כתובת נוכחית: קלן 50931, גרמניה, אשכול מצוינות קלן לחקר תגובת לחץ תאית במחלות הקשורות להזדקנות (CECAD).
ניוון עצבי של מחלות מיטוכונדריאליות נחשב בלתי הפיך משום שהפלסטיות המטבולית של נוירונים מוגבלת, אך ההשפעה של תפקוד לקוי מיטוכונדריאלי על האוטונומיה התאית של חילוף החומרים העצבי בגוף אינה מובנת היטב. כאן, אנו מציגים את הפרוטאום הספציפי לתא של נוירוני פורקינג'ה עם מחסור מתקדם ב-OXPHOS הנגרם עקב הפרעה בדינמיקת איחוי מיטוכונדריאלי. מצאנו כי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה עורר שינוי עמוק בתחום הפרוטאומיקס, אשר בסופו של דבר הוביל להפעלה רציפה של תוכניות מטבוליות מדויקות לפני מוות תאי. באופן בלתי צפוי, קבענו את האינדוקציה הברורה של פירובט קרבוקסילאז (PCx) ואנזימי אנטי-אייג'ינג אחרים המשלימים את חומרי הביניים של מחזור TCA. עיכוב PCx החריף את הלחץ החמצוני ואת הניוון העצבי, דבר המצביע על כך שלטרשת עורקים יש השפעה מגנה בנוירונים חסרי OXPHOS. שיקום האיחוי המיטוכונדריאלי בנוירונים מנוונים סופית הופך לחלוטין את המאפיינים המטבוליים הללו, ובכך מונע מוות תאי. הממצאים שלנו מזהים מסלולים שלא היו ידועים בעבר המעניקים חוסן לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה ומראים כי ניתן להפוך את הניוון העצבי גם בשלבים המאוחרים של המחלה.
התפקיד המרכזי של המיטוכונדריה בשמירה על חילוף החומרים האנרגטי של העצבים מודגש על ידי התסמינים הנוירולוגיים הנרחבים הקשורים למחלות מיטוכונדריה אנושיות. רוב המחלות הללו נגרמות על ידי מוטציות גנטיות המווסתות את ביטוי הגנים המיטוכונדריאליים (1, 2) או הרס גנטי הקשור לדינמיקה המיטוכונדריאלית, המשפיעות בעקיפין על יציבות ה-DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA) (3, 4). עבודה במודלים של בעלי חיים הראתה כי בתגובה לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה ברקמות הסובבות, ניתן להפעיל מסלולים מטבוליים שמרניים (5-7), המספקים מידע חשוב להבנה מעמיקה של הפתוגנזה של מחלות מורכבות אלו. בניגוד מוחלט, הבנתנו את השינויים המטבוליים של סוגי תאים ספציפיים הנגרמים כתוצאה מכשל כללי בייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) מיטוכונדריאלי במוח היא בסיסית (8), ומדגישה את הצורך לזהות מטרות טיפוליות בהן ניתן להשתמש כדי למנוע או למנוע מחלות. מניעת ניוון עצבי (9). חוסר המידע נובע מהעובדה שתאי עצב נחשבים באופן נרחב כבעלי גמישות מטבולית מוגבלת מאוד בהשוואה לסוגי התאים של הרקמות הסובבות (10). בהינתן שתאים אלה ממלאים תפקיד מרכזי בתיאום אספקת מטבוליטים לנוירונים כדי לקדם העברה סינפטית ולהגיב למצבי פגיעה ומחלה, היכולת להתאים את חילוף החומרים של התאים לתנאים המאתגרים של רקמת המוח מוגבלת כמעט לתאי גליה (11-14). בנוסף, ההטרוגניות התאית הטבועה ברקמת המוח מעכבת במידה רבה את חקר השינויים המטבוליים המתרחשים בתת-קבוצות נוירונים ספציפיות. כתוצאה מכך, מעט ידוע על ההשלכות התאיות והמטבוליות המדויקות של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בנוירונים.
על מנת להבין את ההשלכות המטבוליות של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, בודדנו נוירוני פורקינג' (PNs) בשלבים שונים של ניוון עצבי הנגרם על ידי הרס של איחוי הממברנה החיצונית המיטוכונדרית (Mfn2). למרות שמוטציות Mfn2 בבני אדם קשורות לצורה של נוירופתיה חושית מוטורית תורשתית המכונה Charcot-Marie-Tooth סוג 2A (15), ההרס המותנה של Mfn2 בעכברים הוא שיטת תפקוד לקוי מוכרת של אינדוקציה של חמצון זרחון (OXPHOS). תת-הסוגים העצביים השונים (16-19) והפנוטיפ הנוירודגנרטיבי שנוצר כתוצאה מכך מלווים בתסמינים נוירולוגיים מתקדמים, כגון הפרעות תנועה (18, 19) או אטקסיה צרבלרית (16). באמצעות שילוב של פרוטאומיקה כמותית ללא תווית (LFQ), מטבולומיקה, הדמיה ושיטות וירולוגיות, אנו מראים כי ניוון עצבי מתקדם גורם חזק לפירובט קרבוקסילאז (PCx) וגורמים אחרים המעורבים בטרשת עורקים של PNs in vivo - ביטוי של אנזימים. כדי לאמת את הרלוונטיות של ממצא זה, הפכנו באופן ספציפי את הביטוי של PCx בנוזלי מוח חסרי Mfn2, ומצאנו שפעולה זו החמירה את הלחץ החמצוני והאיצה את הניוון העצבי, ובכך הוכיחה שאזואספרמיה מקנה מוות תאי, יכולת הסתגלות מטבולית. ביטוי חמור של MFN2 יכול להציל לחלוטין את הניוון הטרמינלי של ננו תאי עם חסר חמור ב-OXPHOS, צריכה מסיבית של DNA מיטוכונדריאלי, ורשת מיטוכונדריאלית לכאורה שבורה, דבר המדגיש עוד יותר שצורה זו של ניוון עצבי יכולה להתאושש אפילו בשלב מתקדם של המחלה לפני מוות תאי.
על מנת להמחיש את המיטוכונדריה בתאי PN מסוג Mfn2, השתמשנו בזן עכברים המאפשר למיטוכונדריה התלויה ב-Cre לכוון לביטוי של חלבון פלואורסצנטי צהוב (mtYFP) (20) של Cre ובדקנו את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית in vivo. מצאנו כי הרס הגן Mfn2 בתאי PN יוביל לחלוקה הדרגתית של הרשת המיטוכונדריאלית (איור S1A), והשינוי המוקדם ביותר נמצא בגיל 3 שבועות. לעומת זאת, הניוון המשמעותי של שכבת תאי PN, כפי שמעידה אובדן צביעת אימונו של קלבינדין, לא החל עד גיל 12 שבועות (איור 1, A ו-B). חוסר ההתאמה בזמן בין השינויים המוקדמים ביותר במורפולוגיה המיטוכונדריאלית לבין הופעת המוות העצבי הנראית לעין הניע אותנו לחקור את השינויים המטבוליים הנגרמים על ידי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה לפני מוות התא. פיתחנו אסטרטגיה מבוססת מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לבודד PN המבטא YFP (YFP+) (איור 1C), ובעכברי ביקורת (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), להלן CTRL (איור S1B). אופטימיזציה של אסטרטגיית ה-gating המבוססת על העוצמה היחסית של אות YFP מאפשרת לנו לטהר את גוף ה-YFP+ (YFPHigh) של PNs מתאי PN שאינם PNs (YFPneg) (איור S1B) או מקטעי אקסון/דנדריטים פלואורסצנטיים משוערים (YFPlow; איור S1D, משמאל), שאושרו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי (איור S1D, ימין). על מנת לאמת את זהות האוכלוסייה המסווגת, ביצענו פרוטאומיקה של LFQ ולאחר מכן ניתוח רכיבים עיקריים, ומצאנו שיש הפרדה ברורה בין תאי YFPHigh לתאי YFPneg (איור S1C). תאי YFPhigh הראו העשרה נטו של סמני PN ידועים (כלומר Calb1, Pcp2, Grid2 ו-Itpr3) (21, 22), אך לא העשרה של חלבונים המתבטאים בדרך כלל בנוירונים או בסוגי תאים אחרים (איור 1D)). השוואה בין דגימות בתאי YFPhigh מסווגים שנאספו בניסויים בלתי תלויים הראתה מקדם מתאם > 0.9, מה שמדגים שחזור טוב בין שכפולים ביולוגיים (איור S1E). לסיכום, נתונים אלה אישרו את התוכנית שלנו לבידוד אקוטי וספציפי של PN אפשרי. מכיוון שמערכת הדרייבר L7-cre שבה נעשה שימוש גורמת לשחזור פסיפס בשבוע הראשון לאחר הלידה (23), התחלנו לבודד עכברים מ-CTRL ולאסוף נוירונים באופן מותנה (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). לאחר השלמת השחזור, הוא נקרא Mfn2cKO בגיל 4 שבועות. כנקודת סיום, בחרנו גיל 8 שבועות, כאשר שכבת ה-PN נותרה שלמה למרות הפרגמנטציה המיטוכונדריאלית הברורה (איור 1B ואיור S1A). בסך הכל, כימתנו סך של 3013 חלבונים, מתוכם כ-22% התבססו על ביאורים של MitoCarta 2.0 המבוססים על הפרוטאום המיטוכונדריאלי כמיטוכונדריה (איור 1E) (איור 1E) (24). ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי שבוצע בשבוע 8 הראה שרק 10.5% מכלל החלבונים עברו שינויים משמעותיים (איור 1F ואיור S1F), מתוכם 195 חלבונים היו מווסתים כלפי מטה ו-120 חלבונים היו מווסתים כלפי מעלה (איור 1F). ראוי לציין ש"ניתוח המסלולים החדשני" של מערך נתונים זה מראה שהגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי שייכים בעיקר לקבוצה מוגבלת של מסלולים מטבוליים ספציפיים (איור 1G). מעניין לציין, שלמרות שהירידה במסלולים הקשורים לאיתות OXPHOS וסידן מאשרת את הגרימת תפקוד לקוי של היפוך מערכת העצבים המרכזית (PNs) חסרי היתוך, קטגוריות אחרות הכוללות בעיקר מטבוליזם של חומצות אמינו מווסתות באופן משמעותי כלפי מעלה, דבר התואם את המטבוליזם המתרחש בתפקוד לקוי של PNs מיטוכונדריאליים. חיווט מחדש עקבי.
(א) תצלומים קונפוקליים מייצגים של חתכים צרבלמיים של עכברי CTRL ו-Mfn2cKO, המראים אובדן הדרגתי של PNs (קלבינדין, אפור); גרעינים נצבעו ב-DAPI. (ב) כימות של (א) (ניתוח שונות חד כיווני, ***P<0.001; n = 4 עד 6 עיגולים משלושה עכברים). (ג) זרימת עבודה ניסיונית. (ד) התפלגות מפת חום של סמנים ספציפיים לפורקינג'ה (למעלה) ולסוגי תאים אחרים (באמצע). (ה) דיאגרמת ון המציגה את מספר החלבונים המיטוכונדריאליים שזוהו ב-PN המסווג. (ו) עלילת געש של חלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בנוירוני Mfn2cKO לאחר 8 שבועות (ערך סף מובהקות של 1.3). (ז) ניתוח מסלול היצירתיות מראה את חמשת מסלולי העלייה (אדום) והירידה (כחול) החשובים ביותר ב-PN של Mfn2cKO המסווג כ-8 שבועות. מוצגת רמת הביטוי הממוצעת של כל חלבון שזוהה. מפת חום בגווני אפור: ערך P מותאם. ns, לא חשוב.
נתוני פרוטאומיקה הראו כי ביטוי החלבון של קומפלקסים I, III ו-IV ירד בהדרגה. קומפלקסים I, III ו-IV הכילו כולם תת-יחידות חיוניות המקודדות על ידי mtDNA, בעוד שקומפלקס II, שהיה מקודד רק בגרעין, כמעט ולא הושפע (איור 2A ואיור S2A). בהתאם לתוצאות הפרוטאומיקה, אימונוהיסטוכימיה של חתכי רקמה צרבלרית הראתה כי רמת תת-היחידה MTCO1 (תת-יחידה 1 של אוקסידאז מיטוכונדריאלי) של קומפלקס IV ב-PN ירדה בהדרגה (איור 2B). תת-היחידה Mtatp8 המקודדת על ידי mtDNA ירדה משמעותית (איור S2A), בעוד שרמת תת-היחידה Mtatp8 המקודדת על ידי mtDNA במצב יציב נותרה ללא שינוי, דבר התואם את תת-הרכבת הקומפלקס F1 של סינתאז ATP יציב הידוע כאשר ביטוי mtDNA יציב. היווצרותה עקבית. פסיקה (7). הערכת רמת ה-mtDNA בנוקלאוטידים המיטוכונדריאליים Mfn2cKO הממוינים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (qPCR) אישרה את הירידה ההדרגתית במספר עותקי ה-mtDNA. בהשוואה לקבוצת הביקורת, בגיל 8 שבועות, רק כ-20% מרמת ה-mtDNA נשמרה (איור 2C). בהתאם לתוצאות אלו, צביעת מיקרוסקופיה קונפוקלית של נוקלאוטידים מיטוכונדריאליים Mfn2cKO שימשה לגילוי DNA, דבר המראה את הצריכה התלויה בזמן של נוקלאוטידים מיטוכונדריאליים (איור 2D). מצאנו שרק חלק מהמועמדים המעורבים בפירוק חלבונים מיטוכונדריאלי ותגובת עקה היו מווסתים כלפי מעלה, כולל Lonp1, Afg3l2 ו-Clpx, וגורמי הרכבה של קומפלקס OXPHOS. לא זוהו שינויים משמעותיים ברמות החלבונים המעורבים באפופטוזיס (איור S2B). באופן דומה, מצאנו כי בערוצי המיטוכונדריה וברשת האנדופלזמית המעורבים בהובלת סידן חלו רק שינויים קלים (איור S2C). בנוסף, הערכה של חלבונים הקשורים לאוטופגיה לא מצאה שינויים משמעותיים, דבר התואם את האינדוקציה הנראית לעין של אוטופגוזומים שנצפתה in vivo על ידי אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים (איור S3). עם זאת, תפקוד לקוי מתקדם של OXPHOS בתאי מוח מלווה בשינויים מיטוכונדריה אולטרה-סטרוקטורליים ברורים. ניתן לראות צבירים מיטוכונדריאליים בגופי התא ובעצים הדנדריטיים של תאי מוח מסוג Mfn2cKO בגילאי 5 ו-8 שבועות, ומבנה הממברנה הפנימי עבר שינויים עמוקים (איור S4, A ו-B). בהתאם לשינויים אולטרה-סטרוקטורליים אלה ולירידה משמעותית ב-mtDNA, ניתוח של פרוסות צרבלריות מוחיות חריפות עם טטרמתילרודמין מתיל אסטר (TMRM) הראה כי פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי בתאי מוח מסוג Mfn2cKO ירד משמעותית (איור S4C).
(א) ניתוח מהלך זמן של רמת הביטוי של קומפלקס OXPHOS. יש להתחשב רק בחלבונים עם P<0.05 לאחר 8 שבועות (ANOVA דו-כיווני). קו מקווקו: ללא התאמה בהשוואה ל-CTRL. (ב) משמאל: דוגמה לחתך צרבלרי המסומן בנוגדן אנטי-MTCO1 (סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר). השטח שתופס גופי תאי פורקינג' מכוסה בצהוב. מימין: כימות רמות MTCO1 (ניתוח שונות חד-כיווני; n = 7 עד 20 תאים שנותחו משלושה עכברים). (ג) ניתוח qPCR של מספר עותקי mtDNA ב-PN הממוין (ניתוח שונות חד-כיווני; n = 3 עד 7 עכברים). (ד) משמאל: דוגמה לחתך צרבלרי המסומן בנוגדן אנטי-DNA (סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר). השטח שתופס גופי תאי פורקינג' מכוסה בצהוב. מימין: כימות נגעים ב-mtDNA (ניתוח שונות חד-כיווני; n = 5 עד 9 תאים משלושה עכברים). (E) דוגמה לחתך מוח קטן חריף המציג תאי mitoYFP + פורקינג'ה (חץ) בהקלטת patch clamp של תא שלם. (F) כימות עקומת IV. (G) הקלטות מייצגות של הזרקת זרם דה-פולריזציה בתאי פורקינג'ה CTRL ו-Mfn2cKO. עקבה עליונה: הפעימה הראשונה שהפעילה AP. עקבה תחתונה: תדירות AP מקסימלית. (H) כימות של קלטים ספונטניים פוסט-סינפטיים (sPSPs). עקבת ההקלטה המייצגת ויחס הזום שלה מוצגים ב-(I). ניתוח שונות חד-כיווני נותח n = 5 עד 20 תאים משלושה עכברים. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) עקבות מייצגות של AP ספונטני שנרשמו באמצעות מצב patch clamp מחורר. עקבה עליונה: תדירות AP מקסימלית. עקבה תחתונה: זום של AP בודד. (K) כימת את תדירות ה-AP הממוצעת והמקסימלית לפי (J). מבחן מאן-ויטני; n = 5 תאים נותחו מארבעה עכברים. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM; אין חשיבות.
נזק ברור ל-OXPHOS זוהה בתאי Mfn2cKO PN בני 8 שבועות, דבר המצביע על כך שהתפקוד הפיזיולוגי של הנוירונים אינו תקין באופן חמור. לכן, ניתחנו את המאפיינים החשמליים הפסיביים של נוירונים חסרי OXPHOS בגיל 4 עד 5 שבועות ו-7 עד 8 שבועות על ידי ביצוע רישומי clamp של תאים שלמים בפרוסות צרבלריות חריפות (איור 2E). באופן בלתי צפוי, פוטנציאל הממברנה הממוצע במנוחה והתנגדות הקלט של נוירוני Mfn2cKO היו דומים לקבוצת הביקורת, אם כי היו הבדלים דקים בין התאים (טבלה 1). באופן דומה, בגיל 4 עד 5 שבועות לא נמצאו שינויים משמעותיים ביחסי זרם-מתח (עקומת IV) (איור 2F). עם זאת, אף נוירון Mfn2cKO בני 7 עד 8 שבועות לא שרדו את משטר ה-IV (שלב היפרפולריזציה), דבר המצביע על כך שיש רגישות ברורה לפוטנציאל היפרפולריזציה בשלב מאוחר זה. לעומת זאת, בנוירוני Mfn2cKO, הזרמים הדה-פולריזטיביים הגורמים לפריקות פוטנציאל פעולה חוזרות (AP) נסבלים היטב, דבר המצביע על כך שדפוסי הפריקה הכוללים שלהם אינם שונים באופן משמעותי מאלה של נוירוני ביקורת בני 8 שבועות (טבלה 1 ואיור 2G). באופן דומה, התדירות והמשרעת של זרמים פוסט-סינפטיים ספונטניים (sPSCs) היו דומים לאלה של קבוצת הביקורת, ותדירות האירועים עלתה מ-4 שבועות ל-5 שבועות ל-7 שבועות ל-8 שבועות עם עלייה דומה (איור 2, H ו-I). תקופת ההבשלה הסינפטית ב-PNs (25). תוצאות דומות התקבלו לאחר טלאי PNs מחוררים. תצורה זו מונעת פיצוי אפשרי של פגמי ATP תאיים, כפי שעשוי לקרות ברישום טלאי מהדק של תא שלם. בפרט, פוטנציאל הממברנה במנוחה ותדירות הירי הספונטנית של נוירוני Mfn2cKO לא הושפעו (איור 2, J ו-K). לסיכום, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-PNs עם תפקוד לקוי ברור של OXPHOS יכולים להתמודד היטב עם דפוסי פריקה בתדר גבוה, דבר המצביע על כך שקיים מנגנון פיצוי המאפשר להם לשמור על תגובות אלקטרופיזיולוגיות כמעט נורמליות.
הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM (ניתוח שונות חד-כיווני, מבחן ההשוואה המרובה של Holm-Sidak; *P<0.05). מספר היחידה מסומן בסוגריים.
יצאנו לחקור האם קטגוריה כלשהי במערך הנתונים של פרוטאומיקה (איור 1G) כוללת מסלולים שיכולים לנטרל מחסור חמור ב-OXPHOS, ובכך להסביר מדוע PN מושפע יכול לשמור על אלקטרופיזיולוגיה כמעט תקינה (איור 2, E עד K). ניתוח פרוטאומיקה הראה כי האנזימים המעורבים בקטבוליזם של חומצות אמינו מסועפות שרשרת (BCAA) היו מווסתים באופן משמעותי כלפי מעלה (איור 3A ואיור S5A), והתוצר הסופי אצטיל-CoA (CoA) או סוקסיניל CoA יכולים להשלים את הטריקרבוקסילטים במחזור חומצה טרשתית (TCA). מצאנו שתכולת ה-BCAA טרנסאמינאז 1 (BCAT1) ו-BCAT2 שניהם עלתה. הם מזרזים את השלב הראשון של קטבוליזם של BCAA על ידי יצירת גלוטמט מ-α-קטוגלוטאראט (26). כל תת-היחידות המרכיבות את קומפלקס חומצת קטו דהידרוגנאז מסועפת שרשרת (BCKD) מווסתות כלפי מעלה (הקומפלקס מזרז את הדה-קרבוקסילציה הבלתי הפיכה שלאחר מכן של שלד הפחמן BCAA שנוצר) (איור 3A ואיור S5A). עם זאת, לא נמצאו שינויים ברורים ב-BCAA עצמו ב-PN הממוין, דבר שעשוי להיות עקב ספיגה תאית מוגברת של חומצות אמינו חיוניות אלו או שימוש במקורות אחרים (גלוקוז או חומצה לקטית) כדי להשלים את מחזור ה-TCA (איור S5B). PNs חסרי OXPHOS הראו גם פעילות מוגברת של פירוק גלוטמין וטרנסאמינציה בגיל 8 שבועות, דבר שיכול לבוא לידי ביטוי בעלייה בוויסות של האנזימים המיטוכונדריאליים גלוטמינאז (GLS) וגלוטמין פירובט טרנסאמינאז 2 (GPT2) (איור 3, A ו-C). ראוי לציין כי העלייה ברמת ה-GLS מוגבלת לאיזופורם המשולב גלוטמינאז C (GLS-GAC) (השינוי ב-Mfn2cKO/CTRL הוא פי 4.5 בקירוב, P = 0.05), והעלייה הספציפית שלו ברקמות סרטניות יכולה לתמוך בביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית. (27).
(א) מפת החום מציגה את שינוי הקיפול ברמת החלבון עבור המסלול שצוין לאחר 8 שבועות. (ב) דוגמה לפרוסת צרבלום מסומנת בנוגדן אנטי-PCx (סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר). החץ הצהוב מצביע על גוף התא פורקינג'. (ג) ניתוח ביטוי חלבון בזמן שזוהה כמועמד חשוב לטרשת עורקים (מבחן t מרובה, *FDR <5%; n = 3-5 עכברים). (ד) למעלה: תרשים סכמטי המציג את הדרכים השונות לכניסה לפחמן המסומן הכלול בנתב [1-13C]פירובט (כלומר, דרך PDH או דרך טרנס-עורקית). למטה: תרשים הכינור מציג את אחוז הפחמן המסומן יחיד (M1) שהומר לחומצה אספרטית, חומצת לימון וחומצה מאלית לאחר סימון פרוסות צרבלום חריפות עם [1-13C]פירובט (מבחן t מזווג; ** P <0.01). (ה) ניתוח מקיף של היסטוריית הזמן של המסלול שצוין. יש לקחת בחשבון רק חלבונים עם P <0.05 לאחר 8 שבועות. קו מקווקו: ללא ערך התאמה (ניתוח שונות דו-כיווני; * P <0.05; *** P <0.001). הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM.
בניתוח שלנו, קטבוליזם של BCAA הפך לאחד ממסלולי העלייה ברמת ה-upregulation המרכזיים. עובדה זו מרמזת מאוד כי נפח האוורור הנכנס למחזור TCA עשוי להשתנות בתאי זיכרון פנימיים חסרי OXPHOS. עובדה זו עשויה לייצג צורה עיקרית של חיווט מטבולי מחדש של תאי העצב, אשר עשויה להשפיע ישירות על הפיזיולוגיה וההישרדות העצבית במהלך שמירה על תפקוד לקוי חמור של OXPHOS. בהתאם להשערה זו, מצאנו כי האנזים האנטי-טרשתי העיקרי PCx מווסת כלפי מעלה (Mfn2cKO/CTRL משתנה פי 1.5 בקירוב; איור 3A), אשר מזרז את ההמרה של פירובט לאוקסלואצטט (28), אשר מאמינים כי הוא נמצא ברקמת המוח. הביטוי ב- מוגבל לאסטרוציטים (29, 30). בהתאם לתוצאות הפרוטאומיקה, מיקרוסקופיה קונפוקלית הראתה כי ביטוי PCx גדל באופן ספציפי ומשמעותי בתאי זיכרון פנימיים חסרי OXPHOS, בעוד תגובתיות PCx הוגבלה בעיקר לתאי גליה ברגמן הסמוכים של קבוצת הביקורת (איור 3B). כדי לבחון פונקציונלית את העלייה ברמת ה-PCx שנצפתה, טיפלנו בפרוסות צרבלריות חריפות עם נותב פירובט [1-13C]. כאשר פירובט חומצן על ידי פירובט דהידרוגנאז (PDH), התווית האיזוטופית שלו נעלמה, אך היא משולבת בתוצרי הביניים של מחזור ה-TCA כאשר פירובט עובר מטבוליזם על ידי תגובות וסקולריות (איור 3D). לתמיכה בנתוני הפרוטאומיקס שלנו, צפינו במספר רב של סמנים נותב זה בחומצה אספרטית של פרוסות Mfn2cKO, בעוד שחומצת לימון וחומצה מאלית גם הן הראו מגמה מתונה, אם כי לא משמעותית (איור 3D).
בנוירוני דופמין של עכברי MitoPark עם תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הנגרם על ידי נוירוני דופמין שהורסים באופן ספציפי את גן גורם התעתוק המיטוכונדריאלי A (Tfam) (איור S6B), גם ביטוי PCx עלה משמעותית (31), דבר המצביע על כך שטרשת עורקים עקב חומצת אצטון. הופעת המחלה מווסתת במהלך תפקוד לקוי של OXPHOS נוירוני בגוף. ראוי לציין כי נמצא כי אנזימים ייחודיים (32-34) שעשויים להתבטא בנוירונים שעשויים להיות קשורים לטרשת עורקים מווסתים משמעותית בנוירונים פרטניים חסרי OXPHOS, כגון קרבוקסילאז פרופיוניל-CoA (PCC-A), מאלוניל-CoA ממיר פרופיוניל-CoA לסוקסיניל-CoA ואנזים מאלי מיטוכונדריאלי 3 (ME3), שתפקידו העיקרי הוא להחזיר פירובט ממלאט (איור 3, A ו-C) (33, 35). בנוסף, מצאנו עלייה משמעותית באנזים Pdk3, אשר מבצע זרחון וכך מנטרל את PDH (36), בעוד שלא נמצאו שינויים באנזים Pdp1 המפעיל PDH או בקומפלקס האנזים PDH עצמו (איור 3A). באופן עקבי, ב-PNs של Mern2cKO, הזרחון של תת-היחידה α1 α (PDHE1α) של רכיב פירובט דהידרוגנאז E1 של קומפלקס PDH ב-Ser293 (ידוע כמעכב את פעילות האנזים של PDH) הוגבר (איור S6C). לפירובט אין גישה לכלי הדם.
לבסוף, מצאנו כי מסלול העל של ביוסינתזה של סרין וגליצין, מחזור חומצה פולית מיטוכונדריאלי (1C) הקשור וביוסינתזה של פרולין (איור 1G ואיור S5C) כולם מווסתים באופן משמעותי כלפי מעלה, על פי דיווחים, במהלך תהליך ההפעלה. הרקמות הסובבות מופעלות עם תפקוד לקוי של מיטוכונדריה (5-7). ניתוח קונפוקלי התומך בנתוני פרוטאומיקה אלה הראה כי ב-PN עם חסר OXPHOS, פרוסות צרבלריות של עכברים בני 8 שבועות עברו טיפול בסרין הידרוקסימתילטרנספראז 2 (SHMT2), אנזים מפתח במחזור חומצה פולית מיטוכונדריאלי. תגובה חיסונית משמעותית (איור S5D). ב-13 פרוסות צרבלריות חריפות שדורגו ב-CU-גלוקוז, ניסויי מעקב מטבולי אישרו עוד יותר את העלייה בביוסינתזה של סרין ופרולין, דבר המצביע על כך ששטף האיזופורמים של פחמן לסרין ופרולין גדל (איור S5E). מאחר שהתגובות המקודמות על ידי GLS ו-GPT2 אחראיות לסינתזה של גלוטמט מגלוטמין ולטרנס-אמינציה בין גלוטמט ל-α-קטוגלוטראט, העלייה ברמתן מצביעה על כך שלנוירונים חסרי OXPHOS יש דרישה מוגברת לגלוטמט. ייתכן שהדבר מכוון לשמירה על ביוסינתזה מוגברת של פרולין (איור S5C). בניגוד לשינויים אלה, ניתוח פרוטאומי של אסטרוציטים צרבלריים מעכברי Mfn2cKO ספציפיים ל-PN הראה כי מסלולים אלה (כולל כל האנטי-פראוקסידאזות) לא השתנו באופן משמעותי בביטוי, ובכך מדגים כי ניתוב מטבולי זה הוא סלקטיבי ל-PN מפורק (איור S6, D עד G).
לסיכום, ניתוחים אלה חשפו דפוסים שונים באופן משמעותי של הפעלה זמנית של מסלולים מטבוליים ספציפיים ב-PNs. למרות שתפקוד מיטוכונדריאלי לא תקין של העצב יכול להוביל לטרשת עורקים מוקדמת ולעיצוב מחדש של קומפלקסים 1C (איור 3E ואיור S5C), ואפילו לשינויים צפויים בביטוי של קומפלקסים I ו-IV, השינויים בסינתזת סרין דה נובו ניכרים רק בשלבים המאוחרים. תפקוד לקוי של OXPHOS (איור 3E ואיור S5C). ממצאים אלה מגדירים תהליך רציף שבו המיטוכונדריה (מחזור 1C) והציטופלזמה (ביוסינתזה של סרין) המושרה על ידי לחץ מגיבים באופן סינרגטי עם העלייה בטרשת עורקים במחזור TCA כדי לעצב מחדש את חילוף החומרים העצבי.
נוירונים פרטניים (PNs) בני 8 שבועות חסרי OXPHOS יכולים לשמור על פעילות עירור בתדירות גבוהה ולעבור חיבור מטבולי משמעותי כדי לפצות על תפקוד לקוי של המיטוכונדריה. תגלית זו מעלה אפשרות מעניינת שגם ברגע זה, תאים אלה עשויים לקבל התערבות טיפולית כדי לעכב או למנוע ניוון עצבי. פתרנו אפשרות זו באמצעות שתי התערבויות בלתי תלויות. בשיטה הראשונה, עיצבנו וקטור וירוס הקשור לאדנו (AAV) תלוי-Cre כך ש-MFN2 יוכל להתבטא באופן סלקטיבי בנוירונים פרטניים חסרי OXPHOS in vivo (איור S7A). ה-AAV המקודד ל-MFN2 וגן הדיווח הפלואורסצנטי mCherry (Mfn2-AAV) אומתו בתרביות נוירונים ראשוניות in vitro, מה שגרם ל-MFN2 להתבטא באופן תלוי-Cre והציל את המורפולוגיה המיטוכונדרית, ובכך מנעה נוירומוטציה בנוירונים Mfn2cKO (איור S7, B, D ו-E). לאחר מכן, ערכנו ניסויים in vivo כדי להעביר באופן סטריאוטקטי Mfn2-AAV בן 8 שבועות לקליפת המוח הקטן של עכברי Mfn2cKO ועכברי ביקורת, וניתחנו עכברים בני 12 שבועות (איור 4A). עכברי Mfn2cKO שטופלו מתו (איור 1, A ו-B) (16). התמרה ויראלית in vivo הביאה לביטוי סלקטיבי של PN בכמה מעגלים במוח הקטן (איור S7, G ו-H). הזרקת AAV הביקורת המבטא רק mCherry (Ctrl-AAV) לא השפיעה באופן משמעותי על מידת הניוון העצבי בבעלי חיים מסוג Mfn2cKO. לעומת זאת, ניתוח Mfn2cKOs שעברו התמרה עם Mfn2-AAV הראה השפעה מגנה משמעותית של שכבת תאי PN (איור 4, B ו-C). בפרט, נראה כי צפיפות הנוירונים כמעט בלתי ניתנת להבחנה מזו של בעלי החיים בביקורת (איור 4, B ו-C, ואיור S7, H ו-I). הביטוי של MFN1, אך לא של MFN2, יעיל באותה מידה בהצלת מוות נוירוני (איור 4C ואיור S7, C ו-F), דבר המצביע על כך שהביטוי של MFN1 אקטופית יכול להשלים ביעילות את היעדר MFN2. ניתוח נוסף ברמת PN יחידה הראה ש-Mfn2-AAV הציל במידה רבה את האולטרה-מבנה של המיטוכונדריה, נורמל את רמות ה-mtDNA, והפך את הביטוי הגבוה של סמן האנטי-אנגיוגנזה PCx ​​(איור 4, C עד E). בדיקה ויזואלית של עכברי Mfn2cKO שחולצו במצב מנוחה הראתה כי יציבתם ותסמיני המוטוריקה שלהם (תנועה S1 עד S3) השתפרו. לסיכום, ניסויים אלה מראים כי החדרה מושהית של MFN2 ל-PNs חסרי OXPHOS מספיקה כדי להפוך את צריכת ה-mtDNA ולגרום לטרשת עורקים, ובכך למנוע ניוון אקסונים ומוות נוירוני in vivo.
(א) סכמה המציגה את לוח הזמנים הניסויי להזרקת AAV המקודד ל-MFN2 כאשר המסלול המטבולי המצוין מופעל. (ב) תמונות קונפוקליות מייצגות של פרוסות צרבלריות בנות 12 שבועות שעברו טרנסדוקציה ב-8 שבועות בעכברי Mfn2cKO ומסוממות בנוגדן אנטי-קלבינדין. מימין: קנה מידה של סיבי אקסון. קנה המידה של זום האקסון הוא 450 ו-75 מיקרומטר. (ג) משמאל: כימות צפיפות תאי פורקינג' בלולאת התמרה של AAV (AAV+) (ניתוח שונות חד כיווני; n = 3 עכברים). מימין: ניתוח מיקוד mtDNA ב-PN שעברו טרנסדוקציה בשבוע 12 (מבחן t לא מזווג; n = 6 תאים משלושה עכברים). * P <0.05; ** P <0.01. (ד) מיקרוסקופ אלקטרונים חודר מייצג של PNs של חתכי צרבלריות Mfn2cKO שעברו טרנסדוקציה עם הווקטורים הוויראליים המצוינים. המסכה הוורודה ממחישה את השטח שתפוס על ידי הדנדריטים, והריבוע הצהוב המקווקו ממחיש את הזום שמוצג מימין; n מייצג את הגרעין. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. (E) מציג דוגמה לצביעת PCx ב-PN שעבר טרנסדוקציה לאחר 12 שבועות. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. OE, ביטוי יתר; FC, שינוי קיפול.
לבסוף, חקרנו את החשיבות של הישרדות תאים המושרה על ידי פראוקסידאז בתאי פרט (PNs) שחוו תפקוד לקוי של OXPHOS. יצרנו mCherry המקודד ל-AAV-shRNA (RNA קצר ראש) המכוון ספציפית ל-mRNA של PCx בעכברים (AAV-shPCx), והזרקנו את הנגיף או את הנגיף או את הנגיף המקושקש שלו (AAV-scr) למוח הקטן של עכברי Mfn2cKO. ההזרקה בוצעה בשבוע הרביעי לגיל (איור 5A) כדי להשיג הפחתה יעילה של PCx בתקופה בה ביטוי PCx גדל (איור 3C) ושכבת תאי ה-PN עדיין הייתה שלמה (איור 1A). ראוי לציין כי הפחתת PCx (איור S8A) מובילה להאצה משמעותית של מוות PN, המוגבלת לטבעת הנגועה (איור 5, B ו-C). על מנת להבין את מנגנון ההשפעות המטבוליות הנגרמות על ידי עלייה ברמת PCx, חקרנו את מצב החמצון-חיזור של נוירונים עצביים (PNs) לאחר נוק-דאון של PCx וחיישן אופטי בתיווך AAV, Grx1-roGFP2, באו לידי ביטוי בו זמנית (איור S8, B עד D) כדי להעריך את השינוי היחסי בפוטנציאל החמצון-חיזור של פפטידים (38). לאחר מכן, ביצענו מיקרוסקופיית הדמיית פלואורסצנציה לכל החיים (FLIM) עם שני פוטונים בפרוסות מוח חריפות של Mfn2cKO בני 7 שבועות או גורי ביקורת, כדי לזהות שינויים פוטנציאליים במצב החמצון-חיזור הציטופלזמי לאחר אימות תנאי FLIM (איור S8, E עד G). הניתוח הראה עלייה משמעותית במצב החמצון של נוירונים עצביים בודדים של Mfn2cKO חסרי ביטוי PCx, השונה מנוירונים קבוצתיים בביקורת או נוירונים עצביים של Mfn2cKO המבטאים רק shRNA מקושקש (איור 5, D ו-E). כאשר ביטוי PCx ירד, אחוז ה-PNs של Mfn2cKO שהראו מצב חמצון גבוה גדל ביותר מפי שלושה (איור 5E), דבר המצביע על כך שעלייה ברמת ה-PCx שמרה על קיבולת החמצון-חיזור של נוירונים מנוונים.
(א) סכמה המציגה את לוח הזמנים הניסויי להזרקת shPCx המקודד ל-AAV כאשר מסלול המטבולי המצוין מופעל. (ב) תמונות קונפוקליות מייצגות של חתכים במוח הקטן בני 8 שבועות בעכברי Mfn2cKO שעברו טרנסדוקציה וסימוג עם נוגדן אנטי-קלצינורין לאחר 4 שבועות. סרגל קנה מידה, 450 מיקרומטר. (ג) כימות צפיפות תאי פורקינג' בלולאות שעברו טרנסדוקציה עם AAV (ניתוח שונות חד כיווני; n = 3 עד 4 עכברים). הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM; ***P<0.001. (ד) תמונת FLIM מייצגת מציגה את תוחלת החיים הממוצעת של PN בן 7 שבועות המבטא גלוטתיון-חיזור חיישן Grx1-roGFP2 בתנאי הניסוי שצוינו. יחס LUT (טבלת חיפוש): מרווח זמן הישרדות (בפיקו-שניות). סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר. (ה) ההיסטוגרמה מציגה את התפלגות ערכי תוחלת החיים של Grx1-roGFP2 מ-(ד) (n=158 עד 368 תאים בשני עכברים תחת כל תנאי). תרשים העוגה מעל כל היסטוגרמה: מציג את מספר התאים עם ערכי תוחלת חיים ארוכים יותר באופן משמעותי (אדום, מחומצן) או קצרים יותר (כחול, מופחת), אשר עולים על סטיית תקן אחת מערך תוחלת החיים הממוצע ב-CTRL-AAV-scr. (ו) המודל המוצע מציג את ההשפעה המגנה של עלייה ברמת PCx העצבית.
בסך הכל, הנתונים שאנו מספקים כאן מראים כי ביטוי מחדש של MFN2 יכול להציל לחלוטין PN מתקדם עם חסר חמור ב-OXPHOS, דלדול חמור של mtDNA ומורפולוגיה דמוית איסטה חריגה ביותר, ובכך לספק התקדמות מתמשכת גם במחלות מתקדמות. ניוון עצבי מספק ראיות הפיכות לשלב שלפני מוות תאי. דרגה זו של גמישות מטבולית מודגשת עוד יותר על ידי יכולתם של נוירונים לגרום לטרשת עורקים (חיווט מחדש של מחזור TCA), אשר מעכב את ביטוי PCx ב-PNs חסרי OXPHOS ומגביר את מוות התא, ובכך ממלא תפקיד מגן (איור 5F).
במחקר זה, סיפקנו ראיות לכך שהתגובה של נוירונים פרטניים (PNs) לתפקוד לקוי של OXPHOS היא להתכנס בהדרגה לטרשת עורקים במחזור TCA דרך מסלול הפעלה דיפרנציאלי המופעל על ידי תוכניות מטבוליות. אישרנו את הניתוח הפרוטאומי באמצעות שיטות משלימות רבות וחשפנו שכאשר הם מתמודדים עם תפקוד לקוי חמור של מיטוכונדריה, לנוירונים יש צורה לא ידועה קודם לכן של גמישות מטבולית. להפתעתנו, כל תהליך החיווט מחדש אינו בהכרח מסמן את המצב המטבולי הסופי המלווה ניוון עצבי בהדרגה ובלתי הפיך, אך הנתונים שלנו מצביעים על כך שהוא עשוי להוות נוירון תחזוקה גם בשלב שלפני מוות תאים. מנגנון פיצוי פונקציונלי. ממצא זה מצביע על כך שלנוירונים יש מידה ניכרת של פלסטיות מטבולית בגוף. עובדה זו מוכיחה כי החדרה מאוחרת יותר של MFN2 יכולה להפוך את הביטוי של סמנים מטבוליים מרכזיים ולמנוע ניוון PN. להיפך, הוא מעכב טרשת עורקים ומאיץ את פעילות העצבים הטרנסג'נדרים.
אחת הממצאים המרתקים ביותר במחקר שלנו היא שנוירונים פרה-רפואיים (PNs) חסרי OXPHOS יכולים לשנות את חילוף החומרים של מחזור ה-TCA על ידי עלייה באנזימים המגרים באופן ספציפי טרשת עורקים. סידור מחדש מטבולי הוא מאפיין נפוץ של תאי סרטן, שחלקם מסתמכים על גלוטמין כדי להשלים תוצרי ביניים של מחזור ה-TCA כדי לייצר אקוויוולנטים מחזרים, המניעים את שרשרת הנשימה ושומרים על ייצור של מבשרי ביוסינתזה של ליפידים ונוקלאוטידים (39, 40). מחקר שנערך לאחרונה הראה שברקמות פריפריאליות החוות תפקוד לקוי של OXPHOS, חיבור מחדש של חילוף החומרים של גלוטמין/גלוטמט הוא גם מאפיין בולט (5, 41), כאשר כיוון כניסת הגלוטמין למחזור ה-TCA תלוי ב... עקב חומרת הפגיעה ב-OXPHOS (41). עם זאת, קיים חוסר בראיות ברורות לגבי כל דמיון בין גמישות מטבולית עצבית בגוף ורלוונטיותה האפשרית בהקשר של המחלה. במחקר חוץ גופי שנערך לאחרונה, נוירונים קורטיקליים ראשוניים הראו גיוס מאגרי גלוטמט לצורך העברת עצבית, ובכך מקדמים מטבוליזם חמצוני וטרשת עורקים בתנאי עקה מטבולית (42). ראוי לציין שתחת עיכוב פרמקולוגי של אנזים מחזור TCA, סוקצינט דהידרוגנאז, מאמינים כי קרבוקסילציה של פירובט שומרת על הסינתזה של אוקסלואצטט בנוירונים של גרגירי המוח הקטן בתרבית (34). עם זאת, הרלוונטיות הפיזיולוגית של מנגנונים אלה לרקמת המוח (שם מאמינים כי טרשת עורקים מוגבלת בעיקר לאסטרוציטים) עדיין בעלת משמעות פיזיולוגית חשובה (43). במקרה זה, הנתונים שלנו מראים כי נוירו-תרכובות פנוליות (PNs) שניזוקו על ידי OXPHOS בגוף יכולות לעבור לפירוק BCAA ולקרבוקסילציה של פירובט, שהן שני המקורות העיקריים לתוספת של חומרי ביניים של מאגר TCA. למרות שהוצעה תרומה משוערת של קטבוליזם BCAA למטבוליזם אנרגטי עצבי, בנוסף לתפקידם של גלוטמט ו-GABA בהעברה עצבית (44), עדיין אין ראיות למנגנונים אלה in vivo. לכן, קל לשער כי PNs לא מתפקדים יכולים לפצות אוטומטית על צריכת חומרי ביניים של TCA המונעת על ידי תהליך ההטמעה על ידי הגברת טרשת עורקים. בפרט, ייתכן שיידרש עלייה ברמת PCx כדי לשמור על דרישה מוגברת לחומצה אספרטית, דבר המצביע על כך בתאים מתרבים עם תפקוד לקוי של המיטוכונדריה (45). עם זאת, ניתוח המטבולומיקה שלנו לא גילה שינויים משמעותיים ברמת החומצה האספרתית במצב יציב בתאי עצב מסוג Mfn2cKO (איור S6A), דבר המשקף ככל הנראה את השימוש המטבולי השונה בחומצה אספרטית בין תאים מתרבים לנוירונים פוסט-מיטוטיים. למרות שהמנגנון המדויק של עלייה ברמת PCx בנוירונים לא מתפקדים in vivo טרם אופיין, הראינו שתגובה מוקדמת זו ממלאת תפקיד חשוב בשמירה על מצב החמצון-חיזור של נוירונים, כפי שהודגם בניסויי FLIM על פרוסות צרבלריות. בפרט, מניעת עלייה ברמת PCx על ידי PNs יכולה להוביל למצב מחומצן יותר ולהאיץ את מוות התא. הפעלת פירוק BCAA וקרבוקסילציה של פירובט אינן דרכים לאפיין את הרקמות ההיקפיות של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה (7). לכן, נראה שהם מאפיין עדיף של נוירונים חסרי OXPHOS, גם אם לא המאפיין היחיד, שחשוב לניוון עצבי.
מחלת צרבלום היא סוג הטרוגני של מחלה ניוונית עצבית המתבטאת בדרך כלל כאטקסיה ולעתים קרובות פוגעת בתאי המוח הקטן (46). אוכלוסיית נוירונים זו פגיעה במיוחד לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה מכיוון שהניוון הסלקטיבי שלהם בעכברים מספיק כדי לשחזר רבים מהתסמינים המוטוריים המאפיינים אטקסיה ספינוצרבלרית אנושית (16, 47, 48). על פי דיווחים, מודל עכבר טרנסגני עם גן מוטנטי קשור לאטקסיה ספינוצרבלרית אנושית ויש לו תפקוד לקוי של המיטוכונדריה (49, 50), מה שמדגיש את החשיבות של לימוד ההשלכות של מחסור ב-OXPHOS ב-PNPH. לכן, מתאים במיוחד לבודד ולחקור ביעילות את אוכלוסיית הנוירונים הייחודית הזו. עם זאת, בהתחשב בכך ש-PN רגישים מאוד ללחץ ומהווים חלק נמוך מכלל אוכלוסיית תאי המוח הקטן, עבור מחקרים רבים המבוססים על אומיקס, הפרדה סלקטיבית שלהם כתאים שלמים היא עדיין היבט מאתגר. למרות שכמעט בלתי אפשרי להשיג היעדר מוחלט של זיהום של סוגי תאים אחרים (במיוחד רקמות בוגרות), שילבנו שלב דיסוציאציה יעיל עם FACS כדי להשיג מספר מספיק של נוירונים ברי קיימא לניתוח פרוטאומיקה במורד הזרם, ולקבל כיסוי חלבון גבוה למדי (כ-3000 חלבונים) בהשוואה למערך הנתונים הקיים של המוח הקטן כולו (51). על ידי שימור הכדאיות של תאים שלמים, השיטה שאנו מספקים כאן מאפשרת לנו לא רק לבדוק את השינויים במסלולים המטבוליים במיטוכונדריה, אלא גם לבדוק את השינויים במקבילים הציטופלזמיים שלה, מה שמשלים את השימוש בתגי ממברנה מיטוכונדריאלית להעשרת סוג התא. השיטה החדשה למספר המיטוכונדריה ברקמות מורכבות (52, 53). השיטה שאנו מתארים אינה קשורה רק לחקר תאי פורקינג'ה, אלא ניתנת ליישום בקלות על כל סוג של תא כדי לטפל בשינויים מטבוליים במוחות חולים, כולל מודלים אחרים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
לבסוף, זיהינו חלון טיפולי במהלך תהליך סידור מחדש מטבולי זה שיכול להפוך לחלוטין את הסימנים המרכזיים של לחץ תאי ולמנוע ניוון נוירונים. לכן, הבנת ההשלכות התפקודיות של החיווט מחדש המתואר כאן עשויה לספק תובנות בסיסיות לגבי טיפולים אפשריים לשמירה על כדאיות נוירונים במהלך תפקוד לקוי של המיטוכונדריה. יש צורך במחקר עתידי שמטרתו לנתח שינויים בחילוף החומרים האנרגטי בסוגי תאי מוח אחרים כדי לחשוף באופן מלא את תחולתו של עיקרון זה על מחלות נוירולוגיות אחרות.
עכברי MitoPark תוארו בעבר (31). עכברי C57BL/6N עם גנים של Mfn2 המקיפים את loxP תוארו בעבר (18) והוכלאו עם עכברי L7-Cre (23). הצאצאים ההטרוזיגוטים הכפולים שנוצרו הוכלאו לאחר מכן עם עכברי Mfn2loxP/Mfn2loxP הומוזיגוטיים כדי ליצור נוקאאוטים של גנים ספציפיים לפורקינג' עבור Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). בתת-קבוצה של הזדווגות, האלל Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) הוכנס באמצעות הכלאות נוספות (20). כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות אירופאיות, לאומיות ומוסדיות ואושרו על ידי LandesamtfürNatur של Umwelt ו-Verbraucherschutz, צפון ריין-וסטפליה, גרמניה. עבודת בעלי חיים פועלת גם לפי הנחיות הפדרציה האירופית של אגודות מדעי בעלי חיים במעבדה.
לאחר הרדמה של פריקת צוואר הרחם של האישה ההרה, עובר העכבר מבודד (E13). קליפת המוח נותחה בתמיסת מלח מאוזנת של Hanks (HBSS) בתוספת 10 mM Hepes והועברה למדיום Dulbecco's Modified Eagle's Medium המכיל פפאין (20 U/ml) וציסטאין (1μg/ml). הרקמה מודגרת ב-DMEM) ומפורקת על ידי עיכול אנזימטי. Ml) ב-37°C למשך 20 דקות, ולאחר מכן נטחנה מכנית ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי. התאים נזרעו על גבי כיסויי זכוכית מצופים בפוליזין בצפיפות של 2×106 לכל צלחת תרבית של 6 ס"מ או בצפיפות של 0.5×105 תאים/ס"מ רבוע לצורך ניתוח הדמיה. לאחר 4 שעות, המדיום הוחלף במדיום נטול סרום Neurobasal המכיל 1% תוסף B27 ו-0.5 mM GlutaMax. הנוירונים נשמרו לאחר מכן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ובריכוז של 5% CO2 לאורך כל הניסוי, והוזנו פעם בשבוע. על מנת לגרום לרקומבינציה במבחנה, נעשה שימוש ב-3 מיקרוליטר (צלחת תרבית בת 24 בארות) או 0.5 מיקרוליטר (צלחת בת 24 בארות) של וקטור הנגיף AAV9 הבא לטיפול בנוירונים ביום השני במבחנה: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, מספר קטלוגי 105530-AAV9) ו- AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, מספר קטלוגי 105545-AAV9).
DNA משלים של עכברים כמו Mfn1 ו-Mfn2 (שהתקבל מפלסמיד Addgene #23212 ו-#23213, בהתאמה) מסומנים ברצף V5 (GKPIPNPLLGLDST) בקצה C, ומחוברים עם mCherry בתוך הפריים דרך רצף T2A. Grx1-roGFP2 הוא מתנה מהיידלברג TP Dick DFKZ (המכון הגרמני למחקר קרבספורשנס). על ידי החלפת קסטה tdTomato באמצעות שיטות שיבוט קונבנציונליות, הקסטה שובטה לתוך עמוד השדרה pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (מספר סימוכין Addgene 28306) כדי ליצור את הווקטורים pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ו-pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. אסטרטגיה דומה שימשה ליצירת וקטור הבקרה pAAV-CAG-FLEX-mCherry. על מנת ליצור את מבנה AAV-shPCx, נדרש וקטור פלסמיד AAV ‏(VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), המכיל את רצף ה-DNA המקודד ל-shRNA המכוון ל-PCx עכבר (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). תחת פיקוח פרומוטר U6, נעשה שימוש ב-mCherry תחת פיקוח פרומוטר CMV. ייצור וקטורי AAV עזר בוצע בהתאם להוראות היצרן (Cell Biolabs). בקיצור, השתמשו בפלסמיד העברה הנושא את mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) באופן זמני. טרנספקציה של גן מקודד לתאי 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) או Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), כמו גם קידוד חלבון קפסיד AAV1 וחלבון עזר. אריזת פלסמיד, בשיטת סידן פוספט. הנוזל העליוני של הנגיף הגולמי הושג על ידי מחזורי הקפאה-הפשרה באמבט קרח יבש/אתנול ותאים הותאמו בתמיסת מלח עם בופר פוספט (PBS). וקטור ה-AAV טוהר באמצעות אולטרה-צנטריפוגה לא רציפה של יודיקסנול בגרדיאנט (24 שעות ב-32,000 סל"ד ו-4°C) ורוכז באמצעות מסנן צנטריפוגלי Amicon ultra-15. טיטר גנום של AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 עותק גנום (GC)/מ"ל], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/מ"ל), AAV1-CAG-FLEX נמדד כפי שתואר קודם לכן (54), ונמדד באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/מ"ל) ו-AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/מ"ל).
נוירונים ראשוניים גורדו בתמיסת PBS קרה כקרח, גולגלו לגלולים, ולאחר מכן עברו הומוגניזציה בבופר ליזיס 0.5% Triton X-100 / 0.5% נתרן דאוקסיכלאט/PBS המכיל פוספטאז ומעכב פרוטאז (Roche). כימות חלבונים בוצע באמצעות מבחן חומצה ביצינצ'ונינית (Thermo Fisher Scientific). לאחר מכן, החלבונים הופרדו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל SDS-polyacrylamide, ולאחר מכן הוכנסו לממברנת פוליווינילידן פלואוריד (GE Healthcare). חסמו אתרים לא ספציפיים ודגרו עם הנוגדן הראשוני (ראו טבלה S1 לפרטים) בחלב 5% ב-TBST (תמיסת מלח בופרת Tris עם Tween), שלבי שטיפה ונוגדן משני ב-TBST Incubate. דגרו עם הנוגדן הראשוני למשך הלילה ב-4°C+. לאחר השטיפה, מרחו את הנוגדן המשני למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, על ידי דגירה של אותו כתם עם נוגדן אנטי-β-אקטין, אושרה אותה טעינה. גילוי על ידי המרה לכימילומינסנציה והגברת כימילומינסנציה (GE Healthcare).
הנוירונים שנזרעו קודם לכן על גבי כיסויי זכוכית קובעו עם 4% פאראפורמלדהיד (PFA)/PBS בנקודת הזמן שצוינה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. כיסויי הכיסוי עברו תחילה ספיגה של 0.1% Triton X-100/PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בתוך בופר חסימה [3% אלבומין בסרום בקר (BSA)/PBS]. ביום השני, כיסויי הכיסוי נשטפו עם בופר חסימה והודגרו עם הנוגדן המשני המתאים מצומד לפלואורופור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר; לבסוף, הדגימות נשטפו היטב ב-PBS עם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) שנצבע בצבע נגדי ולאחר מכן קובעו על שקופית המיקרוסקופ באמצעות Aqua-Poly/Mount.
עכברים (זכרים ונקבות) הורדו באמצעות הזרקה תוך-צפקית של קטמין (130 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) וניתנו להם באופן תת-עורי עם משכך כאבים קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג). הם הושמו במכשיר סטריאוטקטי (Kopf) המצויד במשטח חם. חשפו את הגולגולת והשתמשו במקדחה דנטלית כדי לדלל את החלק של קליפת המוח הקטן המתאים לעצם ה-mis (מלמבדה: זנב 1.8, צדדי 1, מתאים לאונות IV ו-V). השתמשו במחט מזרק מעוקלת כדי ליצור בזהירות חור קטן בגולגולת כדי למנוע שיבוש כלי הדם שמתחת. לאחר מכן, נימי זכוכית דקים נמשכים מוחדרים באיטיות לתוך המיקרו-חור (מ-1.3- ל-1- בצד הגחוני של הדורה מאטר), ו-200 עד 300 ננוליטר AAV מוזרקים לתוך המיקרו-מזרק (Narishige) באמצעות מזרקים ידניים (Narishige) מספר פעמים בלחץ נמוך במשך פרק זמן של 10 עד 20 דקות. לאחר העירוי, יש להניח את הנימים למשך 10 דקות נוספות כדי לאפשר לנגיף להתפשט לחלוטין. לאחר הוצאת הנימים, העור נתפר בזהירות כדי למזער את דלקת הפצע ולאפשר לחיה להתאושש. בעלי החיים טופלו במשככי כאבים (קספופן) במשך מספר ימים לאחר הניתוח, במהלכם מצבם הפיזי נוטר בקפידה ולאחר מכן הם הורדמו בנקודת הזמן שנקבעה. כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות האירופיות, הלאומיות והמוסדיות ואושרו על ידי LandesamtfürNatur של Umwelt and Verbraucherschutz, צפון ריין-וסטפליה, גרמניה.
החיות הורדו באמצעות קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג), והלב עבר תחילה זילוח עם 0.1 M PBS, ולאחר מכן עם 4% PFA ב-PBS. הרקמה נותחה וקיבעה ב-4% PFA/PBS למשך הלילה ב-4°C. סכין רוטטת (Leica Microsystems GmbH, וינה, אוסטריה) שימשה להכנת חתכים סגיטליים (עובי 50 מיקרומטר) מהמוח המקובע ב-PBS. אלא אם כן צוין אחרת, צביעת החתכים הצפים בוצעה כמתואר לעיל (13) בטמפרטורת החדר תוך ערבוב. בקצרה, ראשית, הפרוסות שהתקבלו עברו חדירה עם 0.5% Triton X-100/PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר; עבור חלק מהאפיטופים (Pcx ו-Shmt2), על ידי חימום הפרוסות בבופר tris-EDTA ב-80°C (pH 9) למשך 25 דקות במקום שלב זה. לאחר מכן, החתכים הודגרו עם נוגדן ראשוני (ראה טבלה S1) בבופר חסימה (3% BSA/PBS) ב-4°C למשך הלילה תוך ערבוב. למחרת, החתכים נשטפו עם בופר חסימה והודגרו עם הנוגדן המשני המתאים מצומד לפלואורופור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר; לבסוף, החתכים נשטפו היטב ב-PBS, נצבעו בצבע נגדי עם DAPI, ולאחר מכן קובעו עם AquaPolymount על גבי שקופית מיקרוסקופ.
מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר (TCS SP8-X או TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) המצויד בלייזר אור לבן ולייזר אולטרה סגול דיודה 405 שימש להדמיית הדגימה. על ידי עירור הפלואורופור ואיסוף האות באמצעות גלאי היברידי (HyDs), תוכנת LAS-X שימשה לאיסוף תמונות מוערמות התואמות לדגימה נייקוויסט במצב סדרתי: עבור פאנלים לא כמותיים, מדובר באותות דינמיים ביותר (לדוגמה, בתאים סומטיים ודנדריטים) (mtYFP). השתמשו ב-HyD כדי לזהות את מספר ה-PNs במצב BrightR). גישה מ-0.3 עד 6 ננו-שניות מוחלת להפחתת קרינת הרקע.
הדמיה בזמן אמת של תאים ממוינים. לאחר מיון במדיום Neurobasal-A המכיל 1% תוסף B27 ו-0.5 mM GlutaMax, התאים נזרעו מיד על גבי שקופיות זכוכית מצופות poly-l-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, מספר קטלוגי 80826), ולאחר מכן נשמרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעה אחת כדי לאפשר לתאים לשקוע. הדמיה בזמן אמת בוצעה במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר Leica SP8 המצויד בלייזר לבן, HyD, עדשת שמן בעלת אובייקטיב שמן 63×[1.4 צמצם מספרי (NA)] ובמת חימום.
העכבר הורדים במהירות בפחמן דו-חמצני וראשו נערף. המוח הוצא במהירות מהגולגולת ונחתך לחתכים סגיטליים בעובי 200 מיקרון (עבור ניסוי סימון 13C) או 275 מיקרון עובי (עבור שני ניסויי פוטונים) ומולא בחומרים הבאים. הגלידה (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, גרמניה) מולאה בחומרים הבאים: 125 mM NaCl קר כקרח, רווי פחמן (95% O2 ו-5% CO2) דל סידן + נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (ACSF), 2.5 mM KCl, 1.25 mM בופר נתרן פוספט, 25 mM NaHCO3, 25 mM גלוקוז, 0.5 mM CaCl2 ו-3.5 mM MgCl2 (לחץ אוסמוטי של 310 עד 330 מילימול). העבירו את פרוסות המוח שהתקבלו לתא טרום-דגירה המכיל Ca2 + ACSF גבוה יותר (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נתרן פוספט בופר, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-גלוקוז, 1.0 mM CaCl2 ו-2.0 mM MgCl2) מדיום) pH 7.4 ו-310 עד 320 mmol).
במהלך תהליך ההדמיה, הפרוסות הועברו לחדר הדמיה ייעודי, והניסוי בוצע תחת זרימת דם רציפה של ACSF בטמפרטורה קבועה של 32° עד 33°C. מיקרוסקופ סורק לייזר רב-פוטוני (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) המצויד בעדשת אובייקטיבית Leica 25x (NA 0.95, מים), לייזר Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) שימש להדמיית הפרוסות. מודול FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM של Grx1-roGFP2. השינויים במצב החיזור הציטופלזמי של PNs נמדדו על ידי FLIM דו-פוטוני בפרוסות מוח סגיטליות, כאשר החיישן Grx1-roGFP2 כיוון את PNs. בשכבת ה-PN, שדה הרכישה נבחר כ-50 עד 80 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הפרוסה כדי להבטיח שיש PN בר-קיימא (כלומר, היעדר מבנה חרוזים או שינויים מורפולוגיים עצביים לאורך הדנדריטים) וחיישן roGFP2 חיובי כפול ו- shRNA PCx המקודד ל-AAV או רצף הבקרה שלו (כל אחד מהם מבטא במשותף mCherry). איסוף תמונות בעלות מחסנית בודדת עם זום דיגיטלי 2x [אורך גל עירור: 890 ננומטר; 512 ננומטר 512 פיקסלים]. זיהוי: HyD פנימי, קבוצת מסנן פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC)] וממוצע תמונות תוך 2 עד 3 דקות משמשים כדי להבטיח שנאספים מספיק פוטונים (1000 פוטונים בסך הכל) להתאמת עקומות. רגישות גלאי Grx1-roGFP2 ואימות תנאי FLIM בוצעו על ידי ניטור ערך תוחלת החיים של roGFP2 בעת הוספת 10 mM H2O2 אקסוגני ל-ACSF של הפרפוזיה (כדי למקסם את החמצון, וכתוצאה מכך להארכת תוחלת החיים), ולאחר מכן הוספת 2 mM דיתיותרייטול (ממזער את דרגת החיזור, וכתוצאה מכך ירידה בתוחלת החיים) (איור S8, D עד G). השתמש בתוכנת FLIMfit 5.1.1 כדי לנתח את התוצאות שהתקבלו, להתאים את עקומת הדעיכה האקספוננציאלית היחידה של התמונה כולה ל-IRF הנמדד (פונקציית תגובת המכשיר), ו-χ2 הוא בקירוב 1. כדי לחשב את תוחלת החיים של PN יחיד, המסכה סביב גוף העצב צוירה ידנית, ואורך החיים הממוצע בכל מסכה שימש לכימות.
ניתוח פוטנציאל מיטוכונדריאלי. לאחר שהחתך החריף הודגר עם 100 ננומטר TMRM שנוסף ישירות ל-ACSF שעבר זילוח למשך 30 דקות, נמדדו השינויים בפוטנציאל המיטוכונדריאלי של PNs באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. הדמיית TMRM בוצעה על ידי עירור הגשוש ב-920 ננומטר ושימוש ב-HyD פנימי (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 ננומטר) לאיסוף אותות; באמצעות אותו אורך גל עירור אך באמצעות HyD פנימי שונה (FITC: 525/50) כדי לצלם mtYFP. השתמשו בתוסף Image Calculator של ImageJ כדי להעריך את הפוטנציאל המיטוכונדריאלי ברמת התא הבודד. בקצרה, משוואת התוסף: signal = min (mtYFP, TMRM) משמשת לזיהוי האזור המיטוכונדריאלי המציג את אות ה-TMRM בתמונה הקונפוקלית היחידה של הערוץ המתאים. לאחר מכן, שטח הפיקסלים במסכה המתקבלת מכמת, ולאחר מכן מנורמל על תמונת הסף הבודדת המתאימה של ערוץ mtYFP כדי לקבל את השבר המיטוכונדריאלי המציג את הפוטנציאל המיטוכונדריאלי.
התמונה פותחה באמצעות תוכנת Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). עבור תמונות סרוקות של אריחים, מונטאז' של אריח בודד נוצר באמצעות אלגוריתם התפירה האוטומטי המסופק על ידי תוכנת LAS-X. לאחר כיול התמונה, השתמש ב-ImageJ וב-Adobe Photoshop כדי לעבד את התמונה עוד יותר ולהתאים את הבהירות והניגודיות באופן אחיד. השתמש ב-Adobe Illustrator להכנת גרפיקה.
ניתוח מיקוד mtDNA. מספר נגעי mtDNA נמדד כמותית על גבי חתכים צרבלמיים שסומנו בנוגדנים כנגד DNA באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. כל אזור מטרה נוצר עבור גוף התא והגרעין של כל תא, והשטח המתאים חושב באמצעות התוסף Multi Measure (תוכנת ImageJ). יש להפחית את שטח הגרעין משטח גוף התא כדי לקבל את השטח הציטופלזמי. לבסוף, נעשה שימוש בתוסף Analyze Particles (תוכנת ImageJ) כדי לכמת אוטומטית את נקודות ה-DNA הציטופלזמי המצביעות על mtDNA בתמונת הסף, והתוצאות שהתקבלו מנורמלות לממוצע ה-PN של עכברי CTRL. התוצאות מבוטאות כמספר ממוצע של נוקלאוזידים לתא.
ניתוח ביטוי חלבונים. השתמשו בתוסף Image Calculator של ImageJ כדי להעריך את ביטוי החלבון ב-PN ברמת התא הבודד. בקיצור, בתמונה קונפוקלית חד-שכבתית של הערוץ המתאים, באמצעות המשוואה: signal = min (mtYFP, antibody), מזוהה האזור המיטוכונדריאלי שמראה תגובתיות אימונוגלדן מסוים ב-Purkina. לאחר מכן, אזור הפיקסל במסכה המתקבלת מכומת, ולאחר מכן מנורמל בתמונה הסף המתאימה של ערוץ mtYFP כדי לקבל את השבר המיטוכונדריאלי של החלבון המוצג.
ניתוח צפיפות תאי פורקינג'ה. התוסף Cell Counter של ImageJ שימש להערכת צפיפות פורקינג'ה על ידי חלוקת מספר תאי פורקינג'ה שנספרו באורך טבעת המוח הקטן שתפסה את התאים שנספרו.
הכנת ואיסוף דגימות. מוחות קבוצת הביקורת ועכברי Mfn2cKO קובעו ב-2% PFA/2.5% גלוטראלדהיד בתמיסת בופר פוספט (PB) 0.1 M, ולאחר מכן הוכנו חתכים קורונליים באמצעות ריסים (Leica Mikrosysteme GmbH, וינה, אוסטריה) (עובי 50 עד 60 מיקרומטר). לאחר מכן קובעו בבופר PB ב-1% os טטראוקסיד ו-1.5% אשלגן פרוציאניד בטמפרטורת החדר למשך שעה. החתכים נשטפו שלוש פעמים במים מזוקקים, ולאחר מכן נצבעו באתנול 70% המכיל 1% אורניל אצטט למשך 20 דקות. לאחר מכן, החתכים יובשו באלכוהול מדורג והוטמעו בשרף אפוקסי Durcupan ACM (שרף יציקה Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, מספר קטלוגי 14040) בין שקופיות זכוכית מצופות סיליקון, ולבסוף ב-60°C פולימריזציה בתנור למשך 48 שעות. אזור קליפת המוח הקטן נבחר וחתכים דקים במיוחד של 50 ננומטר נחתכו במצלמת Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, וינה, אוסטריה) ונבחרו על גבי רשת חריצים נחושת בגודל 2×1 מ"מ מצופה בסרט פוליסטירן. החתכים נצבעו בתמיסה של 4% אורניל אצטט ב-H2O למשך 10 דקות, נשטפו עם H2O מספר פעמים, לאחר מכן עם ציטראט עופרת ריינולדס ב-H2O למשך 10 דקות, ולאחר מכן נשטפו עם H2O מספר פעמים. מיקרוסקופים צולמו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) באמצעות מצלמה דיגיטלית TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, ארה"ב, גרמניה).
עבור עכברים שנדבקו ב-AAV, המוח הופרד ונחתך לחתך סגיטלי בעובי 1 מ"מ, והמוח הקטן נבדק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות את הטבעת הנגועה ב-AAV (כלומר, ביטוי mCherry). נעשה שימוש רק בניסויים בהם הזרקת AAV הביאה ליעילות התמרה גבוהה מאוד של שכבת תאי פורקינג'ה (כלומר, כמעט כל השכבה) בשתי טבעות צרבלריות רצופות לפחות. הלולאה שעברה התמרה ב-AAV נותחה במיקרו-דיסקציה למשך הלילה לאחר קיבוע (4% PFA ו-2.5% גלוטראלדהיד ב-0.1 M בופר קוקואט) ועובדה עוד יותר. להטמעת EPON, הרקמה המקובעת נשטפה ב-0.1 M בופר קוקואט נתרן (Applichem), והודגרה עם 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ב-0.1 M בופר קוקואט נתרן (Applichem) במשך 4 שעות, ולאחר מכן נשטפה במשך שעתיים. חזרו על הפעולה 3 פעמים עם בופר קוקמיד 0.1 M. לאחר מכן, סדרה עולה של אתנול שימשה לדגירה של כל תמיסת אתנול ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לייבש את הרקמה. הרקמה הועברה לפרופילן אוקסיד והודגרה למשך הלילה ב-EPON (Sigma-Aldrich) ב-4 מעלות צלזיוס. הניחו את הרקמה ב-EPON טרי בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ולאחר מכן הטמיעו אותה ב-62 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. השתמשו באולטרה-מיקרוטום (Leica Microsystems, UC6) ובסכין יהלום (Diatome, Biel, Switzerland) כדי לחתוך חתכים דקים במיוחד של 70 ננומטר, ולצבוע עם 1.5% אורניל אצטט למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ולצבוע בתמיסת עופרת ציטרט למשך 4 דקות. צילומי מיקרוסקופ האלקטרונים צולמו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר JEM-2100 Plus (JEOL) המצויד ב-Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ובתוכנת DigitalMicrograph (Gatan). לצורך ניתוח, נרכשו מיקרוסקופ אלקטרונים עם זום דיגיטלי של ×5000 או ×10,000.
ניתוח מורפולוגי של המיטוכונדריה. עבור כל הניתוחים, קווי המתאר של המיטוכונדריה הבודדת תוארו באופן ידני בתמונות דיגיטליות באמצעות תוכנת ImageJ. פרמטרים מורפולוגיים שונים נותחו. צפיפות המיטוכונדריה מתבטאת באחוזים המתקבלים על ידי חלוקת השטח המיטוכונדריאלי הכולל של כל תא בשטח הציטופלזמה (שטח ציטופלזמה = שטח תא-שטח גרעין תא) × 100. עגלגלות המיטוכונדריה מחושבת באמצעות הנוסחה [4π∙(שטח/היקף 2)]. המורפולוגיה האיסטוכונדרית של המיטוכונדריה נותחה וחולקה לשתי קטגוריות ("צינורי" ו"שלפוחית") בהתאם לצורותיהן העיקריות.
ניתוח מספר וצפיפות אוטופגוזומים/ליזוזומים. השתמשו בתוכנת ImageJ כדי לתאר באופן ידני את קווי המתאר של כל אוטופגוזום/ליזוזום בתמונה הדיגיטלית. שטח האוטופגוזום/ליזוזום מבוטא כאחוז המחושב על ידי חלוקת שטח המבנה הכולל של האוטופגוזום/ליזוזום של כל תא בשטח הציטופלזמה (שטח ציטופלזמה = שטח תא-שטח גרעין) × 100. צפיפות האוטופגוזומים/ליזוזומים מחושבת על ידי חלוקת המספר הכולל במספר מבני האוטופגוזום/ליזוזום לכל תא (במונחים של שטח ציטופלזמי) (שטח ציטופלזמי = שטח תא-שטח גרעין).
תיוג לחיתוך חריף והכנת דגימה. עבור ניסויים הדורשים תיוג גלוקוז, יש להעביר את פרוסות המוח החריפות לתא טרום-דגירה, המכיל פחמן רווי (95% O2 ו-5% CO2), נוזל חד-חמצני (ACSF) עתיר סידן (Ca2+) (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נתרן פוספט בופר, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-גלוקוז, 1.0 mM CaCl2 ו-2.0 mM MgCl2, מותאמים ל-pH 7.4 ו-310 עד 320 mOsm), שבו גלוקוז הוא 13C6- החלפת גלוקוז (Eurisotop, מספר קטלוגי CLM-1396). עבור ניסויים הדורשים סימון פירובט, העבירו את פרוסות המוח החריפות לתמיסת סידן (Ca2) + ACSF גבוהה יותר (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נתרן פוספט בופר, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-גלוקוז, 1.0 mM CaCl2 והוסיפו 2.0 mM MgCl2, כוונו ל-pH 7.4 ו-310 עד 320 mOsm), והוסיפו 1 mM 1-[1-13C]פירובט (Eurisotop, מספר קטלוגי CLM-1082). דגרו את החתכים במשך 90 דקות ב-37°C. בסוף הניסוי, החתכים נשטפו במהירות בתמיסה מימית (pH 7.4) המכילה 75 mM אמוניום פחמתי, ולאחר מכן הומוגנו באצטוניטריל (ACN): מתנול: מים ביחס של 40:40:20 (v:v:v). לאחר שהדגימות הודגרו על קרח למשך 30 דקות, הדגימות עברו צנטריפוגה ב-21,000 גרם למשך 10 דקות ב-4°C, והנוזל העליון השקוף יובש במתקן SpeedVac. גלולת המטבוליטים המיובשת שנוצרה אוחסנה ב-80°C- עד לניתוח.
ניתוח כרומטוגרפיית נוזלים-ספקטרומטריית מסות של חומצות אמינו מסומנות ב-13C. עבור ניתוח כרומטוגרפיית נוזלים-ספקטרומטריית מסות (LC-MS), גלולת המטבוליט הושעת מחדש ב-75 מיקרוליטר של מים בדרגת LC-MS (Honeywell). לאחר צנטריפוגה ב-21,000 גרם למשך 5 דקות ב-4°C, 20 מיקרוליטר של הסופרנטנט המזוהם שימשו לניתוח שטף חומצות אמינו, בעוד ששאר התמצית שימשה מיד לניתוח אניונים (ראה להלן). ניתוח חומצות אמינו בוצע באמצעות פרוטוקול הנגזרות של בנזואיל כלוריד שתואר קודם לכן (55, 56). בשלב הראשון, 10 מיקרוליטר של 100 mM נתרן פחמתי (Sigma-Aldrich) נוספו ל-20 מיקרוליטר של תמצית מטבוליטים, ולאחר מכן 10 מיקרוליטר של 2% בנזואיל כלוריד (Sigma-Aldrich) נוספו ל-ACN בדרגת LC. הדגימה עברה מערבולת קצרה ולאחר מכן צנטריפוגה ב-21,000 גרם למשך 5 דקות ב-20°C. העבירו את הסופרנטנט הצלול לבקבוקון דוגם אוטומטי בנפח 2 מ"ל עם מתקן זכוכית חרוטי (נפח 200 מיקרוליטר). הדגימות נותחו באמצעות מערכת Acquity iClass בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (Waters) המחוברת לספקטרומטר מסות מדויק ברזולוציה גבוהה Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). לצורך הניתוח, 2 מיקרוליטר מהדגימה שעברה נגזרת הוזרקו לעמודת סיליקה T3 בעלת חוזק גבוה בגודל 100×1.0 מ"מ (Waters) המכילה חלקיקים בגודל 1.8 מיקרומטר. קצב הזרימה הוא 100 מיקרוליטר/דקה, ומערכת הבופר מורכבת מבופר A (10 mM אמוניום פורמט ו-0.15% חומצה פורמית במים) ובופר B (ACN). הגרדיאנט הוא כדלקמן: 0%B ב-0 דקות; 0%B. 0 עד 15% B ב-0 עד 0.1 דקות; 15 עד 17% B ב-0.1 עד 0.5 דקות; B ב-17 עד 55% ב-0.5 עד 14 דקות; B ב-55 עד 70% ב-14 עד 14.5 דקות; ב-14.5 עד 70 עד 100% B ב-18 דקות; 100% B ב-18 עד 19 דקות; 100 עד 0% B ב-19 עד 19.1 דקות; 0% B ב-19.1 עד 28 דקות (55, 56). ספקטרומטר המסה QE-HF פועל במצב יינון חיובי עם טווח מסות של m/z (יחס מסה/מטען) של 50 עד 750. הרזולוציה המיושמת היא 60,000, ומטרה של בקרת הגבר (AGC) המתקבלת היא 3×106, וזמן היונים המרבי הוא 100 מילישניות. מקור יינון האלקטרוספרייס המחומם (ESI) פועל במתח ריסוס של 3.5 קילו-וולט, טמפרטורת קפילרית של 250°C, זרימת אוויר במעטפת של 60 יחידות אסטרונומיות (AU) (יחידות שרירותיות) וזרימת אוויר עזר של 20 יחידות אסטרונומיות (AU). 250°C. עדשת S מכוונה ל-60 יחידות אסטרונומיות.
אנליזת כרומטוגרפיית אניונים-MS של חומצות אורגניות מסומנות ב-13C. משקעי המטבוליט הנותרים (55 מיקרוליטר) נותחו באמצעות מערכת כרומטוגרפיית יונים Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) המחוברת לספקטרומטר מסות QE-HF (Thermo Fisher Scientific). בקצרה, 5 מיקרוליטר של תמצית מטבוליטים הוזרקו לעמודת Dionex IonPac AS11-HC המצוידת ב-HPLC (2 מ"מ × 250 מ"מ, גודל חלקיקים 4 מיקרומטר, Thermo Fisher Scientific) במצב לולאה חלקית עם יחס מילוי של 1. עמודת הגנה Dionex IonPac AG11-HC (2 מ"מ x 50 מ"מ, 4 מיקרומטר, Thermo Fisher Scientific). טמפרטורת העמודה נשמרת על 30°C, והדגם האוטומטי מכוון ל-6°C. השתמשו במחסנית אשלגן הידרוקסיד המסופקת עם מים מזוקקים כדי ליצור גרדיאנט אשלגן הידרוקסיד דרך מחולל הנוזל. הפרדת מטבוליטים בקצב זרימה של 380 מיקרוליטר/דקה, תוך יישום הגרדיאנט הבא: 0 עד 3 דקות, 10 mM KOH; 3 עד 12 דקות, 10 עד 50 mM KOH; 12 עד 19 דקות, 50 עד 100 mM KOH; 19 עד 21 דקות, 100 mM KOH; 21 עד 21.5 דקות, 100 עד 10 mM KOH. העמודה הושבה לאיזון מחדש תחת 10 mM KOH למשך 8.5 דקות.
המטבוליטים שעברו שחרור משולבים עם זרם תוסף איזופרופנול בקצב של 150 מיקרוליטר/דקה לאחר העמודה, ולאחר מכן מופנים לספקטרומטר מסות ברזולוציה גבוהה הפועל במצב יינון שלילי. הספקטרומטר המסה (MS) מנטר את טווח המסות מ-m/z 50 עד 750 ברזולוציה של 60,000. ה-AGC מוגדר ל-1×106, וזמן היונים המרבי נשמר על 100 מילישניות. מקור ה-ESI המחומם הופעל במתח ריסוס של 3.5 קילו-וולט. הגדרות אחרות של מקור היונים הן כדלקמן: טמפרטורת קפילר 275°C; זרימת גז מעטפת, 60 יחידות יינון; זרימת גז עזר, 20 יחידות יינון ב-300°C, והגדרת עדשת S ל-60 יחידות יינון.
ניתוח נתונים של מטבוליטים המסומנים ב-13C. השתמשו בתוכנת TraceFinder (גרסה 4.2, Thermo Fisher Scientific) לניתוח נתונים של יחס האיזוטופים. זהות כל תרכובת אומתה על ידי תרכובת ייחוס אמינה ונותחה באופן עצמאי. על מנת לבצע ניתוח העשרה איזוטופית, חולץ שטח כרומטוגרמת היונים (XIC) של כל איזוטופ 13C (Mn) מ-[M + H]+, כאשר n הוא מספר הפחמן של תרכובת המטרה, המשמש לניתוח חומצות אמינו או [MH]+ משמש לניתוח אניונים. דיוק המסה של XIC הוא פחות מחמישה חלקים למיליון, ודיוק ה-RT הוא 0.05 דקות. ניתוח ההעשרה מתבצע על ידי חישוב היחס של כל איזוטופ שזוהה לסכום כל האיזוטופים של התרכובת המתאימה. יחסים אלה ניתנים כערכים באחוזים עבור כל איזוטופ, והתוצאות מבוטאות כאחוז העשרה מולרי (MPE), כמתואר קודם לכן (42).
גלולת הנוירון הקפואה עברה הומוגניזציה במתנול קר כקרח 80% (v/v), עורבבה בוורטקס והודגרה ב-20°C- למשך 30 דקות. ערבבו שוב את הדגימה בוורטקס וערבבו ב-4°C+ למשך 30 דקות. הדגימה סורכזה ב-21,000 גרם למשך 5 דקות ב-4°C, ולאחר מכן נאסף הנוזל העליוני שנוצר ויובש באמצעות מרכז SpeedVac ב-25°C לצורך ניתוח נוסף. כפי שתואר לעיל, בוצע ניתוח LC-MS על חומצות האמינו של התאים הממוינים. באמצעות TraceFinder (גרסה 4.2, Thermo Fisher Scientific), בוצע ניתוח נתונים תוך שימוש במסה המונואיזוטופית של כל תרכובת. נרמול כמותי של נתוני מטבוליטים בוצע באמצעות חבילת התוכנה preprocessCore (57).
הכנת פרוסה. העכבר הורדם במהירות בפחמן דו-חמצני וראשו נערף, המוח הוצא במהירות מהגולגולת, וסכין רוטטת מלאה בקרח (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, גרמניה) שימשה לחיתוך שלו לחתכים סגיטליים של 300 עד 375 מיקרומטר. גיזוז פחמן קר (95% O2 ו-5% CO2). ריכוז נמוך של Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נתרן פוספט בופר, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-גלוקוז, 1.0 mM CaCl2 ו-6.0 mM MgCl2. התאם ל-pH 7.4 ול-310 עד 330 mOsm). העבירו את פרוסות המוח שהתקבלו לתא המכיל Ca2 + ACSF גבוה יותר (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נתרן פוספט בופר, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-גלוקוז, 4.0 mM CaCl2 ו- mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ו- 310 עד 320 mOsm). אחסנו את הפרוסות למשך 20 עד 30 דקות כדי שניתן יהיה לשחזר אותן לפני ההקלטה.
הקלטה. לכל ההקלטות נעשה שימוש במיקרוסקופ המצויד בתא הקלטה קבוע ועדשת טבילה במים פי 20 (Scientifica). תאי פורקינג'ה המשוערים זוהו לפי (i) גודל הגוף, (ii) מיקום אנטומי של המוח הקטן, ו-(iii) ביטוי של גן הדיווח הפלואורסצנטי mtYFP. פיפטת הטלאי עם התנגדות קצה של 5 עד 11 מגה-אוהם נשלפת החוצה באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט (GB150-10, 0.86 מ"מ × 1.5 מ"מ × 100 מ"מ, Science Products, Hofheim, גרמניה) ופיפטה אופקית של Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). כל ההקלטות בוצעו על ידי מגבר הלחמה ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, גרמניה), אשר נשלט על ידי התוכנה Signal (גרסה 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, בריטניה). הניסוי הוקלט בקצב דגימה של 12.5 קילו-הרץ. האות מסונן באמצעות שני מסנני בסל קצרי מעבר עם תדרי חיתוך של 1.3 ו-10 קילוהרץ בהתאמה. הקיבול של הממברנה והפיפטה מפוצה על ידי מעגל פיצוי באמצעות המגבר. כל הניסויים בוצעו תחת שליטה של ​​מצלמת Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Germany), אשר נשלטה על ידי תוכנת Hokawo (גרסה 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany).
קונפיגורציה וניתוח שגרתיים של תא שלם. מיד לפני הרישום, מלאו את הפיפטה בתמיסה הפנימית המכילה את החומרים הבאים: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM אשלגן גלוקונאט, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM גואנוזין טריפוספט (GTP) (Na) ו-10.0 mM קריאטינין פוספט הותאמו ל-pH 7.25, והלחץ האוסמוטי היה 290 mOsm (סוכרוז). מיד לאחר הפעלת כוח של 0 pA כדי לקרוע את הממברנה, נמדד פוטנציאל הממברנה במנוחה. התנגדות הקלט נמדדת על ידי הפעלת זרמים היפרפולריים של -40, -30, -20 ו- -10 pA. מדדו את גודל תגובת המתח והשתמשו בחוק אוהם כדי לחשב את התנגדות הקלט. פעילות ספונטנית נרשמה במדיד מתח למשך 5 דקות, ו-sPSC זוהה ונמדד בתוכנת Igor Pro (גרסה 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) באמצעות סקריפט זיהוי חצי אוטומטי. עקומת IV וזרם המצב היציב נמדדים על ידי הידוק הסוללה בפוטנציאלים שונים (החל מ-110-mV) והגדלת המתח בצעדים של 5 mV. ייצור ה-AP נבדק על ידי הפעלת זרם דה-פולריזציה. הידק את התא ב-70-mV תוך הפעלת פולס זרם דה-פולריזציה. התאם את גודל הצעד של כל יחידת הקלטה בנפרד (10 עד 60 pA). חשב את תדר ה-AP המקסימלי על ידי ספירה ידנית של קפיצות הפולס הגורמות לתדר ה-AP הגבוה ביותר. סף ה-AP מנותח באמצעות הנגזרת השנייה של פולס הדה-פולריזציה שמפעיל תחילה AP אחד או יותר.
הגדרת וניתוח של טלאי מחורר. בצע רישום טלאי מחורר באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. השתמש בפיפטה נטולת ATP ו-GTP שאינה מכילה את המרכיבים הבאים: 128 mM גלוקונאט K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA ו-2 mM MgCl2, והתאם ל-pH 7.2 (באמצעות KOH). ATP ו-GTP מושמטים מהתמיסה התוך-תאית כדי למנוע חדירות בלתי מבוקרת של קרום התא. פיפטת הטלאי ממולאת בתמיסה פנימית המכילה אמפוטריצין (כ-200 עד 250 מיקרוגרם/מ"ל; G4888, Sigma-Aldrich) כדי לקבל רישום טלאי מחורר. אמפוטריצין הומס בדימתיל סולפוקסיד (ריכוז סופי: 0.1 עד 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). לריכוז ה-DMSO בו נעשה שימוש לא הייתה השפעה משמעותית על הנוירונים שנחקרו. במהלך תהליך הניקוב, התנגדות הערוץ (Ra) נוטרה באופן רציף, והניסוי החל לאחר שהאמפליטודה של Ra ו-AP התייצבה (20-40 דקות). הפעילות הספונטנית נמדדה במחבר מתח ו/או זרם למשך 2 עד 5 דקות. ניתוח הנתונים בוצע באמצעות Igor Pro (גרסה 7.05.2, WaveMetrics, ארה"ב), Excel (גרסה 2010, Microsoft Corporation, Redmond, ארה"ב) ו-GraphPad Prism (גרסה 8.1.2, GraphPad Software Inc., לה ג'ולה, קליפורניה). ארצות הברית). על מנת לזהות APs ספונטניים, נעשה שימוש בתוסף NeuroMatic v3.0c של IgorPro. זיהוי אוטומטי של APs מתבצע באמצעות סף נתון, המותאם באופן אינדיבידואלי עבור כל רשומה. באמצעות מרווח הקפיצות, קבע את תדירות הקפיצות עם תדירות הקפיצות הרגעית המקסימלית ותדירות הקפיצות הממוצעת.
בידוד PN. על ידי התאמה לפרוטוקול שפורסם בעבר, PNs טוהרו ממוח הקטן של עכבר בשלב מוגדר (58). בקצרה, המוח הקטן נותח ונחתך במדיום דיסוציאציה קר כקרח [ללא HBSS Ca2+ ו-Mg2+, בתוספת 20 mM גלוקוז, פניצילין (50 יחידות/מ"ל) וסטרפטומיצין (0.05 מ"ג/מ"ל)], ולאחר מכן עוכל המדיום בפפאין [HBSS, בתוספת 1-ציסטאין·HCl (1 מ"ג/מ"ל), פפאין (16 יחידות/מ"ל) ודאוקסיריבונוקלאז I (DNase I; 0.1 מ"ג/מ"ל)]. טיפול במשך 30 דקות ב-30°C. תחילה יש לשטוף את הרקמות במדיום HBSS המכיל ריר ביצים (10 מ"ג/מ"ל), BSA (10 מ"ג/מ"ל) ו-DNase (0.1 מ"ג/מ"ל) בטמפרטורת החדר כדי למנוע עיכול אנזימטי, ולאחר מכן במדיום HBSS המכיל 20 mM גלוקוז. טחינה עדינה של HBSS, פניצילין (50 יחידות/מ"ל), סטרפטומיצין (0.05 מ"ג/מ"ל) ו-DNase (0.1 מ"ג/מ"ל) משחררים תאים בודדים. תרחיף התאים שנוצר סונן דרך מסננת תאים בקוטר 70 מיקרומטר, לאחר מכן התאים גורפו לצנטריפוגה (1110 סל"ד, 5 דקות, 4°C) והושענו מחדש במדיום מיון [HBSS, בתוספת 20 mM גלוקוז, 20% סרום עוברי בקר], פניצילין (50 יחידות/מ"ל) וסטרפטומיצין (0.05 מ"ג/מ"ל)]; יש להעריך את כדאיות התאים בעזרת פרופידיום יודיד ולהתאים את צפיפות התאים ל-1×106 עד 2×106 תאים/מ"ל. לפני ציטומטריית הזרימה, התרחיף סונן דרך מסננת תאים בקוטר 50 מיקרומטר.
ציטומטר זרימה. מיון תאים בוצע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות מכונת FACSAria III (BD Biosciences) ותוכנת FACSDiva (BD Biosciences, גרסה 8.0.1). תרחיף התאים מוין באמצעות זרבובית של 100 מיקרון תחת לחץ של 20 psi בקצב של כ-2800 אירועים/שנייה. מכיוון שקריטריונים מסורתיים של שער (גודל תא, הבחנה בימודלית ומאפייני פיזור) אינם יכולים להבטיח בידוד נכון של PN מסוגי תאים אחרים, אסטרטגיית השער נקבעת על סמך השוואה ישירה של עוצמת ה-YFP והאוטופלואורסצנציה בעכברי mitoYFP+ ​​ובעכברי mitoYFP − בקבוצת הביקורת. YFP מעורר על ידי הקרנת הדגימה עם קו לייזר של 488 ננומטר, והאות מזוהה באמצעות מסנן מעביר פס של 530/30 ננומטר. בעכברי mitoYFP+, החוזק היחסי של גן הדיווח Rosa26-mitoYFP משמש גם להבחנה בין שברי גוף עצב ואקסון. 7-AAD מעורר באמצעות לייזר צהוב של 561 ננומטר ומזוהה באמצעות מסנן מעביר פס של 675/20 ננומטר כדי להוציא תאים מתים. על מנת להפריד אסטרוציטים בו זמנית, תרחיף התאים נצבע ב-ACSA-2-APC, לאחר מכן הדגימה הוקרנה באמצעות קו לייזר של 640 ננומטר, ומסנן מעביר פס של 660/20 ננומטר שימש לגילוי האות.
התאים שנאספו עברו צנטריפוגה (1110 סל"ד, 5 דקות, 4°C) ואוחסנו ב-80°C- עד לשימוש. עכברי Mfn2cKO וגורי ההמלטה שלהם סווגו באותו היום כדי למזער את השונות הפרוצדורלית. הצגת וניתוח נתוני FACS בוצעו באמצעות תוכנת FlowJo (FlowJo LLC, אשלנד, אורגון, ארה"ב).
כפי שצוין לעיל (59), PCR בזמן אמת משמש לבידוד DNA מהנוירונים הממוינים לצורך כימות mtDNA לאחר מכן. הלינאריות ורגישות הסף נבדקו בתחילה על ידי הרצת qPCR על מספרים שונים של תאים. בקצרה, אספו 300 PN בבופר ליזיס המורכב מ-50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 ופרוטאינאז K (200 ng/ml) ודגרו ב-55°C למשך 120 דקות. התאים הודגרו שוב ב-95°C למשך 10 דקות כדי להבטיח השבתה מלאה של פרוטאינאז K. באמצעות גלאי TaqMan (Thermo Fisher) ספציפי ל-mt-Nd1, mtDNA נמדד על ידי PCR חצי כמותי במערכת PCR בזמן אמת 7900HT (Thermo Fisher Scientific). גנים כמו Science, מספר קטלוגי Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, מספר קטלוגי AIVI3E8) ו-18S (Thermo Fisher Scientific, מספר קטלוגי Hs99999901_s1).
הכנת דגימת פרוטאום. על ידי חימום התמיסה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וביצוע סוניקציה, בבופר ליזיס [6 M גואנידין כלוריד, 10 mM טריס(2-קרבוקסיואתיל) פוספין הידרוכלוריד, 10 mM כלוראצטמיד ו-100 mM טריס- ליז כדורי נוירונים קפואים ב-HCl]. ב-Bioruptor (Diagenode) למשך 10 דקות (30 שניות דופק / 30 שניות הפסקה). הדגימה דוללה 1:10 ב-20 mM טריס-HCl (pH 8.0), עורבבה עם 300 ננוגרם טריפסין זהב (Promega), והודגרה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס להשגת עיכול מלא. ביום השני, הדגימה נצנטריפוגה ב-20,000 גרם למשך 20 דקות. הנוזל העליון דולל ב-0.1% חומצה פורמית, והתמיסה הוסרה ממלח באמצעות StageTips תוצרת בית. הדגימה יובשה במכשיר SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הפפטיד הושעה בחומצה פורמית 0.1%. כל הדגימות הוכנו בו זמנית על ידי אותו אדם. על מנת לנתח דגימות אסטרוציטים, 4 מיקרוגרם פפטידים מותלים סומנו באמצעות תג מסה טנדם (TMT10plex, מספר קטלוגי 90110, Thermo Fisher Scientific) עם יחס פפטיד לריאגנטי TMT של 1:20. לסימון TMT, 0.8 מ"ג של ריאגנט TMT הושעה מחדש ב-70 מיקרוליטר של ACN נטול מים, והפפטיד המיובש הורכב מחדש ב-9 מיקרוליטר של 0.1 M TEAB (טריאתילאמוניום ביקרבונט), שאליו נוספו 7 מיקרוליטר של ריאגנט TMT ב-ACN. הריכוז היה 43.75%. לאחר 60 דקות של דגירה, התגובה דוממה עם 2 מיקרוליטר של הידרוקסילאמין 5%. הפפטידים המסומנים נאספו, יובשו, הותלו מחדש ב-200 מיקרוליטר של חומצה פורמית (FA) 0.1%, חולקו לשניים, ולאחר מכן הותלו באמצעות StageTips תוצרת בית. באמצעות כרומטוגרף נוזלי בעל ביצועים גבוהים במיוחד מדגם UltiMate 3000 (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), אחד משני החצאים חולק על עמודה כרומטוגרפית Acquity בגודל 1 מ"מ x 150 מ"מ מלאה בחלקיקי C18 בגודל 130Å1.7 מיקרומטר (Waters, מספר קטלוגי: 186006935). Thermo Fisher Scientific). הפרידו פפטידים בקצב זרימה של 30 מיקרוליטר/דקה, הפרידו מבופר B מ-1% ל-50% למשך 85 דקות עם שיפוע מדורג של 96 דקות, מ-50% ל-95% בופר B למשך 3 דקות, ולאחר מכן 8 דקות עבור בופר B מ-95%. בופר A הוא 5% ACN ו-10 mM אמוניום ביקרבונט (ABC), ובופר B הוא 80% ACN ו-10 mM ABC. אספו את השברים כל 3 דקות, שלב אותם לשתי קבוצות (1 + 17, 2 + 18 וכו') וייבשו אותם בצנטריפוגה ואקום.
ניתוח LC-MS/MS. עבור ספקטרומטריית מסות, הפפטידים (מספר r119.aq) הופרדו על עמודה אנליטית PicoFrit בקוטר 25 ס"מ ובקוטר פנימי של 75 מיקרומטר (עדשת אובייקטיבית חדשה, מספר חלק PF7508250) המצוידת במדיום ReproSil-Pur 120 C18-AQ בקוטר 1.9 מיקרומטר (Dr. Maisch, mat), השתמשו ב-EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, גרמניה). העמודה נשמרה בטמפרטורה של 50°C. בופרים A ו-B הם 0.1% חומצה פורמית במים ו-0.1% חומצה פורמית ב-80% ACN, בהתאמה. הפפטידים הופרדו מ-6% ל-31% בופר B למשך 65 דקות ומ-31% ל-50% בופר B למשך 5 דקות עם גרדיאנט של 200 nl/min. הפפטידים שעברו שחרור נותחו על ספקטרומטר מסות Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). מדידת m/z של מקטע הפפטיד מבוצעת ברזולוציה של 120,000 בטווח של 350 עד 1500 m/z. באמצעות אנרגיית התנגשות מנורמלת של 27%, המקדים החזק ביותר עם מצב מטען של 2 עד 6 נבחר עבור ביקוע באמצעות דיסוציאציה של מלכודת C באנרגיה גבוהה (HCD). זמן המחזור נקבע לשנייה אחת. ערך ה-m/z של מקטע הפפטיד נמדד במלכודת היונים באמצעות מטרת AGC הקטנה ביותר של 5×104 וזמן הזרקה מקסימלי של 86 מילישניות. לאחר הפיצול, המקדים הוצב ברשימת ההדרה הדינמית למשך 45 שניות. פפטידים המסומנים ב-TMT הופרדו על עמודת Acclaim PepMap בגודל 50 ס"מ ו-75 מיקרומטר (Thermo Fisher Scientific, מספר קטלוגי 164942), וספקטרום הנדידה נותח על ספקטרומטר מסות Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) המצויד בציוד יוני צורת גל אסימטריים בשדה גבוה (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) הפועל בשני מתחי פיצוי של -50 ו- -70 וולט. MS3 שנבחר על סמך קודמן הסנכרון משמש למדידת אות יוני דוח TMT. הפרדת הפפטידים בוצעה על EASY-nLC 1200, תוך שימוש באלוציה ליניארית של 90%, עם ריכוז בופר של 6% עד 31%; בופר A היה 0.1% FA, ובופר B היה 0.1% FA ו-80% ACN. העמודה האנליטית מופעלת ב-50°C. השתמש ב-FreeStyle (גרסה 1.6, Thermo Fisher Scientific) כדי לפצל את הקובץ המקורי בהתאם למתח הפיצוי של FAIMS.
זיהוי וכימות חלבונים. באמצעות מנוע החיפוש המשולב של Andromeda, הנתונים המקוריים נותחו באמצעות MaxQuant גרסה 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). בנוסף לרצפי Cre recombinase ו-YFP שהתקבלו מ-Aequorea victoria, נבדקה ספקטרום של מקטעי פפטיד עבור הרצף הקנוני ורצף האיזופורם של פרוטאום הייחוס של עכבר (Proteome ID UP000000589, שהורד מ-UniProt במאי 2017). חמצון מתיונין ואצטילציה של חלבון N-טרמינלי נקבעו כמודיפיקציות משתנות; מתילציה של ציסטאין קרבמויל נקבעה כמודיפיקציות קבועות. פרמטרי העיכול נקבעו ל-"ספציפיות" ו-"טריפסין/P". המספר המינימלי של פפטידים ופפטידים מסוג Razor המשמשים לזיהוי חלבונים הוא 1; המספר המינימלי של פפטידים ייחודיים הוא 0. בתנאי התאמת מפת פפטידים, קצב זיהוי החלבון היה 0.01. האפשרות "פפטיד שני" מופעלת. השתמשו באפשרות "התאמה בין ריצות" כדי להעביר זיהויים מוצלחים בין קבצים מקוריים שונים. השתמשו ב-LFQ minimum ratio count 1 עבור כימות ללא תוויות (LFQ) (60). עוצמת LFQ מסוננת עבור לפחות שני ערכים תקפים בקבוצת גנוטיפ אחת לפחות בכל נקודת זמן, ומחושבת מהתפלגות נורמלית ברוחב של 0.3 וזזה למטה 1.8. השתמשו בפלטפורמת המחשוב Perseus (https://maxquant.net/perseus/) וב-R (https://r-project.org/) כדי לנתח את תוצאות LFQ. מבחן t דו-כיווני מתון מחבילת התוכנה limma שימש לניתוח ביטוי דיפרנציאלי (61). ניתוח נתונים חקרני בוצע באמצעות ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ו-pheatmap. נתוני הפרוטאומיקה מבוססי TMT נותחו באמצעות MaxQuant גרסה 1.6.10.43. חפש נתוני פרוטאומיקה גולמיים ממאגר הפרוטאומיקה האנושי של UniProt, שהורד בספטמבר 2018. הניתוח כולל את גורם תיקון טוהר האיזוטופים שסופק על ידי היצרן. השתמש ב-limma ב-R לניתוח ביטוי דיפרנציאלי. הנתונים המקוריים, תוצאות חיפוש מסד הנתונים וזרימת העבודה והתוצאות של ניתוח הנתונים מאוחסנים כולם בברית ProteomeXchange דרך מאגר השותפים של PRIDE עם מזהה מערך הנתונים PXD019690.
הערות פונקציונליות מעשירות את הניתוח. כלי Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) שימש לקביעת עושר מונחי ההערות הפונקציונליות של מערך הנתונים לאחר 8 שבועות (איור 1). בקצרה, רשימת החלבונים הכמותית שהתקבלה מניתוח נתונים של LC-MS/MS (ספקטרומטריית מסות טנדם) משמשת עם קריטריוני הסינון הבאים: Mus musculus נבחר כמין ורקע, והקטגוריה מציגה את ערך ה-P המותאם על ידי בנג'מיני עבור העשרה של 0.05 או פחות שנחשבת משמעותית. עבור גרף זה, מוצגות חמש קטגוריות העודף המובילות בכל אשכול בהתבסס על ערך ה-P המותאם. באמצעות מבחן t מרובה, תוך שימוש בתוכנית הגברה ליניארית דו-שלבית של בנג'מיני, קריגר ויקותיאלי (Q = 5%), מבוצע ניתוח ביטוי חלבון לאורך זמן על המועמדים החשובים שזוהו בכל קטגוריה, וכל שורה מנותחת בנפרד. אין צורך לאמץ סטיית תקן עקבית.
על מנת להשוות את תוצאות המחקר הזה עם מאגרי מידע שפורסמו וליצור דיאגרמת ון באיור 1, שילבנו את רשימת החלבונים הכמותית עם הערות MitoCarta 2.0 (24). השתמשו בכלי המקוון Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) כדי ליצור את הדיאגרמה.
למידע מפורט על ההליכים הסטטיסטיים המשמשים לניתוח פרוטאומיקה, אנא עיינו בסעיף המתאים ב"חומרים ושיטות". עבור כל שאר הניסויים, ניתן למצוא מידע מפורט במקרא המתאים. אלא אם כן צוין אחרת, כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM, וכל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת GraphPad Prism 8.1.2.
לחומרים משלימים למאמר זה, אנא עיינו בכתובת http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
זהו מאמר גישה פתוחה המופץ תחת תנאי רישיון Creative Commons Attribution-Non-Commercial, המאפשר שימוש, הפצה ורבייה בכל מדיום, כל עוד השימוש הסופי אינו למטרות רווח מסחרי וההנחה היא שהיצירה המקורית נכונה. הפניה.
הערה: אנו מבקשים שתספקו את כתובת הדוא"ל שלכם רק כדי שהאדם שאתם ממליצים עליו לדף ידע שאתם רוצים שהוא יראה את האימייל ושזה אינו ספאם. לא נאסוף כתובות דוא"ל.
שאלה זו משמשת לבדיקת האם אתה מבקר ולמניעת שליחת דואר זבל אוטומטי.
מאת E. Motori, I. Atanasov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. לרסון
ניתוח פרוטאומיקה של נוירונים לא מתפקדים גילה כי תוכניות מטבוליות מופעלות כדי לנטרל ניוון עצבי.
מאת E. Motori, I. Atanasov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. לרסון
ניתוח פרוטאומיקה של נוירונים לא מתפקדים גילה כי תוכניות מטבוליות מופעלות כדי לנטרל ניוון עצבי.
©2020 האגודה האמריקאית לקידום המדע. כֹּל הַזְכוּיוֹת שְׁמוּרוֹת. AAAS הוא שותף של HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ו-COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.