית הפכו למרכיבים חשובים במיוחד של מיטוזה, תהליך דינמי השומר על מאגר של מיטוכונדריה בריאות בתוך תאים. הדינמיקה המיטוכונדריאלית מווסתת על ידי מסלולים מורכבים תלויים זה בזה, החל מביוגנזה וביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית ועד ביקוע, איחוי, הובלה וסילוק מיטוכונדריאלי 7,8. שיבוש של כל אחד מהמנגנונים האינטגרטיביים הללו פוגע בתחזוקת רשתות מיטוכונדריאליות בריאות ויש לו השלכות תפקודיות עמוקות על התפתחות עצבית 9,10. ואכן, חוסר ויסות של הדינמיקה המיטוכונדריאלית נצפה בהפרעות פסיכיאטריות, ניווניות והתפתחותיות עצבית רבות, כולל הפרעות בספקטרום האוטיסטי (ASD) 11,12.
ASD היא הפרעה נוירו-התפתחותית הטרוגנית בעלת ארכיטקטורה גנטית ואפיגנטית מורכבת. התורשתיות של ASD אינה שנויה במחלוקת, אך האטיולוגיה המולקולרית הבסיסית נותרה אינה מובנת היטב. צבירת נתונים ממודלים פרה-קליניים, מחקרים קליניים ומערכי נתונים מולקולריים מרובי-אומיקס מספקת ראיות הולכות וגדלות לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה ב-ASD13,14. בעבר ביצענו בדיקת מתילציה של DNA כלל-גנומית בקבוצת חולים עם ASD וזיהינו גנים מתילציה דיפרנציאלית המקובצים לאורך מסלולים מטבוליים מיטוכונדריאליים15. לאחר מכן דיווחנו על מתילציה דיפרנציאלית של ווסתים מרכזיים של ביוגנזה ודינמיקה מיטוכונדריאלית, אשר נקשרה לעלייה במספר עותקי mtDNA ולשינוי בפרופיל מטבולי בדרכי השתן ב-ASD16. הנתונים שלנו מספקים ראיות הולכות וגדלות לכך שדינמיקה מיטוכונדריאלית והומאוסטזיס ממלאות תפקיד מרכזי בפתופיזיולוגיה של ASD. לכן, שיפור ההבנה המכניסטית של הקשר בין דינמיקה, מורפולוגיה ותפקוד מיטוכונדריאליים הוא מטרה מרכזית של מחקר מתמשך על מחלות נוירולוגיות המאופיינות בתפקוד לקוי של מיטוכונדריאליה משנית.
טכניקות מולקולריות משמשות לעתים קרובות לחקר תפקידם של גנים ספציפיים בתגובות עקה מיטוכונדריאליות. עם זאת, גישה זו עשויה להיות מוגבלת על ידי האופי הרב-גוני והזמני של מנגנוני בקרה מיטוטיים. יתר על כן, ביטוי דיפרנציאלי של גנים מיטוכונדריאליים הוא אינדיקטור עקיף לשינויים תפקודיים, במיוחד מכיוון שרק מספר מוגבל של גנים מנותחים בדרך כלל. לכן, הוצעו שיטות ישירות יותר לחקר תפקוד המיטוכונדריה וביו-אנרגטיקה. מורפולוגיה מיטוכונדריאלית קשורה קשר הדוק לדינמיקה המיטוכונדריאלית. צורת המיטוכונדריה, קישוריות ומבנה הם קריטיים לייצור אנרגיה ולהישרדות המיטוכונדריה והתאים. יתר על כן, המרכיבים השונים של מיטוזה מתמקדים בשינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית, אשר עשויים לשמש כנקודות קצה שימושיות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה ולספק בסיס למחקרים מכניסטיים עוקבים.
ניתן לצפות ישירות במורפולוגיה מיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM), המאפשר מחקר מפורט של האולטרה-מבנה התאי. TEM מדמיין ישירות את המורפולוגיה, הצורה והמבנה של קריסטות מיטוכונדריה ברזולוציה של מיטוכונדריה בודדת, במקום להסתמך אך ורק על שעתוק גנים, ביטוי חלבונים או פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים באוכלוסיות תאים 17,19,20. בנוסף, TEM מאפשר מחקר של אינטראקציות בין מיטוכונדריה לאברונים אחרים, כגון הרשתית האנדופלזמית ואוטופגוזומים, אשר ממלאים תפקידים מרכזיים בתפקוד המיטוכונדריאלי ובהומאוסטזיס 21,22. לפיכך, זה הופך את TEM לנקודת התחלה טובה לחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה לפני התמקדות במסלולים או גנים ספציפיים. ככל שתפקוד המיטוכונדריה הופך רלוונטי יותר ויותר לנוירופתולוגיה, קיים צורך ברור להיות מסוגלים לחקור באופן ישיר וכמותי את המורפולוגיה והדינמיקה המיטוכונדרית במודלים נוירונים חוץ גופיים חוץ גופיים.
במאמר זה, אנו בוחנים את הדינמיקה המיטוכונדריאלית במודל עצבי של תפקוד לקוי מיטוכונדריאלי בהפרעת ספקטרום האוטיסטי. בעבר דיווחנו על מתילציה דיפרנציאלית של פרופיוניל-CoA קרבוקסילאז בטא (PCCB) ב-ASD15, תת-יחידה של האנזים המיטוכונדריאלי פרופיוניל-CoA קרבוקסילאז PCC. דיסרגולציה של PCC ידועה כגורמת להצטברות רעילה של נגזרות פרופיוניל, כולל חומצה פרופיונית (PPA)23,24,25. הוכח כי PPA משבש את חילוף החומרים העצבי ומשנה התנהגות in vivo והוא מודל בעלי חיים מבוסס לחקר מנגנונים נוירו-התפתחותיים המעורבים ב-ASD26,27,28. בנוסף, דווח כי PPA משבש את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי, ביוגנזה ונשימה in vitro והוא שימש באופן נרחב למידול תפקוד לקוי מיטוכונדריאלי בנוירונים29,30. עם זאת, ההשפעה של תפקוד לקוי מיטוכונדריאלי המושרה על ידי PPA על המורפולוגיה והדינמיקה המיטוכונדריאלית נותרה מובנת היטב.
מחקר זה משתמש בטכניקות הדמיה משלימות כדי לכמת את השפעות ה-PPA על המורפולוגיה, הדינמיקה והתפקוד המיטוכונדריאליים בתאי SH-SY5Y. ראשית, פיתחנו שיטת TEM כדי להמחיש שינויים במורפולוגיה ובמבנה העל-תאי המיטוכונדריאלי17,31,32. בהתחשב באופי הדינמי של המיטוכונדריה33, השתמשנו גם בניתוח לוקליזטור אירועים מיטוכונדריאלי (MEL) כדי לכמת שינויים באיזון בין אירועי ביקוע ואיחוי, מספר המיטוכונדריה ונפחה תחת עקת PPA. לבסוף, בדקנו האם המורפולוגיה והדינמיקה המיטוכונדריאלית קשורות לשינויים בביטוי גנים המעורבים בביוגנזה, ביקוע ואיחוי. יחד, הנתונים שלנו ממחישים את האתגר של הבהרת מורכבות המנגנונים המווסתים את הדינמיקה המיטוכונדריאלית. אנו מדגישים את התועלת של TEM בחקר המורפולוגיה המיטוכונדריאלית כנקודת סיום מתכנסת מדידה של מיטוזה בתאי SH-SY5Y. בנוסף, אנו מדגישים שנתוני TEM מספקים את המידע העשיר ביותר בשילוב עם טכניקות הדמיה שלוכדות גם אירועים דינמיים בתגובה לעקה מטבולי. אפיון נוסף של מנגנוני הרגולציה המולקולריים התומכים במיטוזה של תאים עצביים עשוי לספק תובנה חשובה לגבי המרכיב המיטוכונדריאלי של מערכת העצבים ומחלות ניווניות של מערכת העצבים.
כדי לגרום ללחץ מיטוכונדריאלי, תאי SH-SY5Y טופלו ב-PPA תוך שימוש ב-3 mM ו-5 mM נתרן פרופיונאט (NaP). לפני TEM, הדגימות עברו הכנת דגימה קריוגנית באמצעות הקפאה והקפאה בלחץ גבוה (איור 1a). פיתחנו צינור ניתוח תמונות מיטוכונדריאלי אוטומטי למדידת שמונה פרמטרים מורפולוגיים של אוכלוסיות מיטוכונדריה על פני שלושה חזרות ביולוגיות. מצאנו שטיפול ב-PPA שינה באופן משמעותי ארבעה פרמטרים: שטח 2, שטח, היקף וקוטר ה-Fert (איור 1b-e). שטח 2 ירד באופן משמעותי הן עם טיפול ב-3 mM והן עם טיפול ב-5 mM PPA (p = 0.0183 ו-p = 0.002, בהתאמה) (איור 1b), בעוד ששטח (p = 0.003), היקף (p = 0.0106) וקוטר ה-Fert ירדו באופן משמעותי. הייתה ירידה משמעותית (p = 0.0172) בקבוצת הטיפול ב-5 mM בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 1c-e). הפחתות משמעותיות בשטח ובהיקף הראו כי לתאים שטופלו ב-5 mM PPA היו מיטוכונדריה קטנה ומעוגלת יותר, וכי מיטוכונדריה זו הייתה פחות מוארכת מאשר בתאי הביקורת. ממצא זה עולה בקנה אחד גם עם ירידה משמעותית בקוטר Feret, פרמטר בלתי תלוי המצביע על ירידה במרחק הגדול ביותר בין קצוות החלקיקים. נצפו שינויים במבנה העל-תאי של הקריסטות: הקריסטות הפכו פחות בולטות תחת השפעת עקת PPA (איור 1a, פאנל B). עם זאת, לא כל התמונות שיקפו בבירור את המבנה העל-תאי של הקריסטות, ולכן לא בוצע ניתוח כמותי של שינויים אלה. נתוני TEM אלה עשויים לשקף שלושה תרחישים אפשריים: (1) PPA מגביר את הביקוע או מעכב את האיחוי, מה שגורם למיטוכונדריה הקיימת להתכווץ בגודלה; (2) ביוגנזה משופרת יוצרת מיטוכונדריה חדשה וקטנה יותר או (3) משרה את שני המנגנונים בו זמנית. למרות שלא ניתן להבחין בתנאים אלה באמצעות TEM, שינויים מורפולוגיים משמעותיים מצביעים על שינויים בהומאוסטזיס ובדינמיקה המיטוכונדרית תחת עקת PPA. לאחר מכן חקרנו פרמטרים נוספים כדי לאפיין עוד יותר דינמיקה זו ואת המנגנונים הפוטנציאליים העומדים בבסיסה.
חומצה פרופיונית (PPA) משנה את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית. (א) תמונות מייצגות של מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) המראות שגודל המיטוכונדריה יורד והמיטוכונדריה הופכת קטנה ומעוגלת יותר עם עלייה בטיפול PPA; 0 mM (לא מטופל), 3 mM ו-5 mM, בהתאמה. חצים אדומים מצביעים על מיטוכונדריה. (ב-ה) תאי SH-SY5Y שטופלו ב-PPA במשך 24 שעות הוכנו ל-TEM והתוצאות נותחו באמצעות Fiji/ImageJ. ארבעה מתוך שמונה הפרמטרים הראו הבדלים משמעותיים בין תאי בקרה (לא מטופלים, 0 mM PPA) לתאי טיפול (3 mM ו-5 mM PPA). (ב) אזור 2, (ג) שטח, (ד) היקף, (ה) קוטר חמוס. ניתוח שונות חד-כיווני (בקרה לעומת טיפול) ומבחן ההשוואה המרובה של דנט שימשו לקביעת הבדלים משמעותיים (p < 0.05). נקודות נתונים מייצגות את הערך המיטוכונדריאלי הממוצע עבור כל תא בודד, וסרגלי שגיאה מייצגים את הממוצע ± SEM. הנתונים המוצגים מייצגים n = 3, לפחות 24 תאים לכל שכפול; סך של 266 תמונות נותחו; * מציין p < 0.05, ** מציין p < 0.01.
כדי לאפיין עוד כיצד הדינמיקה המיטוכונדריאלית מגיבה ל-PPA, צבענו את המיטוכונדריה בטטרמתילרודאמין אתיל אסטר (TMRE) והשתמשנו במיקרוסקופיית זמן-התאמות וניתוח MEL כדי לאתר ולכמת את המיטוכונדריה לאחר 24 שעות ב-3 ו-5 mM PPA. טיפול באירועי ביקוע ואיחוי. (איור 2א'). לאחר ניתוח MEL, המיטוכונדריה נותחה עוד כדי לכמת את מספר מבני המיטוכונדריה ואת הנפח הממוצע שלהם. צפינו בעלייה קטנה אך משמעותית במספר אירועי הביקוע המתרחשים ב-3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] בהשוואה לביקוע [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] ואיחוי [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] ואירועי איחוי [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] <0.05)] עלו משמעותית ב-5 mM בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 3ב'). מספר המיטוכונדריה גדל משמעותית הן ב-3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] והן ב-5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (איור 3c), בעוד שהנפח הממוצע של כל מבנה מיטוכונדריאלי נותר ללא שינוי (איור 3c). 3d). יחד, ממצאים אלה מצביעים על כך ששיפוץ הדינמיקה המיטוכונדריאלית משמש כתגובה פיצוי ששומרת בהצלחה על שלמות הרשת המיטוכונדריאלית. העלייה במספר אירועי הביקוע ב-3 mM PPA מצביעה על כך שהעלייה במספר המיטוכונדריה נובעת בחלקה מביקוע מיטוכונדריאלי, אך בהינתן שנפח המיטוכונדריה הממוצע נותר ללא שינוי מהותי, לא ניתן לשלול ביוגנזה כתגובה פיצוי נוספת. עם זאת, נתונים אלה עולים בקנה אחד עם המבנים המיטוכונדריאליים הקטנים והעגולים שנצפו על ידי TEM וגם מדגימים שינויים משמעותיים בדינמיקה המיטוכונדריאלית הנגרמים על ידי PPA.
חומצה פרופיונית (PPA) גורמת לעיצוב מחדש דינמי של המיטוכונדריה כדי לשמור על שלמות הרשת. תאי SH-SY5Y גודלו, טופלו ב-3 ו-5 mM PPA למשך 24 שעות ונצבעו ב-TMRE ו-Hoechst 33342 ולאחר מכן עברו ניתוח MEL. (א) תמונות מיקרוסקופיה מייצגות של זמן-התזמון המתארות צבע והשלכות בינאריות של עוצמה מקסימלית בזמן 2 (t2) עבור כל תנאי. אזורים נבחרים המצוינים בכל תמונה בינארית משופרים ומוצגים בתלת-ממד בשלוש מסגרות זמן שונות (t1-t3) כדי להמחיש את הדינמיקה לאורך זמן; אירועי היתוך מסומנים בירוק; אירועי ביקוע מסומנים בירוק. מוצג באדום. (ב) מספר ממוצע של אירועים דינמיים לכל תנאי. (ג) מספר ממוצע של מבנים מיטוכונדריאליים לכל תא. (ד) נפח ממוצע (µm3) של כל מבנה מיטוכונדריאלי לכל תא. הנתונים המוצגים מייצגים n = 15 תאים לכל קבוצת טיפול. סרגלי השגיאה המוצגים מייצגים ממוצע ± SEM, סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר, * p < 0.05.
חומצה פרופיונית (PPA) גורמת לדיכוי תעתוק של גנים הקשורים לדינמיקה מיטוכונדריאלית. תאי SH-SY5Y טופלו ב-3 ו-5 mM PPA למשך 24 שעות. כימות גנים יחסי בוצע באמצעות RT-qPCR ונורמל ל-B2M. גנים של ביוגנזה מיטוכונדריאלית (א) cMYC, (ב) TFAM, (ג) NRF1 ו-(ד) NFE2L2. גנים של איחוי וביקוע מיטוכונדריאלי (ה) STOML2, (ו) OPA1, (ז) MFN1, (ח) MFN2 ו-(i) DRP1. הבדלים משמעותיים (p < 0.05) נבדקו באמצעות ANOVA חד-כיווני (ביקורת לעומת טיפול) ומבחן השוואה מרובה של דנט: * מציין p < 0.05, ** מציין p < 0.01, ו-**** מציין p < 0.0001. העמודות מייצגות ביטוי ממוצע ± SEM. הנתונים המוצגים מייצגים n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) ו-n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) שכפולים ביולוגיים.
נתונים מניתוחי TEM ו-MEL יחד מצביעים על כך ש-PPA משנה את המורפולוגיה והדינמיקה המיטוכונדריאלית. עם זאת, טכניקות הדמיה אלו אינן מספקות תובנות לגבי המנגנונים הבסיסיים המניעים תהליכים אלה. לכן, בדקנו את ביטוי ה-mRNA של תשעה מווסתים מרכזיים של דינמיקה מיטוכונדריאלית, ביוגנזה ומיטוזה בתגובה לטיפול ב-PPA. כימתנו את אונקוגן מיאלומה תאי (cMYC), גורם נשימתי גרעיני (NRF1), גורם שעתוק מיטוכונדריאלי 1 (TFAM), גורם שעתוק דמוי NFE2 BZIP (NFE2L2), חלבון דמוי גסטרין 2 (STOML2), ניוון עצב הראייה 1 (OPA1), מיטופוסין 1 (MFN1), מיטופוסין 2 (MFN2) וחלבון קשור לדינמין 1 (DRP1) לאחר 24 שעות של טיפול עם 3 mM ו-5 mM PPA. צפינו בטיפול ב-PPA ב-3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 ו-p < 0.0001, בהתאמה) וב-5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001). (איור 3a-c). הירידה בביטוי mRNA הייתה תלוית מינון: הביטוי של cMYC, NRF1 ו-TFAM ירד פי 5.7, 2.6 ו-1.9 ב-3 mM, בהתאמה, ופי 11.2, 3 ו-2.2 ב-5 mM. לעומת זאת, גן הביוגנזה המרכזי NFE2L2 לא השתנה באף ריכוז של PPA, למרות שנצפה מגמה דומה תלוית מינון של ירידה בביטוי (איור 3d).
בדקנו גם את הביטוי של גנים קלאסיים המעורבים בוויסות ביקוע ואיחוי. STOML2 נחשב כמעורב באיחוי, מיטופגיה וביוגנזה, וביטויו הופחת משמעותית (p < 0.0001) ב-3 mM (שינוי פי 2.4) ו-5 mM (שינוי פי 2.8) PPA (איור 1). 3d). באופן דומה, ביטוי גן האיחוי OPA1 ירד ב-3 mM (שינוי פי 1.6) ו-5 mM (שינוי פי 1.9) PPA (p = 0.006 ו-p = 0.0024, בהתאמה) (איור 3f). עם זאת, לא מצאנו הבדלים משמעותיים בביטוי גני האיחוי MFN1, MFN2 או גן הביקוע DRP1 תחת עקמת PPA של 24 שעות (איור 3g-i). בנוסף, מצאנו שרמותיהם של ארבעה חלבוני איחוי וביקוע (OPA1, MFN1, MFN2 ו-DRP1) לא השתנו באותם תנאים (איור 4א'-ד'). חשוב לציין שנתונים אלה משקפים נקודת זמן אחת וייתכן שאינם משקפים שינויים בביטוי חלבונים או ברמות פעילות במהלך השלבים המוקדמים של עקת PPA. עם זאת, ירידות משמעותיות בביטוי cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 ו-OPA1 מצביעות על הפרעה משמעותית בתעתוק של חילוף החומרים, הביוגנזה והדינמיקה המיטוכונדריאלית. בנוסף, נתונים אלה מדגישים את התועלת של טכניקות הדמיה לחקר ישיר שינויים במצב הקצה בתפקוד המיטוכונדריאלי.
רמות חלבון ההיתוך וגורם הביקוע לא השתנו לאחר טיפול בחומצה פרופיונית (PPA). תאי SH-SY5Y טופלו ב-3 ו-5 mM PPA למשך 24 שעות. רמות החלבון כימתו באמצעות ניתוח Western blot, ורמות הביטוי מנורמלו לחלבון הכולל. מוצגים ביטוי חלבון ממוצע ו-Western blots מייצגים של חלבון המטרה וחלבון הכולל. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. העמודות מייצגות ממוצע ± SEM, והנתונים המוצגים מייצגים n = 3 חזרות ביולוגיות. השוואות מרובות (p < 0.05) בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד כיווני ומבחן דנט. הג'ל והבלוט המקוריים מוצגים באיור S1.
תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למחלות רב-מערכתיות, החל ממחלות מטבוליות, קרדיווסקולריות ומחלות שרירים ועד מחלות נוירולוגיות1,10. מחלות ניווניות וניווניות רבות קשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, דבר המדגיש את חשיבותם של אברונים אלה לאורך כל חיי המוח. מחלות אלה כוללות מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר ו-ASD3,4,18. עם זאת, הגישה לרקמת מוח לחקר מחלות אלה קשה, במיוחד ברמה המכניסטית, מה שהופך מערכות מודל תאיות לחלופה הכרחית. במחקר זה, אנו משתמשים במערכת מודל תאית המשתמשת בתאי SH-SY5Y שטופלו ב-PPA כדי לשחזר את תפקוד התפקוד המיטוכונדריאלי שנצפה במחלות נוירונים, ובמיוחד הפרעות על הספקטרום האוטיסטי. שימוש במודל PPA זה לחקר הדינמיקה המיטוכונדריאלית בנוירונים עשוי לספק תובנות לגבי האטיולוגיה של ASD.
בחנו את האפשרות להשתמש ב-TEM כדי לצפות בשינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית. חשוב לציין כי יש להשתמש ב-TEM בצורה נכונה כדי למקסם את יעילותו. הכנת דגימות קריוגניות מאפשרת שימור טוב יותר של מבנים עצביים על ידי קיבוע בו זמנית של רכיבים תאיים והפחתת היווצרות ארטיפקטים34. בהתאם לכך, צפינו כי לתאי SH-SY5Y דמויי נוירונים היו אברונים תת-תאיים שלמים ומיטוכונדריה מוארכת (איור 1א'). זה מדגיש את התועלת של טכניקות הכנה קריוגניות לחקר מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במודלים של תאים עצביים. למרות שמדידות כמותיות הן קריטיות לניתוח אובייקטיבי של נתוני TEM, עדיין אין הסכמה לגבי אילו פרמטרים ספציפיים יש למדוד כדי לאשר שינויים מורפולוגיים מיטוכונדריאליים. בהתבסס על מספר רב של מחקרים שבחנו כמותית את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית17,31,32, פיתחנו צינור ניתוח תמונות מיטוכונדריאליות אוטומטי המודד שמונה פרמטרים מורפולוגיים, דהיינו: שטח, שטח2, יחס גובה-רוחב, היקף, מעגליות, מעלות, קוטר מפרקים ועגלגלות.
ביניהם, PPA הפחית משמעותית את שטח 2, השטח, ההיקף וקוטר הפרט (איור 1b-e). ממצאים אלה הראו שהמיטוכונדריה הפכה קטנה ומעוגלת יותר, דבר התואם מחקרים קודמים שהראו ירידה בשטח המיטוכונדריה לאחר 72 שעות של עקה מיטוכונדרית המושרה על ידי PPA30. מאפיינים מורפולוגיים אלה עשויים להצביע על ביקוע מיטוכונדריאלי, תהליך הכרחי לפתיחת רכיבים פגומים מרשת המיטוכונדריה כדי לקדם את פירוקם באמצעות מיטופגיה35,36,37. מצד שני, הירידה בגודל המיטוכונדריה הממוצע עשויה להיות קשורה לעלייה בביוגנזה, מה שמביא להיווצרות מיטוכונדריה קטנה ומתהווה. ביקוע או ביוגנזה מוגברים מייצגים תגובה פיצוי לשמירה על מיטוזה כנגד עקה מיטוכונדרית. עם זאת, לא ניתן לשלול ירידה בגדילת המיטוכונדריה, איחוי לקוי או מצבים אחרים.
למרות שהתמונות ברזולוציה גבוהה שנוצרו על ידי TEM מאפשרות קביעת מאפיינים מורפולוגיים ברמת המיטוכונדריה הבודדת, שיטה זו מייצרת תמונות דו-ממדיות בנקודת זמן אחת. כדי לחקור תגובות דינמיות לעקה מטבולי, צבענו את המיטוכונדריה באמצעות TMRE והשתמשנו במיקרוסקופיית זמן-שחיקה עם ניתוח MEL, המאפשרת הדמיה תלת-ממדית בתפוקה גבוהה של שינויים ברשת המיטוכונדריה לאורך זמן33,38. צפינו בשינויים עדינים אך משמעותיים בדינמיקה המיטוכונדריאלית תחת עקה של PPA (איור 2). ב-3 mM, מספר אירועי הביקוע גדל משמעותית, בעוד שאירועי האיחוי נותרו זהים כמו בקבוצת הביקורת. עלייה במספר אירועי הביקוע וההיתוך נצפתה ב-5 mM PPA, אך שינויים אלה היו פרופורציונליים בקירוב, דבר המצביע על כך שקינטיקה של ביקוע והיתוך מגיעה לשיווי משקל בריכוזים גבוהים יותר (איור 2b). נפח המיטוכונדריה הממוצע נותר ללא שינוי הן ב-3 והן ב-5 mM PPA, דבר המצביע על כך ששלמות הרשת המיטוכונדריאלית נשמרה (איור 2d). זה משקף את יכולתן של רשתות מיטוכונדריאליות דינמיות להגיב לעקה מטבולי קלה ולשמור ביעילות על הומאוסטזיס מבלי לגרום לפיצול הרשת. ב-3 mM PPA, העלייה בביקוע מספיקה כדי לקדם את המעבר לשיווי משקל חדש, אך נדרש שיפוץ קינטי עמוק יותר בתגובה ללחץ הנגרם על ידי ריכוזים גבוהים יותר של PPA.
מספר המיטוכונדריה גדל בשני ריכוזי הלחץ של PPA, אך נפח המיטוכונדריה הממוצע לא השתנה באופן משמעותי (איור 2c). ייתכן שזה נובע מעלייה בביוגנזה או עלייה בחלוקה; עם זאת, בהיעדר ירידה משמעותית בנפח המיטוכונדריה הממוצע, סביר יותר שהביוסינתזה עולה. עם זאת, הנתונים באיור 2 תומכים בקיומם של שני מנגנוני פיצוי: עלייה במספר אירועי הביקוע, התואמת את העלייה בביקוע המיטוכונדריאלי, ועלייה במספר האירועים, התואמת את הביוגנזה המיטוכונדרית. בסופו של דבר, פיצוי דינמי על לחץ קל עשוי להיות מורכב מתהליכים בו-זמניים הכוללים ביקוע, איחוי, ביוגנזה ומיטופגיה. למרות שמחברים קודמים הראו ש-PPA משפר את המיטוזה30,39 ואת המיטופגיה29, אנו מספקים ראיות לעיצוב מחדש של דינמיקת הביקוע וההיתוך המיטוכונדריאלי בתגובה ל-PPA. נתונים אלה מאשרים את השינויים המורפולוגיים שנצפו על ידי TEM ומספקים תובנה נוספת לגבי המנגנונים הקשורים לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה המושרה על ידי PPA.
מכיוון שלא ניתוח TEM ולא ניתוח MEL סיפקו ראיות ישירות למנגנוני הרגולציה הגנטיים העומדים בבסיס השינויים המורפולוגיים שנצפו, בדקנו את ביטוי ה-RNA של גנים המעורבים בחילוף החומרים, ביוגנזה ודינמיקה של המיטוכונדריה. הפרוטו-אונקוגן cMYC הוא גורם שעתוק המעורב בוויסות המיטוכונדריה, גליקוליזה, מטבוליזם של חומצות אמינו וחומצות שומן40. בנוסף, ידוע ש-cMYC מווסת את הביטוי של כמעט 600 גנים מיטוכונדריאליים המעורבים בתעתוק, תרגום והרכבה של קומפלקסים מיטוכונדריאליים, כולל NRF1 ו-TFAM41. NRF1 ו-TFAM הם שני מווסתים מרכזיים של מיטוזה, הפועלים במורד הזרם של PGC-1α כדי להפעיל שכפול mtDNA. מסלול זה מופעל על ידי איתות cAMP ו-AMPK והוא רגיש להוצאת אנרגיה וללחץ מטבולי. בדקנו גם את NFE2L2, מווסת חמצון-חיזור של ביוגנזה מיטוכונדריאלית, כדי לקבוע האם השפעות ה-PPA עשויות להיות מתווכות על ידי עקה חמצונית.
למרות שביטוי NFE2L2 נותר ללא שינוי, מצאנו ירידה עקבית תלוית מינון בביטוי cMYC, NRF1 ו-TFAM לאחר 24 שעות של טיפול עם 3 mM ו-5 mM PPA (איור 3a-c). ירידה בביטוי cMYC דווחה בעבר כתגובה לעקה מיטוכונדרית42, ולהפך, ירידה בביטוי cMYC יכולה לגרום לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה על ידי שיפוץ מטבוליזם מיטוכונדריאלי, קישוריות רשת וקיטוב ממברנה43. מעניין לציין, ש-cMYC מעורב גם בוויסות ביקוע ואיחוי מיטוכונדריאלי42,43 וידוע כמגביר את זרחון DRP1 ואת לוקליזציה המיטוכונדרית במהלך חלוקת התא44, כמו גם מתווך שיפוץ מורפולוגי מיטוכונדריאלי בתאי גזע עצביים45. ואכן, פיברובלסטים חסרי cMYC מציגים גודל מיטוכונדריאלי מופחת, התואם את השינויים הנגרמים על ידי עקה של PPA43. נתונים אלה ממחישים קשר מעניין אך עדיין לא ברור בין cMYC לדינמיקה מיטוכונדריאלית, ומספקים מטרה מעניינת למחקרים עתידיים של שיפוץ מושרה על ידי עקה של PPA.
הירידה ב-NRF1 וב-TFAM עולה בקנה אחד עם תפקידו של cMYC כגורם מפעיל שעתוק חשוב. נתונים אלה עולים בקנה אחד גם עם מחקרים קודמים בתאי סרטן המעי הגס האנושיים שהראו כי PPA הפחית את ביטוי ה-mRNA של NRF1 לאחר 22 שעות, דבר שהיה קשור לדלדול ATP והגברת ROS46. מחברים אלה דיווחו גם כי ביטוי TFAM גדל לאחר 8.5 שעות אך חזר לרמות הבסיס לאחר 22 שעות. לעומת זאת, קים ועמיתיו (2019) הראו כי ביטוי ה-mRNA של TFAM ירד משמעותית לאחר 4 שעות של עקת PPA בתאי SH-SY5Y; עם זאת, לאחר 72 שעות, ביטוי חלבון TFAM גדל משמעותית ומספר עותקי ה-mtDNA גדל משמעותית. לפיכך, הירידה במספר גני הביוגנזה המיטוכונדריאליים שראינו לאחר 24 שעות אינה שוללת את האפשרות שהעלייה במספר המיטוכונדריה קשורה להפעלת ביוגנזה בנקודות זמן מוקדמות יותר. מחקרים קודמים הראו כי PPA מעלה באופן משמעותי את ה-mRNA וחלבון של PGC-1α בתאי SH-SY5Y לאחר 4 שעות ו-30 דקות, בעוד שחומצה פרופיונית משפרת את הביוגנזה המיטוכונדריאלית בתאי כבד של עגלים באמצעות PGC-1α לאחר 12 שעות ו-39 דקות. מעניין לציין, ש-PGC-1α אינו רק מווסת תעתוק ישיר של NRF1 ו-TFAM, אלא גם הוכח כמווסת את הפעילות של MFN2 ו-DRP1 על ידי ויסות ביקוע ואיחוי 47. יחד, ממצאים אלה מדגישים את הצימוד ההדוק של מנגנונים המווסתים תגובות פיצוי מיטוכונדריאליות הנגרמות על ידי PPA. יתר על כן, הנתונים שלנו משקפים חוסר ויסות משמעותי של ויסות תעתוק של ביוגנזה וחילוף חומרים תחת עקת PPA.
הגנים STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ו-DRP1 נמנים עם הרגולטורים המרכזיים של ביקוע, איחוי ודינמיקה מיטוכונדריאלית37,48,49. ישנם גנים רבים אחרים המעורבים בדינמיקה המיטוכונדריאלית, אולם נמצא כי STOML2, OPA1 ו-MFN2 מתילצים באופן דיפרנציאלי בקבוצות ASD,16 ומספר מחקרים בלתי תלויים דיווחו על שינויים בגורמי שעתוק אלה בתגובה לעקה מיטוכונדריאלית50,51.52. הביטוי של OPA1 ו-STOML2 הופחת משמעותית על ידי טיפול ב-PPA של 3 mM ו-5 mM (איור 3e, f). OPA1 הוא אחד הרגולטורים הקלאסיים של איחוי מיטוכונדריאלי באמצעות אינטראקציה ישירה עם MFN1 ו-2 והוא ממלא תפקיד בעיצוב מחדש של קריסטה ובמורפולוגיה מיטוכונדריאלית53. התפקיד המדויק של STOML2 בדינמיקה המיטוכונדריאלית נותר לא ברור, אך ראיות מצביעות על כך שהוא ממלא תפקיד באיחוי מיטוכונדריאלי, ביוגנזה ומיטופגיה.
STOML2 מעורב בשמירה על צימוד נשימתי מיטוכונדריאלי ויצירת קומפלקסים של שרשרת נשימה54,55 והוכח כמשנה באופן עמוק את המאפיינים המטבוליים של תאי סרטן56. מחקרים הראו ש-STOML2 מקדם את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי ואת היווצרותה ביוגנזה באמצעות אינטראקציה עם BAN וקרדיוליפין55, 57, 58. בנוסף, מחקרים עצמאיים הראו כי האינטראקציה בין STOML2 ל-PINK1 מווסתת את המיטופגיה59,60. ראוי לציין כי דווח כי STOML2 מקיים אינטראקציה ישירה עם MFN2 ומייצב אותו, וגם ממלא תפקיד חשוב בייצוב איזופורמים ארוכים של OPA1 על ידי עיכוב הפרוטאז האחראי לפירוק OPA153,61,62. הירידה בביטוי STOML2 שנצפתה בתגובות PPA עשויה להפוך את חלבוני ההיתוך הללו לרגישים יותר לפירוק דרך מסלולים תלויי יוביקוויטין ופרוטאזום48. למרות שהתפקיד המדויק של STOML2 ו-OPA1 בתגובה הדינמית ל-PPA אינו ברור, ירידה בביטוי של גנים אלו של היתוך (איור 3) עלולה לשבש את האיזון בין ביקוע להיתוך ולהוביל לירידה בגודל המיטוכונדריה (איור 3).
מצד שני, ביטוי חלבון OPA1 נותר ללא שינוי לאחר 24 שעות, בעוד שרמות ה-mRNA והחלבון של MFN1, MFN2 או DRP1 לא השתנו באופן משמעותי לאחר טיפול ב-PPA (איור 3g-i, איור 4). דבר זה עשוי להצביע על כך שאין שינויים בוויסות גורמים אלה המעורבים באיחוי ובביקוע המיטוכונדריאלי. עם זאת, ראוי לציין שכל אחד מארבעת הגנים הללו מווסת גם על ידי מודיפיקציות פוסט-תעתוק (PTMs) השולטות בפעילות החלבון. ל-OPA1 שמונה וריאנטים חלופיים של שחבור אשר נחתכים באופן פרוטאוליטי במיטוכונדריה ליצירת שני איזופורמים נפרדים 63. האיזון בין איזופורמים ארוכים וקצרים קובע בסופו של דבר את תפקידו של OPA1 באיחוי המיטוכונדריאלי ובתחזוקת רשת המיטוכונדריה 64. פעילות DRP1 מווסתת על ידי זרחון של סידן/קלמודולין-חלבון קינאז II (CaMKII), בעוד שפירוק DRP1 מווסת על ידי יוביקוויטינציה ו-SUMOylation 65. לבסוף, גם DRP1 וגם MFN1/2 הם GTPases, כך שהפעילות עשויה להיות מושפעת מקצב ייצור ה-GTP במיטוכונדריה 66. לכן, למרות שהביטוי של חלבונים אלה נשאר קבוע, ייתכן שזה לא משקף פעילות חלבון או לוקליזציה לא השתנו 67,68. ואכן, רפרטוארים קיימים של חלבוני PTM משמשים לעתים קרובות כקו ההגנה הראשון האחראי על תיווך תגובות עקה חריפות. בנוכחות עקה מטבולי מתונה במודל שלנו, סביר להניח ש-PTM מקדם פעילות מוגברת של חלבוני איחוי וביקוע כדי לשקם מספיק את שלמות המיטוכונדריה מבלי לדרוש הפעלה נוספת של גנים אלה ברמת mRNA או החלבון.
לסיכום, הנתונים הנ"ל מדגישים את הרגולציה המורכבת והתלוית-זמן של המורפולוגיה המיטוכונדריאלית ואת האתגרים הכרוכים בפענוח מנגנונים אלה. כדי לחקור ביטוי גנים, יש צורך תחילה לזהות גנים ספציפיים של מטרה במסלול. עם זאת, הנתונים שלנו מראים שגנים באותו מסלול אינם מגיבים באותו אופן לאותו לחץ. למעשה, מחקרים קודמים הראו שגנים שונים באותו מסלול עשויים להציג פרופילי תגובה זמניים שונים30,46. בנוסף, ישנם מנגנונים פוסט-תעתוק מורכבים המשבשים את הקשר בין תעתוק לתפקוד גנים. מחקרי פרוטאומיה יכולים לספק תובנות לגבי ההשפעה של PTMs ותפקוד חלבונים, אך הם גם מציבים אתגרים, כולל שיטות תפוקה נמוכה, יחסי אות לרעש גבוהים ורזולוציה ירודה.
בהקשר זה, לחקר המורפולוגיה המיטוכונדריאלית באמצעות TEM ו-MEL יש פוטנציאל גדול לענות על שאלות יסוד בנוגע לקשר בין דינמיקה ותפקוד מיטוכונדריאלית וכיצד הדבר משפיע על המחלה. חשוב מכל, TEM מספק שיטה ישירה למדידת המורפולוגיה המיטוכונדריאלית כנקודת קצה מתכנסת של תפקוד לקוי ודינמיקה מיטוכונדריאלית 51. MEL מספק גם שיטה ישירה להמחשת אירועי ביקוע ואיחוי בסביבה תאית תלת-ממדית, מה שמאפשר כימות של שיפוץ מיטוכונדריאלי דינמי גם בהיעדר שינויים בביטוי גנים 33. כאן אנו מדגישים את התועלת של טכניקות הדמיה מיטוכונדריאליות במחלות מיטוכונדריאליות משניות. מחלות אלו מאופיינות בדרך כלל בלחץ מטבולי כרוני קל המאופיין בשיפוץ עדין של רשתות מיטוכונדריאליות ולא בנזק מיטוכונדריאלי חריף. עם זאת, לפיצוי המיטוכונדריאלי הנדרש לשמירה על מיטוזה תחת לחץ כרוני יש השלכות תפקודיות עמוקות. בהקשר של מדעי המוח, הבנה טובה יותר של מנגנוני פיצוי אלה עשויה לספק מידע חשוב על הנוירופתולוגיה הפליאוטרפית הקשורה לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
בסופו של דבר, הנתונים שלנו מדגישים את התועלת של טכניקות הדמיה להבנת ההשלכות התפקודיות של האינטראקציות המורכבות בין ביטוי גנים, שינויים בחלבונים ופעילות חלבונים השולטים בדינמיקה המיטוכונדריאלית העצבית. השתמשנו ב-PPA כדי לדמות תפקוד לקוי של המיטוכונדריה במודל תאים עצביים כדי לקבל תובנות לגבי המרכיב המיטוכונדריאלי של ASD. תאי SH-SY5Y שטופלו ב-PPA הראו שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית: המיטוכונדריה הפכה קטנה ועגולה, וקריסטאות היו מוגדרות בצורה גרועה כאשר נצפו על ידי TEM. ניתוח MEL מראה כי שינויים אלה מתרחשים במקביל לעלייה באירועי ביקוע ואיחוי כדי לשמור על רשת המיטוכונדריה בתגובה לעקה מטבולית קלה. יתר על כן, PPA משבש באופן משמעותי את הרגולציה התעתוקית של חילוף החומרים וההומאוסטזיס המיטוכונדריאלי. זיהינו cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 ו-OPA1 כווסתים מיטוכונדריאליים מרכזיים המופרעים על ידי עקת PPA ועשויים למלא תפקיד בתיווך שינויים הנגרמים על ידי PPA במורפולוגיה ובתפקוד המיטוכונדריאלי. יש צורך במחקרים עתידיים כדי לאפיין טוב יותר שינויים זמניים הנגרמים על ידי PPA בביטוי גנים ופעילות חלבונים, לוקליזציה ושינויים פוסט-טרנסלציוניים. הנתונים שלנו מדגישים את המורכבות והתלות ההדדית של מנגנוני הרגולציה המתווכים את תגובת הלחץ המיטוכונדריאלית, ומדגימים את התועלת של TEM וטכניקות הדמיה אחרות למחקרים מכניסטיים ממוקדים יותר.
קו התאים SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) נרכש מסיגמא-אלדריץ'. תאי SH-SY5Y גודלו בתערובת Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 nutrient mixture (DMEM/F-12) ו-L-glutamine (SC09411, ScienCell) בבקבוקים של 25 סמ"ר בתוספת 20% סרום בקר עוברי (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. התאים גודלו בתרבית משנה עד ל-80% צפיפות באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), עברו צנטריפוגה ב-300 גרם וצופו בצפיפות של כ-7 × 105 תאים/מ"ל. כל הניסויים בוצעו על תאי SH-SY5Y לא מובחנים בין המעברים 19-22. PPA ניתן כ-NaP. יש להמיס אבקת NaP (מס' CAS 137-40-6, נוסחה כימית C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) במים חמימים של MilliQ לריכוז של 1 M ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ביום הטיפול, יש לדלל תמיסה זו עם 1 M PPA לריכוז של 3 mM ו-5 mM PPA במדיום נטול סרום (DMEM/F-12 עם L-גלוטמין). ריכוזי הטיפול בכל הניסויים היו ללא PPA (0 mM, ביקורת), 3 mM ו-5 mM PPA. הניסויים בוצעו בשלושה חזרות ביולוגיות לפחות.
תאי SH-SY5Y נזרעו בבקבוקים של 25 סמ"ק בקצב של 5.5 × 105 תאים/מ"ל וגודלו במשך 24 שעות. טיפול ה-PPA נוסף לבקבוק לפני 24 שעות של דגירה. אספו את צלעות התאים לפי פרוטוקולי תת-תרבית רקמות יונקיות רגילים (מתואר לעיל). השעיית מחדש את צלעות התאים ב-100 מיקרוליטר של 2.5% גלוטראלדהיד, 1× PBS ואחסנו ב-4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד. תאי SH-SY5Y עברו צנטריפוגה קצרה כדי ליצור את התאים כצלעות ולהסיר 2.5% גלוטראלדהיד, תמיסת 1× PBS. השעיית מחדש את המשקע בג'ל אגרוז 4% שהוכן במים מזוקקים (היחס בין נפח האגרוז לנפח המשקע הוא 1:1). חתיכות האגרוז הונחו על רשתות על לוחות שטוחים וצופו ב-1-הקסדצן לפני הקפאה בלחץ גבוה. הדגימות הוקפאו באצטון יבש 100% ב-90°C- למשך 24 שעות. לאחר מכן הועלתה הטמפרטורה ל-80°C- והוספה תמיסה של 1% אוסמיום טטרוקסיד ו-0.1% גלוטראלדהיד. הדגימות אוחסנו ב-80°C- למשך 24 שעות. לאחר מכן, הטמפרטורה הועלתה בהדרגה לטמפרטורת החדר במשך מספר ימים: מ-80°C- ל-50°C- למשך 24 שעות, ל-30°C- למשך 24 שעות, ל-10°C- למשך 24 שעות ולבסוף לטמפרטורת החדר.
לאחר הכנה קריוגנית, הדגימות הוספגו בשרף וחתכים דקים במיוחד (כ-100 ננומטר) נוצרו באמצעות אולטרה-מיקרוטום Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). החתכים נצבעו ב-2% אורניל אצטט ועופרת ציטראט. הדגימות נצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (לשעבר FEI), איינדהובן, הולנד) הפועל ב-200 קילו-וולט (משדר Lab6) ומצלמת CCD Gatan (Gatan, בריטניה) המצוידת במסנן אנרגיה Tridiem.
בכל שכפול טכני, נרכשו לפחות 24 תמונות של תאים בודדים, בסך הכל 266 תמונות. כל התמונות נותחו באמצעות מאקרו אזור עניין (ROI) ומקרו מיטוכונדריה. מאקרו המיטוכונדריה מבוסס על שיטות שפורסמו17,31,32 ומאפשר עיבוד אצווה חצי אוטומטי של תמונות TEM ב-Fiji/ImageJ69. בקצרה: התמונה הופכת והפוכה באמצעות חיסור רקע של כדור מתגלגל (רדיוס 60 פיקסלים) ומסנן מעביר פס FFT (תוך שימוש בגבולות עליונים ותחתונים של 60 ו-8 פיקסלים בהתאמה) ודיכוי קווים אנכיים עם סבילות אוריינטציה של 5%. התמונה המעובדת עוברת סף אוטומטי באמצעות אלגוריתם אנטרופיה מקסימלית ונוצרת מסכה בינארית. אזורי תמונה הקשורים ל-ROI שנבחרו ידנית בתמונות TEM גולמיות חולצו, תוך אפיון המיטוכונדריה והוצאת קרום הפלזמה ואזורים אחרים בעלי ניגודיות גבוהה. עבור כל ROI שחולץ, נותחו חלקיקים בינאריים גדולים מ-600 פיקסלים, ונמדדו שטח החלקיקים, ההיקף, הצירים הראשיים והמשניים, קוטר Feret, העגלגלות והמעגליות באמצעות פונקציות המדידה המובנות של Fiji/ImageJ. בהתאם ל-Merrill, Flippo, and Strack (2017), חושבו מנתונים אלה שטח 2, יחס גובה-רוחב של החלקיקים (יחס ציר ראשי לציר משני) וגורם צורה (FF), כאשר FF = היקף 2/4pi x שטח. ניתן למצוא את הגדרת הנוסחה הפרמטרית ב-Merrill, Flippo, and Strack (2017). פקודות המאקרו שהוזכרו זמינות ב-GitHub (ראה הצהרת זמינות נתונים). בממוצע, נותחו כ-5,600 חלקיקים לכל טיפול PPA, בסך הכל כ-17,000 חלקיקים (נתונים לא מוצגים).
תאי SH-SH5Y הונחו בצלחות תרבית בעלות 8 תאים (ThermoFisher, #155411) כדי לאפשר הידבקות למשך הלילה ולאחר מכן הודגרו עם TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) ו-Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). צביעה. תמונות נרכשו באמצעות לייזרים של 405 ננומטר ו-561 ננומטר במשך 10 דקות, ותמונות גולמיות נרכשו כ-z-stacks המכילות 10 מיקרוגרפיות תמונה עם מרווח az של 0.2 מיקרומטר בין פריימים תמונה ב-12 נקודות זמן עוקבות. התמונות נאספו באמצעות פלטפורמת Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 בעלת רזולוציה גבוהה (Carl Zeiss, Oberkochen, גרמניה) תוך שימוש בעדשת LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. תמונות נותחו ב-ImageJ באמצעות צינור שתואר קודם לכן ותוסף ImageJ כדי למדוד אירועי היתוך וביקוע, מספר ממוצע של מבנים מיטוכונדריאליים ונפח מיטוכונדריאלי ממוצע לכל תא . פקודות מאקרו של MEL זמינות ב-GitHub (ראה הצהרת זמינות נתונים).
תאי SH-SY5Y גודלו בצלחות עם שש בארות בצפיפות של 0.3 × 106 תאים/מ"ל במשך 24 שעות לפני הטיפול. RNA חולץ באמצעות פרוטוקול Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) עם שינויים קלים: הוסיפו 300 מיקרוליטר של בופר ליזיס RNA לכל באר לפני ההסרה ועברו ליזיס של כל דגימה כשלב אחרון עם 30 מיקרוליטר של מים נטולי DNase/RNase elution. כל הדגימות נבדקו לכמות ואיכות באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop ND-1000 UV-Vis. כמות החלבון הכוללת מליזטים של תאים הושגה באמצעות 200 מיקרוליטר בופר ליזיס RIPA, וריכוז החלבון נמדד כמותית באמצעות מבחן החלבון של Bradford.
סינתזת cDNA בוצעה באמצעות ערכת הסינתזה של cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) בהתאם להוראות היצרן עם מספר שינויים. cDNA סונתז בתגובות של 20 מיקרוליטר תוך שימוש ב-0.7 עד 1 מיקרוגרם של RNA כולל. הפריימרים נבחרו ממאמרים שפורסמו בעבר 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (טבלה S1) וגששים נלווים עוצבו באמצעות כלי PrimerQuest של Integrated DNA Technologies. כל הגנים המעניינים עברו נרמול לגן הגרעיני B2M. ביטוי הגנים של STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ו-OPA1 נמדד על ידי RT-qPCR. תערובת האב כללה פולימראז LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 מיקרומולר פריימרים קדימה ואחורה, cDNA ומים ברמת PCR כדי להניב נפח סופי של 10 מיקרוליטר לכל תגובה. ביטוי גנים של חלוקה וביקוע (DRP1, MFN1/2) נמדד באמצעות מבחני TaqMan multiplex. תערובת האב Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) שימשה בהתאם להוראות היצרן עם שינויים קלים. תערובת האב המולטיפקס RT-qPCR כוללת פולימראז LUNA Taq 1X, 10 מיקרומולר פריימרים קדימה ואחורה, 10 מיקרומולר גלאי, cDNA ומים ברמת PCR, וכתוצאה מכך נפח סופי של 20 מיקרוליטר לכל תגובה. RT-qPCR בוצע באמצעות Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - מספר סידורי: R0618110). תנאי המחזור מוצגים בטבלה S1. כל דגימות ה-cDNA הוגברו בשלושה עותקים ועקומת תקן נוצרה באמצעות סדרה של דילולים פי עשרה. חריגים בדגימות בשלושה עותקים עם סטיית תקן סף מחזור (Ct) > 0.5 הוסרו מהניתוח כדי להבטיח שחזור נתונים30,72. ביטוי גנים יחסי חושב באמצעות שיטת 2-ΔΔCt79.
דגימות חלבון (60 מיקרוגרם) עורבבו עם בופר טעינה של Laemmli ביחס של 2:1 והועברו על ג'ל חלבון חסר צבע של 12% (Bio-Rad #1610184). החלבונים הועברו לממברנת PVDF (פוליווינילידן פלואוריד) (#170-84156, Bio-Rad) באמצעות מערכת Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). הממברנה נחסמה והודגרה עם הנוגדנים הראשוניים המתאימים (OPA1, MFN1, MFN2 ו-DRP1) (מדוללים 1:1000) למשך 48 שעות, ולאחר מכן הודגרה עם נוגדנים משניים (1:10,000) למשך שעה אחת. לאחר מכן, הממברנות צולמו באמצעות Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) ותועדו באמצעות מערכת Bio-Rad ChemiDoc MP. גרסה 6.1 של ImageLab שימשה לניתוח Western blot. הג'ל והכתם המקוריים מוצגים באיור S1. מידע על נוגדנים מסופק בטבלה S2.
מערכי הנתונים מוצגים כממוצע וסטיית התקן של הממוצע (SEM) של לפחות שלושה מדגמים בלתי תלויים. מערכי הנתונים נבדקו לנורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילקס (אלא אם כן צוין אחרת) לפני הנחת התפלגות גאוסית וסטיית תקן שוות והמשך הניתוחים. בנוסף, ניתוח מערך הנתונים באמצעות פישר MEL LSD (p < 0.05), ANOVA חד-כיווני (ממוצע טיפול לעומת ממוצע ביקורת) ומבחן השוואה מרובה של דאנט לקביעת מובהקות (p < 0.05). ערכי p מובהקים מוצגים בגרף כ-*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. כל הניתוחים הסטטיסטיים והגרפים בוצעו ונוצרו באמצעות GraphPad Prism 9.4.0.
פקודות מאקרו של Fiji/ImageJ לניתוח תמונות TEM זמינות לציבור ב-GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. המאקרו Mitochondrial Event Locator (MEL) זמין לציבור ב-GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
מייליאנה א., דווי נ.מ. וויג'איה א. מיטוכונדריה: מווסתים ראשיים של מטבוליזם, הומאוסטזיס, לחץ, הזדקנות ואפיגנטיקה. אינדונזית. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
בן-שחר, ד. תפקוד לקוי של מיטוכונדריה רב-גונית בסכיזופרניה, קומפלקס I כמטרה פתולוגית אפשרית. סכיזופרניה. משאב. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. and Beal, MF תפקוד לקוי של מיטוכונדריה במחלת פרקינסון. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
שארמה VK, סינג TG ומהטה V. מיטוכונדריה תחת לחץ: מטרות פלישה במחלת אלצהיימר. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF and Ferreira GK מיטוכונדריה והמוח: ביו-אנרגטיקה ועוד. נוירוטוקסינים. resource. 36, 219–238 (2019).
רנגרג'ו, ו. ואחרים. מיטוכונדריה פליאוטרופית: השפעת המיטוכונדריה על התפתחות ומחלות נוירונים. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. and Morais, VA ביוגנזה מיטוכונדריאלית בנוירונים: איך ואיפה. בינלאומיות. J. Mohr. המדע. 22, 13059 (2021).
יו, ר., לנדאהל, א., ניסטר, מ. וז'או, י. ויסות הדינמיקה המיטוכונדריאלית של יונקים: הזדמנויות ואתגרים. חזית. אנדוקרינית. (לוזאן) 11, 374 (2020).
Khacho, M. and Slack, RS דינמיקה מיטוכונדריאלית בוויסות נוירוגנזה: מהמוח המתפתח ועד למוח הבוגר. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).