המאמר הוא חלק מנושא המחקר "טכנולוגיות ביו-רמדיאציה מתקדמות ותהליכי מיחזור של תרכובות אורגניות סינתטיות (SOC). צפה בכל 14 המאמרים.
פחמימנים ארומטיים פוליציקליים (PAHs) בעלי משקל מולקולרי נמוך, כגון נפתלין ונפתלנים מוחלפים (מתילנפתלין, חומצה נפתואית, 1-נפתיל-N-מתילקרבמט וכו'), נמצאים בשימוש נרחב בתעשיות שונות והם גנוטוקסיים, מוטגניים ו/או מסרטנים לאורגניזמים. תרכובות אורגניות סינתטיות (SOCs) או קסנוביוטיקה אלו נחשבות למזהמים בעלי עדיפות גבוהה ומהווים איום חמור על הסביבה העולמית ועל בריאות הציבור. עוצמת הפעילות האנושית (למשל, גיזוז פחם, זיקוק נפט, פליטות כלי רכב ויישומים חקלאיים) קובעת את הריכוז, הגורל וההובלה של תרכובות נפוצות ועמידות אלו. בנוסף לשיטות טיפול/הסרה פיזיקליות וכימיות, טכנולוגיות ירוקות וידידותיות לסביבה כגון ביורמדיציה, המשתמשות במיקרואורגניזמים המסוגלים לפרק לחלוטין POCs או להמיר אותם לתוצרי לוואי לא רעילים, צצו כחלופה בטוחה, חסכונית ומבטיחה. מיני חיידקים שונים השייכים לקבוצת החיידקים Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia, and Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus and Paenibacillus), ו- Actinobacteria (Rhodococcus and Arthrobacter) במיקרוביוטה של ​​הקרקע הדגימו את היכולת לפרק תרכובות אורגניות שונות. מחקרים מטבוליים, גנומיקה וניתוח מטאגנומי עוזרים לנו להבין את המורכבות והגיוון הקטבוליים הקיימים בצורות חיים פשוטות אלו, אשר ניתן ליישם עוד יותר לצורך פירוק ביולוגי יעיל. קיומם ארוך הטווח של PAHs הביא להופעתם של פנוטיפים חדשים של פירוק באמצעות העברת גנים אופקית באמצעות אלמנטים גנטיים כגון פלסמידים, טרנספוזונים, בקטריופאג'ים, איים גנומיים ואלמנטים מצמידים אינטגרטיביים. ביולוגיה של מערכות והנדסה גנטית של מבודדים ספציפיים או קהילות מודל (קונסורציומים) יכולות לאפשר ביורמדיאציה מקיפה, מהירה ויעילה של PAHs אלו באמצעות השפעות סינרגטיות. בסקירה זו, אנו מתמקדים במסלולים המטבוליים השונים ובמגוון, בהרכב ובמגוון הגנטי, ובתגובות/התאמות תאיות של חיידקים המפרקים נפתלין וחיידקים שהוחלפו בהם. מידע זה יספק מידע אקולוגי ליישום בשטח ואופטימיזציה של זנים לצורך ביו-רמדיאציה יעילה.
פיתוח מהיר של תעשיות (פטרוכימיה, חקלאות, תרופות, צבעי טקסטיל, קוסמטיקה וכו') תרם לשגשוג כלכלי עולמי ולשיפור רמת החיים. התפתחות אקספוננציאלית זו הביאה לייצור מספר רב של תרכובות אורגניות סינתטיות (SOCs), המשמשות לייצור מוצרים שונים. תרכובות זרות אלו, או SOCs, כוללות פחמימנים ארומטיים רב-ציקליים (PAHs), חומרי הדברה, קוטלי עשבים, פלסטייזרים, צבעים, תרופות, פוספטים אורגניים, מעכבי בעירה, ממסים אורגניים נדיפים וכו'. הן נפלטות לאטמוספרה, למערכות אקולוגיות מימיות ויבשתיות, שם יש להן השפעות רב-ממדיות, הגורמות להשפעות מזיקות על צורות ביולוגיות שונות באמצעות שינוי תכונות פיזיקוכימיות ומבנה קהילתי (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). למזהמים ארומטיים רבים יש השפעות חזקות והרסניות על מערכות אקולוגיות שלמות/מוקדים חמים של מגוון ביולוגי (למשל שוניות אלמוגים, יריעות קרח ארקטיות/אנטארקטיות, אגמי הרים גבוהים, משקעים בים עמוק וכו') (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). מחקרים גיאומיקרוביולוגיים שנערכו לאחרונה הראו כי שקיעת חומר אורגני סינתטי (למשל מזהמים ארומטיים) ונגזרותיהם על פני השטח של מבנים מלאכותיים (סביבה בנויה) (למשל אתרי מורשת תרבותית ואנדרטאות עשויות גרניט, אבן, עץ ומתכת) מאיצה את פירוקם (Gadd 2017; Liu et al. 2018). פעילויות אנושיות יכולות להגביר ולהחמיר את הפירוק הביולוגי של מונומנטים ומבנים באמצעות זיהום אוויר ושינויי אקלים (Liu et al. 2020). מזהמים אורגניים אלה מגיבים עם אדי מים באטמוספירה ושוקעים על המבנה, וגורמים לפירוק פיזי וכימי של החומר. פירוק ביולוגי מוכר באופן נרחב כשינויים לא רצויים במראה ובתכונות של חומרים הנגרמים על ידי אורגניזמים חיים ומשפיעים על שימורם (Pochon and Jaton, 1967). פעולה מיקרוביאלית נוספת (מטבוליזם) של תרכובות אלו יכולה להפחית את שלמות המבנה, את יעילות השימור ואת הערך התרבותי (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). מצד שני, במקרים מסוימים, נמצא כי הסתגלות מיקרוביאלית ותגובה אליהם מועילים, שכן הם יוצרים ביופילמים וקרום מגן אחר המפחית את קצב הריקבון/הפירוק (Martino, 2016). לכן, פיתוח אסטרטגיות שימור בנות קיימא ויעילות לטווח ארוך עבור מונומנטים מאבן, מתכת ועץ דורש הבנה מעמיקה של התהליכים המרכזיים המעורבים בתהליך זה. בהשוואה לתהליכים טבעיים (תהליכים גיאולוגיים, שריפות יער, התפרצויות געשיות, תגובות צמחיות וחיידקיות), פעילויות אנושיות גורמות לשחרור כמויות גדולות של פחמימנים ארומטיים רב-מחזוריים (PAHs) ופחמן אורגני אחר (OC) למערכות אקולוגיות. PAHs רבים המשמשים בחקלאות (קוטלי חרקים וחומרי הדברה כגון DDT, אטרזין, קרבריל, פנטכלורופנול וכו'), בתעשייה (נפט גולמי, בוצה/פסולת נפט, פלסטיק שמקורו בנפט, PCBs, פלסטייזרים, חומרי ניקוי, חומרי חיטוי, חומרי אידוי, בישום וחומרים משמרים), מוצרי טיפוח אישי (קרמי הגנה, חומרי חיטוי, דוחי חרקים ומושק פוליצילי) וחומרי תחמושת (חומרי נפץ כגון 2,4,6-TNT) הם קסנוביוטיקה פוטנציאלית שעשויה להשפיע על בריאות כדור הארץ (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna and Phale, 2008; Petrie et al., 2015). ניתן להרחיב רשימה זו כך שתכלול תרכובות שמקורן בנפט (שמני דלק, חומרי סיכה, אספלטן), ביו-פלסטיק בעל משקל מולקולרי גבוה ונוזלים יוניים (Amde et al., 2015). טבלה 1 מפרטת מזהמים ארומטיים שונים ויישומיהם בתעשיות שונות. בשנים האחרונות, פליטות אנתרופוגניות של תרכובות אורגניות נדיפות, כמו גם פחמן דו-חמצני וגזי חממה אחרים, החלו לעלות (Dvorak et al., 2017). עם זאת, ההשפעות האנתרופוגניות עולות משמעותית על אלו הטבעיות. בנוסף, מצאנו כי מספר תרכובות אורגניות נדיפות קיימות בסביבות סביבתיות רבות וזוהו כמזהמים מתפתחים בעלי השפעות שליליות על ביומות (איור 1). סוכנויות סביבתיות כמו הסוכנות להגנת הסביבה של ארצות הברית (USEPA) כללו רבים מהמזהמים הללו ברשימת העדיפויות שלהן בשל תכונותיהם הציטוטוקסיות, הגנוטוקסיות, המוטגניות והמסרטנות. לכן, יש צורך בתקנות סילוק מחמירות ואסטרטגיות יעילות לטיפול/סילוק פסולת ממערכות אקולוגיות מזוהמות. שיטות טיפול פיזיקליות וכימיות שונות כגון פירוליזה, טיפול תרמי חמצוני, אוורור אוויר, הטמנה, שריפה וכו' אינן יעילות ויקרות ומייצרות תוצרי לוואי קורוזיביים, רעילים וקשים לטיפול. עם המודעות הסביבתית העולמית הגוברת, מיקרואורגניזמים המסוגלים לפרק מזהמים אלה ונגזרותיהם (כגון הלוגנים, ניטרו, אלקיל ו/או מתיל) מושכים תשומת לב גוברת (Fennell et al., 2004; Haritash and Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). לשימוש במיקרואורגניזמים מקומיים אלה, לבדם או בתרבויות מעורבות (מושבות) להסרת מזהמים ארומטיים, יש יתרונות מבחינת בטיחות סביבתית, עלות, יעילות, אפקטיביות וקיימות. חוקרים בוחנים גם את השילוב של תהליכים מיקרוביאליים עם שיטות חיזור אלקטרוכימיות, כלומר מערכות ביו-אלקטרוכימיות (BES), כטכנולוגיה מבטיחה לטיפול/הסרת מזהמים (Huang et al., 2011). טכנולוגיית BES משכה תשומת לב גוברת בשל יעילותה הגבוהה, עלותה הנמוכה, בטיחותה הסביבתית, פעולתה בטמפרטורת החדר, חומרים ביולוגיים תואמים ויכולתה להחזיר תוצרי לוואי יקרי ערך (למשל, חשמל, דלק וכימיקלים) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). הופעתם של כלים/שיטות ריצוף גנום ואומיקה בעלי תפוקה גבוהה סיפקה שפע של מידע חדש על הרגולציה הגנטית, פרוטאומיקה ופלוקסומיקה של תגובות של מיקרואורגניזמים מפרקים שונים. שילוב כלים אלה עם ביולוגיה של מערכות שיפר עוד יותר את הבנתנו את הבחירה והכוונון העדין של מסלולים קטבוליים מטרה במיקרואורגניזמים (כלומר, תכנון מטבולי) כדי להשיג פירוק ביולוגי יעיל ואפקטיבי. כדי לתכנן אסטרטגיות ביורמדיאציה יעילות באמצעות מיקרואורגניזמים מועמדים מתאימים, עלינו להבין את הפוטנציאל הביוכימי, הגיוון המטבולי, ההרכב הגנטי והאקולוגיה (אוטואקולוגיה/סינקולוגיה) של מיקרואורגניזמים.
איור 1. מקורות ומסלולים של PAHs בעלי מולקולות נמוכות דרך סביבות סביבתיות שונות וגורמים שונים המשפיעים על הביוטה. קווים מקווקווים מייצגים אינטראקציות בין אלמנטים של המערכת האקולוגית.
בסקירה זו, ניסינו לסכם את הנתונים על פירוק של PAHs פשוטים כגון נפתלין ונפתלין שהוחלפו על ידי מגוון חיידקים מבודד, הכוללים מסלולים מטבוליים ומגוון, אנזימים המעורבים בפירוק, הרכב/תוכן גנים ומגוון, תגובות תאיות והיבטים שונים של ביורמדיאציה. הבנת הרמות הביוכימיות והמולקולריות תסייע בזיהוי זני מארח מתאימים ובהנדסה גנטית נוספת שלהם לצורך ביורמדיאציה יעילה של מזהמים בעלי עדיפות גבוהה כאלה. זה יסייע בפיתוח אסטרטגיות להקמת קונסורציומים חיידקיים ספציפיים לאתר לצורך ביורמדיאציה יעילה.
נוכחותם של מספר רב של תרכובות ארומטיות רעילות ומסוכנות (העונות על כלל האקל 4n + 2π אלקטרונים, n = 1, 2, 3, ...) מהווה איום חמור על מגוון מדיה סביבתית כגון אוויר, קרקע, משקעים, מי שטח ומי תהום (Puglisi et al., 2007). תרכובות אלו בעלות טבעות בנזן בודדות (מונוציקליות) או טבעות בנזן מרובות (פוליציקליות) המסודרות בצורה ליניארית, זוויתית או צבירית, והן מפגינות יציבות (יציבות/חוסר יציבות) בסביבה עקב אנרגיית תהודה שלילית גבוהה ואדישות (אינרטיות), אשר ניתן להסביר על ידי ההידרופוביות והמצב המצומצם שלהן. כאשר הטבעת הארומטית מוחלפת בקבוצות מתיל (-CH3), קרבוקסיל (-COOH), הידרוקסיל (-OH) או סולפונט (-HSO3), היא הופכת ליציבה יותר, בעלת זיקה חזקה יותר למקרומולקולות, והיא ביואקומולטיבית במערכות ביולוגיות (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). כמה פחמימנים ארומטיים פוליציקליים בעלי משקל מולקולרי נמוך (LMWAHs), כגון נפתלין ונגזרותיו [מתילנפתלין, חומצה נפתואית, נפתליןסולפונט ו-1-נפתיל N-מתילקרבמט (קרבריל)], נכללו ברשימת המזהמים האורגניים בעלי עדיפות על ידי הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב כגנוטוקסיים, מוטגניים ו/או מסרטנים (Cerniglia, 1984). שחרור של סוג זה של NM-PAHs לסביבה עלול לגרום להצטברות ביולוגית של תרכובות אלה בכל רמות שרשרת המזון, ובכך להשפיע על בריאותן של מערכות אקולוגיות (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
המקורות והמסלולים של PAHs לביוטה הם בעיקר באמצעות נדידה ואינטראקציות בין רכיבים שונים של המערכת האקולוגית כגון קרקע, מי תהום, מי שטח, גידולים והאטמוספרה (Arey and Atkinson, 2003). איור 1 מציג את האינטראקציות וההתפלגות של PAHs שונים בעלי משקל מולקולרי נמוך במערכות אקולוגיות ואת מסלוליהם לחשיפה לביוטה/בני אדם. PAHs שוקעים על משטחים כתוצאה מזיהום אוויר ובאמצעות נדידה (סחיפה) של פליטות כלי רכב, גזי פליטה תעשייתיים (גיזוז פחם, בעירה וייצור קוק) ושקיעתם. פעילויות תעשייתיות כגון ייצור טקסטיל סינתטי, צבעים וצבעים; שימור עץ; עיבוד גומי; פעילויות ייצור מלט; ייצור חומרי הדברה; ויישומים חקלאיים הם מקורות עיקריים של PAHs במערכות יבשתיות ומימיות (Bamforth and Singleton, 2005; Wick et al., 2011). מחקרים הראו כי קרקעות באזורים פרבריים ועירוניים, ליד כבישים מהירים ובערים גדולות רגישות יותר לפחמימנים ארומטיים פוליציקליים (PAHs) עקב פליטות מתחנות כוח, חימום מגורים, עומסי אוויר ותנועה בכבישים ופעילויות בנייה (Suman et al., 2016). (2008) הראו כי PAHs בקרקע ליד כבישים בניו אורלינס, לואיזיאנה, ארה"ב היו גבוהות עד 7189 מיקרוגרם/ק"ג, בעוד שבשטחים פתוחים הן היו רק 2404 מיקרוגרם/ק"ג. באופן דומה, רמות PAH גבוהות עד 300 מיקרוגרם/ק"ג דווחו באזורים ליד אתרי גיזוז פחם במספר ערים בארה"ב (Kanaly and Harayama, 2000; Bamforth and Singleton, 2005). דווח כי קרקעות מערים הודיות שונות כמו דלהי (Sharma et al., 2008), אגרה (Dubey et al., 2014), מומבאי (Kulkarni and Venkataraman, 2000) ווישקפטנם (Kulkarni et al., 2014) מכילות ריכוזים גבוהים של PAHs. תרכובות ארומטיות נספגות ביתר קלות לחלקיקי קרקע, חומר אורגני ומינרלים מחימר, ובכך הופכות לבולעי פחמן עיקריים במערכות אקולוגיות (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). המקורות העיקריים של PAHs במערכות אקולוגיות מימיות הם משקעים (משקעים רטובים/יבשים ואדי מים), נגר עירוני, פריקת שפכים, מילוי מי תהום וכו' (Srogi, 2007). ההערכה היא שכ-80% מה-PAHs במערכות אקולוגיות ימיות נובעים משקעים, שקיעה ופריקת פסולת (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). ריכוזים גבוהים יותר של PAHs במים עיליים או תשטיפים מאתרי סילוק פסולת מוצקה דולפים בסופו של דבר לתהום, ומהווים איום משמעותי על בריאות הציבור מכיוון שיותר מ-70% מהאוכלוסייה בדרום ודרום מזרח אסיה שותה מי תהום (Duttagupta et al., 2019). מחקר שנערך לאחרונה על ידי Duttagupta et al. (2020) על ניתוחי נהרות (32) ומי תהום (235) ממערב בנגל, הודו, מצא כי כ-53% מהתושבים העירוניים ו-44% מהתושבים הכפריים (בסך הכל 20 מיליון תושבים) עשויים להיות חשופים לנפתלין (4.9-10.6 מיקרוגרם/ליטר) ונגזרותיו. דפוסי שימוש שונים בקרקע והפקת מי תהום מוגברת נחשבים לגורמים העיקריים השולטים בהובלה האנכית (אדבקציה) של PAHs בעלי משקל מולקולרי נמוך בתת-הקרקע. נגר חקלאי, פליטת שפכים עירוניים ותעשייתיים, ופליטת פסולת מוצקה/אשפה נמצאו כמושפעים מ-PAHs באגני נהרות ובמשקעים תת-קרקעיים. משקעים אטמוספריים מחמירים עוד יותר את זיהום PAHs. ריכוזים גבוהים של PAHs ונגזרות האלקיל שלהם (51 בסך הכל) דווחו בנהרות/אקווני ניקוז ברחבי העולם, כגון נהר פרייזר, נהר לואן, נהר דנסו, נהר מיזורי, נהר אנקוסטיה, נהר אברו ונהר דלאוור (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). בסדימנטים של אגן נהר הגנגס, נפתלין ופננתרן נמצאו כמשמעותיים ביותר (זוהו ב-70% מהדגימות) (Duttagupta et al., 2019). יתר על כן, מחקרים הראו כי כלור של מי שתייה יכול להוביל להיווצרות של PAHs מחומצנים וכלוריים רעילים יותר (Manoli and Samara, 1999). PAHs מצטברים בדגנים, פירות וירקות כתוצאה מספיגה על ידי צמחים מקרקעות מזוהמות, מי תהום ומשקעים (Fismes et al., 2002). אורגניזמים ימיים רבים כגון דגים, מולים, צדפות ושרימפס מזוהמים ב-PAHs באמצעות צריכת מזון מזוהם ומי ים, כמו גם דרך רקמות ועור (Mackay and Fraser, 2000). שיטות בישול/עיבוד כגון צלייה, צלייה, עישון, טיגון, ייבוש, אפייה ובישול על פחמים יכולות גם הן להוביל לכמויות משמעותיות של PAHs במזון. זה תלוי במידה רבה בבחירת חומר העישון, תכולת הפחמימנים הפנוליים/ארומטיים, הליך הבישול, סוג החימום, תכולת הלחות, אספקת החמצן וטמפרטורת הבעירה (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). פחמימנים ארומטיים פוליציקליים (PAHs) זוהו גם בחלב בריכוזים משתנים (0.75-2.1 מ"ג/ליטר) (Girelli et al., 2014). הצטברותם של PAHs אלו במזון תלויה גם בתכונות הפיזיקוכימיות של המזון, בעוד שהשפעותיהם הרעילות קשורות לתפקודים פיזיולוגיים, פעילות מטבולית, ספיגה, הפצה ופיזור בגוף (Mechini et al., 2011).
הרעילות וההשפעות המזיקות של פחמימנים ארומטיים רב-ציקליים (PAHs) ידועות מזה זמן רב (Cherniglia, 1984). פחמימנים ארומטיים רב-ציקליים בעלי משקל מולקולרי נמוך (LMW-PAHs) (שתיים עד שלוש טבעות) יכולים להיקשר קוולנטית למקרומולקולות שונות כגון DNA, RNA וחלבונים והם מסרטנים (Santarelli et al., 2008). בשל אופיים ההידרופובי, הם מופרדים על ידי ממברנות שומנים. בבני אדם, מונואוקסיגנאזות ציטוכרום P450 מחמצנות PAHs לאפוקסידים, שחלקם ריאקטיביים מאוד (למשל, באדיול אפוקסיד) ויכולים להוביל להפיכת תאים נורמליים לתאים ממאירים (Marston et al., 2001). בנוסף, תוצרי הטרנספורמציה של PAHs כגון כינונים, פנולים, אפוקסידים, דיולים וכו' רעילים יותר מתרכובות האם. חלק מחומרי ה-PAH וחומרי הביניים המטבוליים שלהם יכולים להשפיע על הורמונים ואנזימים שונים בחילוף החומרים, ובכך להשפיע לרעה על הגדילה, מערכת העצבים המרכזית, מערכת הרבייה והמערכת החיסונית (Swetha and Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). חשיפה לטווח קצר ל-PAHs בעלי משקל מולקולרי נמוך דווחה כגורמת לפגיעה בתפקוד הריאות ולפקקת אצל חולי אסתמה, ומגבירה את הסיכון לסרטן העור, הריאות, שלפוחית ​​השתן ומערכת העיכול (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). מחקרים בבעלי חיים הראו גם כי חשיפה ל-PAHs עלולה להיות בעלת השפעות שליליות על תפקוד הרבייה וההתפתחות, ויכולה לגרום לקטרקט, נזק לכליות ולכבד ולצהבת. תוצרי ביוטרנספורמציה שונים של PAHs כגון דיולים, אפוקסידים, כינונים ורדיקלים חופשיים (קטיונים) הוכחו כיוצרים תוצרי DNA. הוכח כי אדוקטים יציבים משנים את מנגנון שכפול ה-DNA, בעוד שאדוקטים לא יציבים יכולים לגרום לדה-פורינציה של DNA (בעיקר לאדנין ולפעמים לגואנין); שניהם יכולים לייצר שגיאות המובילות למוטציות (Schweigert et al. 2001). בנוסף, כינונים (בנזו-/פאן-) יכולים לייצר מיני חמצן פעילים (ROS), ולגרום נזק קטלני ל-DNA ולמקרומולקולות אחרות, ובכך לפגוע בתפקוד/חיוניות הרקמות (Ewa and Danuta 2017). דווח כי חשיפה כרונית לריכוזים נמוכים של פירן, ביפניל ונפתלין גורמת לסרטן בבעלי חיים ניסיוניים (Diggs et al. 2012). בשל רעילותם הקטלנית, ניקוי/הסרה של PAHs אלו מאתרים מושפעים/מזוהמים היא בעדיפות עליונה.
שיטות פיזיקליות וכימיות שונות שימשו להסרת PAHs מאתרים/סביבות מזוהמות. לתהליכים כגון שריפה, דה-כלורינציה, חמצון UV, קיבוע ומיצוי ממסים יש חסרונות רבים, כולל היווצרות תוצרי לוואי רעילים, מורכבות התהליך, בעיות בטיחות ורגולציה, יעילות נמוכה ועלות גבוהה. עם זאת, פירוק ביולוגי מיקרוביאלי (הנקרא ביורמדיציה) הוא גישה חלופית מבטיחה הכוללת שימוש במיקרואורגניזמים בצורה של תרבויות טהורות או מושבות. בהשוואה לשיטות פיזיקליות וכימיות, תהליך זה ידידותי לסביבה, לא פולשני, חסכוני ובר קיימא. ביורמדיציה יכולה להתבצע באתר הפגוע (in situ) או באתר שהוכן במיוחד (ex situ) ולכן נחשבת לשיטת שיקום בת קיימא יותר משיטות פיזיקליות וכימיות מסורתיות (Juhasz and Naidu, 2000; Andreoni and Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
להבנת השלבים המטבוליים המיקרוביאליים המעורבים בפירוק מזהמים ארומטיים יש השלכות מדעיות וכלכליות עצומות על קיימות אקולוגית וסביבתית. כ-2.1×1018 גרם של פחמן (C) מאוחסנים בסדימנטים ובתרכובות אורגניות (למשל, נפט, גז טבעי ופחם, כלומר, דלקים מאובנים) ברחבי העולם, ותורמים תרומה משמעותית למחזור הפחמן העולמי. עם זאת, התיעוש המהיר, הפקת דלקים מאובנים ופעילויות אנושיות מדלדלות את מאגרי הפחמן הליתוספריים הללו, ומשחררות כ-5.5×1015 גרם של פחמן אורגני (כמזהמים) לאטמוספרה מדי שנה (Gonzalez-Gaya et al., 2019). רוב הפחמן האורגני הזה נכנס למערכות אקולוגיות יבשתיות וימיות באמצעות שקיעה, הובלה ונגר. בנוסף, מזהמים סינתטיים חדשים שמקורם בדלקים מאובנים, כגון פלסטיק, פלסטייזרים ומייצבים מפלסטיק (פתלטים והאיזומרים שלהם), מזהמים קשות את המערכות האקולוגיות הימיות, הקרקעיות והימיות ואת הביוטה שלהן, ובכך מחריפים את הסיכונים האקלימיים הגלובליים. סוגים שונים של מיקרופלסטיק, ננופלסטיק, שברי פלסטיק ותוצרי מונומר רעילים שלהם שמקורם בפוליאתילן טרפתאלט (PET) הצטברו באוקיינוס ​​השקט בין צפון אמריקה לדרום מזרח אסיה, ויצרו את "טלאי האשפה הגדול באוקיינוס ​​השקט", ופגעו בחיים הימיים (Newell et al., 2020). מחקרים מדעיים הוכיחו כי לא ניתן להסיר מזהמים/פסולת כאלה בשום שיטה פיזיקלית או כימית. בהקשר זה, המיקרואורגניזמים השימושיים ביותר הם אלו המסוגלים לפרק מזהמים באופן חמצוני לפחמן דו-חמצני, אנרגיה כימית ותוצרי לוואי אחרים שאינם רעילים, אשר בסופו של דבר נכנסים לתהליכי מחזור חומרים מזינים אחרים (H2, O2, N2, S2, P2, Fe וכו'). לפיכך, הבנת האקופיזיולוגיה המיקרוביאלית של מינרליזציה של מזהמים ארומטיים ובקרתם הסביבתית היא קריטית להערכת מחזור הפחמן המיקרוביאלי, תקציב הפחמן נטו וסיכוני אקלים עתידיים. בהתחשב בצורך הדחוף להסיר תרכובות כאלה מהסביבה, צצו תעשיות אקולוגיות שונות המתמקדות בטכנולוגיות נקיות. לחלופין, ניצול פסולת תעשייתית/כימיקלים המצטברים במערכות אקולוגיות (כלומר, גישת "הפיכת פסולת לעושר") נחשב לאחד מעמודי התווך של הכלכלה המעגלית ומטרות פיתוח בר-קיימא (Close et al., 2012). לכן, הבנת ההיבטים המטבוליים, האנזימטיים והגנטיים של פוטנציאל פירוק זה היא בעלת חשיבות עליונה להסרה יעילה וביולוגית של מזהמים ארומטיים כאלה.
מבין המזהמים הארומטיים הרבים, אנו מקדישים תשומת לב מיוחדת ל-PAHs בעלי משקל מולקולרי נמוך כגון נפתלין ונפתלנים שהוחלפו. תרכובות אלו הן מרכיבים עיקריים של דלקים שמקורם בנפט, צבעי טקסטיל, מוצרי צריכה, חומרי הדברה (כדורי נפטלין ודוחי חרקים), פלסטייזרים וטאנינים ולכן נפוצות במערכות אקולוגיות רבות (Preuss et al., 2003). דיווחים אחרונים מדגישים את הצטברות ריכוזי הנפתלין בסדימנטים של אקוויפרים, מי תהום וקרקעות תת-קרקעיות, אזורי ניקוז ואפיקי נהרות, דבר המצביע על הצטברות ביולוגית שלו בסביבה (Duttagupta et al., 2019, 2020). טבלה 2 מסכמת את התכונות הפיזיקוכימיות, היישומים וההשפעות הבריאותיות של נפתלין ונגזרותיו. בהשוואה ל-PAHs אחרים בעלי משקל מולקולרי גבוה, נפתלין ונגזרותיו פחות הידרופוביים, מסיסים יותר במים ומפוזרים באופן נרחב במערכות אקולוגיות, ולכן הם משמשים לעתים קרובות כמצעים מודל לחקר חילוף החומרים, הגנטיקה והמגוון המטבולי של PAHs. מספר רב של מיקרואורגניזמים מסוגלים לפרק נפתלין ונגזרותיו, ומידע מקיף זמין על מסלולי המטבוליזם שלהם, אנזימים ומאפייני בקרה (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). בנוסף, נפתלין ונגזרותיו מיועדים כתרכובות אב טיפוס להערכת זיהום סביבתי בשל שכיחותם הגבוהה וזמינותם הביולוגית. הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב מעריכה כי רמות נפתלין ממוצעות הן 5.19 מיקרוגרם למטר מעוקב מעשן סיגריות, בעיקר מבעירה לא שלמה, ו-7.8 עד 46 מיקרוגרם מעשן צד, בעוד שחשיפה לקראוסוט ונפתלין גבוהה פי 100 עד 10,000 (Preuss et al. 2003). נמצא כי נפתלין בפרט בעל רעילות נשימתית וסרטן ספציפיים למין, לאזור ולמין. בהתבסס על מחקרים בבעלי חיים, הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן (IARC) סיווגה את נפתלין כ"מסרטן אפשרי בבני אדם" (קבוצה 2B)1. חשיפה לנפתלין תחליפי, בעיקר בשאיפה או מתן פרנטרלי (דרך הפה), גורמת לפגיעה ברקמת הריאה ומגבירה את שכיחות גידולי הריאה בחולדות ובעכברים (תוכנית הטוקסיקולוגיה הלאומית 2). תופעות לוואי חריפות כוללות בחילות, הקאות, כאבי בטן, שלשולים, כאב ראש, בלבול, הזעה מוגזמת, חום, טכיקרדיה וכו'. מצד שני, קוטל החרקים רחב הספקטרום קרבארט קרבריל (1-נפתיל N-מתילקרבארט) דווח כרעיל לחסרי חוליות מימיים, דו-חיים, דבורי דבש ובני אדם, והוכח כמעכב אצטילכולין אסטראז הגורם לשיתוק (Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011). לכן, הבנת המנגנונים של פירוק מיקרוביאלי, ויסות גנטי, תגובות אנזימטיות ותאיות היא קריטית לפיתוח אסטרטגיות ביולוגיות לשיקום בסביבות מזוהמות.
טבלה 2. מידע מפורט על התכונות הפיזיקוכימיות, השימושים, שיטות הזיהוי והמחלות הנלוות של נפתלין ונגזרותיו.
בנישות מזוהמות, מזהמים ארומטיים הידרופוביים וליפופיליים יכולים לגרום למגוון השפעות תאיות על המיקרוביום הסביבתי (קהילה), כגון שינויים בנזילות הממברנה, חדירות הממברנה, נפיחות של שכבות שומנים דו-צדדיות, שיבוש בהעברת אנרגיה (שרשרת הובלת אלקטרונים/כוח מניע פרוטון) ופעילות של חלבונים הקשורים לממברנה (Sikkema et al., 1995). בנוסף, חלק מחומרי הביניים המסיסים כגון קטכולים וקינונים מייצרים מיני חמצן פעילים (ROS) ויוצרים תוצרי קשר עם DNA וחלבונים (Penning et al., 1999). לפיכך, שפע התרכובות הללו במערכות אקולוגיות מפעיל לחץ סלקטיבי על קהילות מיקרוביאליות להפוך למפרקים יעילים ברמות פיזיולוגיות שונות, כולל קליטה/הובלה, טרנספורמציה תוך-תאית, הטמעה/ניצול וחלוקה למדור.
חיפוש בפרויקט מסד הנתונים הריבוזומלי II (RDP-II) גילה כי סך של 926 מיני חיידקים בודדו מתרביות או מתרביות העשרה מזוהמות בנפתלין או נגזרותיו. לקבוצת הפרוטאובקטריה היה מספר הנציגים הגבוה ביותר (n = 755), ואחריה Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) וחיידקים לא מסווגים (8) (איור 2). נציגים של γ-פרוטאובקטריה (Pseudomonadales ו-Xanthomonadales) שלטו בכל הקבוצות גראם-שליליות עם תכולת G+C גבוהה (54%), בעוד ש-Clostridiales ו-Bacillales (30%) היו קבוצות גראם-חיוביות עם תכולת G+C נמוכה. דווח כי פסאודומונס (המספר הגבוה ביותר, 338 מינים) מסוגל לפרק נפתלין ונגזרות מתיל שלו במערכות אקולוגיות מזוהמות שונות (זפת פחם, נפט, נפט גולמי, בוצה, דליפות נפט, שפכים, פסולת אורגנית ומטמנות) וכן במערכות אקולוגיות שלמות (קרקע, נהרות, משקעים ומי תהום) (איור 2). יתר על כן, מחקרי העשרה וניתוח מטאגנומי של חלק מאזורים אלה גילו כי מיני לגיונלה וקלוסטרידיום שלא עברו תרבית עשויים להיות בעלי יכולת פירוק, דבר המצביע על הצורך בתרבית חיידקים אלה כדי לחקור מסלולים חדשים ומגוון מטבולי.
איור 2. גיוון טקסונומי ותפוצה אקולוגית של נציגי חיידקים בסביבות מזוהמות בנפתלין ונגזרותיו.
מבין המיקרואורגניזמים השונים המפרקים פחמימנים ארומטיים, רובם מסוגלים לפרק נפתלין כמקור היחיד לפחמן ואנרגיה. רצף האירועים המעורבים במטבוליזם של נפתלין תואר עבור Pseudomonas sp. (זנים: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 ו-CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 וזנים אחרים (ND6 ו-AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis and Zylstra, 2004; Sota et al., 2006); מטבוליזם מתחיל על ידי דיאוקסיגנאז רב-רכיבי [נפתלין דיאוקסיגנאז (NDO), דיאוקסיגנאז הידרוקסילטור טבעתי] אשר מזרז את החמצון של אחת הטבעות הארומטיות של נפתלין באמצעות חמצן מולקולרי כסובסטרט השני, וממיר נפתלין ל-cis-naphthalenediol (איור 3). ציס-דיהידרודיול מומר ל-1,2-דיהידרוקסינפתלין על ידי דהידרוגנאז. דיאוקסיגנאז חוצה טבעת, 1,2-דיהידרוקסינפתלין דיאוקסיגנאז (12DHNDO), ממיר 1,2-דיהידרוקסינפתלין לחומצה 2-הידרוקסיכרומן-2-קרבוקסילית. איזומריזציה אנזימטית של ציס-טרנס מייצרת טרנס-o-הידרוקסיבנזילידןפירובט, אשר מתפרק על ידי הידרטאז אלדולאז לאלדהיד סליצילי ופירובט. חומצה אורגנית פירובט הייתה תרכובת C3 הראשונה שנגזרה משלד הפחמן של נפתלין והופנתה למסלול הפחמן המרכזי. בנוסף, דהידרוגנאז סליציל-אלדהיד תלוי NAD+ ממיר סליציל-אלדהיד לחומצה סליצילית. מטבוליזם בשלב זה נקרא "המסלול העליון" של פירוק נפתלין. מסלול זה נפוץ מאוד ברוב החיידקים המפרקים נפתלין. עם זאת, ישנם כמה יוצאים מן הכלל; לדוגמה, ב-Bacillus hamburgii 2 התרמופילי, פירוק נפתלין מתחיל על ידי נפתלין 2,3-דיאוקסיגנאז ל- יוצרים 2,3-dihydroxynaphthalene (Annweiler et al., 2000).
איור 3. מסלולי פירוק נפתלין, מתילנפתלין, חומצה נפתואית וקרבריל. המספרים המוקפים בעיגול מייצגים אנזימים האחראים על ההמרה הרציפה של נפתלין ונגזרותיו לתוצרים עוקבים. 1 - נפתלין דיאוקסיגנאז (NDO); 2, ציס-דיהידרודיול דהידרוגנאז; 3, 1,2-דיהידרוקסינפתלין דיאוקסיגנאז; 4, איזומרז 2-הידרוקסיכרומן-2-חומצה קרבוקסילית; 5, אלדולאז טרנס-O-הידרוקסיבנזילידןפירובט הידראטאז; 6, סליצילדהיד דהידרוגנאז; 7, סליצילט 1-הידרוקסילאז; 8, קטכול 2,3-דיאוקסיגנאז (C23DO); 9, דהידרוגנאז 2-הידרוקסימוקונט סמיאלדהיד; 10, הידראטאז 2-אוקסופנט-4-אנואט; 11, אלדולאז 4-הידרוקסי-2-אוקסופנטנואט; 12, אצטאלדהיד דהידרוגנאז; 13, קטכול-1,2-דיאוקסיגנאז (C12DO); 14, מוקונאט ציקלואיזומראז; 15, מוקונולקטון דלתא-איזומראז; 16, β-קטואדיפטנולקטון הידרולאז; 17, β-קטואדיפט סוקסיניל-CoA טרנספראז; 18, β-קטואדיפט-CoA תיולאז; 19, סוקסיניל-CoA; אצטיל-CoA סוקסינילטרנספראז; 20, סליצילט 5-הידרוקסילאז; 21 – ג'נטיסאט 1,2-דיאוקסיגנאז (GDO); 22, מאלילפירובט איזומראז; 23, פומרילפירובט הידרולאז; 24, מתילנפתלין הידרוקסילאז (NDO); 25, הידרוקסימתילנפתלין דהידרוגנאז; 26, נפתאלדהיד דהידרוגנאז; 27, 3-פורמילסליצילית חומצה אוקסידאז; 28, הידרוקסיאיזופתלאט דקרבוקסילאז; 29, קרבריל הידרולאז (CH4); 30, 1-נפתול-2-הידרוקסילאז.
בהתאם לאורגניזם ולמבנה הגנטי שלו, חומצה סליצילית המתקבלת עוברת מטבוליזם נוסף דרך מסלול הקטכול באמצעות סליצילט 1-הידרוקסילאז (S1H) או דרך מסלול הגנטיסאט באמצעות סליצילט 5-הידרוקסילאז (S5H) (איור 3). מכיוון שחומצה סליצילית היא תוצר הביניים העיקרי במטבוליזם של נפתלין (מסלול עליון), השלבים מחומצה סליצילית לתוצר הביניים TCA מכונים לעתים קרובות המסלול התחתון, והגנים מאורגנים לאופרון יחיד. מקובל לראות שהגנים באופרון המסלול העליון (nah) ובאופרון המסלול התחתון (sal) מווסתים על ידי גורמים רגולטוריים משותפים; לדוגמה, NahR וחומצה סליצילית פועלים כמעוררים, המאפשרים לשני האופרונים לפרק נפתלין לחלוטין (Phale et al., 2019, 2020).
בנוסף, קטכול מתפרק באופן מחזורי לסמיאלדהיד 2-הידרוקסימקונאט דרך מסלול המטא על ידי קטכול 2,3-דיאוקסיגנאז (C23DO) (Yen et al., 1988) ועובר הידרוליזה נוספת על ידי הידרולאז סמיאלדהיד 2-הידרוקסימקונאט ליצירת חומצה 2-הידרוקסיפנט-2,4-דיאנואית. לאחר מכן, 2-הידרוקסיפנט-2,4-דיאנואט מומר לפירובט ואצטאלדהיד על ידי הידראטאז (2-אוקסופנט-4-אנואט הידראטאז) ואלדולאז (4-הידרוקסיפנט-2-אוקסופנטנואט אלדולאז) ואז נכנס למסלול הפחמן המרכזי (איור 3). לחלופין, קטכול מתפרק באופן מחזורי לציס,ציס-מוקונאט דרך מסלול האורתו על ידי קטכול 1,2-אוקסיגנאז (C12DO). ציקלואיזומראז מוקונאט, איזומראז מוקונולקטון, ו-β-קטואדיפט-נולקטון הידרולאז ממירים ציס,ציס-מוקונט ל-3-אוקסואדיפט, אשר נכנס למסלול הפחמן המרכזי דרך סוקסיניל-CoA ואצטיל-CoA (Nozaki et al., 1968) (איור 3).
במסלול הג'נטיזט (2,5-דיהידרוקסיבנזואט), הטבעת הארומטית נחתכת על ידי ג'נטיזט 1,2-דיאוקסיגנאז (GDO) ליצירת מאלילפירובט. ניתן להידרוליזה תוצר זה ישירות לפירובט ומלאט, או שניתן לאיזומר אותו ליצירת פומרילפירובט, אשר לאחר מכן ניתן להידרוליזה לפירובט ופומרט (Larkin and Day, 1986). הבחירה במסלול החלופי נצפתה הן בחיידקים גראם-שליליים והן בחיידקים גראם-חיוביים ברמה הביוכימית והגנטית (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). חיידקים גראם-שליליים (Pseudomonas) מעדיפים להשתמש בחומצה סליצילית, שהיא משרה של מטבוליזם של נפתלין, ומבצעים דקרבוקסילציה שלה לקטכול באמצעות סליצילט 1-הידרוקסילאז (Gibson and Subramanian, 1984). מצד שני, בחיידקים גראם-חיוביים (Rhodococcus), סליצילט 5-הידרוקסילאז ממיר חומצה סליצילית לחומצה גנטיסית, בעוד שלחומצה סליצילית אין השפעה אינדוקטיבית על שעתוק גנים של נפתלין (Grund et al., 1992) (איור 3).
דווח כי מינים כגון Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas ו-Mycobacterium יכולים לפרק מונומתילנפטלין או דימתילנפטלין (Dean-Raymond and Bartha, 1975; Cane and Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). ביניהם, מסלול הפירוק של 1-מתילנפטלין ו-2-מתילנפטלין של Pseudomonas sp. CSV86 נחקר בבירור ברמה הביוכימית והאנזימטית (Mahajan et al., 1994). 1-מתילנפטלין עובר מטבוליזם בשני מסלולים. ראשית, הטבעת הארומטית עוברת הידרוקסילציה (הטבעת הלא-מותמרת של מתילנפתלין) ליצירת cis-1,2-dihydroxy-1,2-dihydro-8-methylnaphthalene, אשר מתחמצן עוד יותר למתיל סליצילט ומתילקטכול, ולאחר מכן נכנס למסלול הפחמן המרכזי לאחר ביקוע הטבעת (איור 3). מסלול זה נקרא "מסלול מקור הפחמן". ב"מסלול ניקוי הרעלים" השני, קבוצת המתיל יכולה לעבור הידרוקסילציה על ידי NDO ליצירת 1-hydroxymethylnaphthalene, אשר מתחמצן עוד יותר לחומצה 1-נפתואית ומופרש למדיום הגידול כתוצר ללא מוצא. מחקרים הראו כי זן CSV86 אינו מסוגל לגדול על חומצה 1- ו-2-נפתואית כמקור פחמן ואנרגיה יחיד, דבר המאשר את מסלול ניקוי הרעלים שלו (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). ב-2-מתילנפתלין, קבוצת המתיל עוברת הידרוקסילציה על ידי הידרוקסילאז ליצירת 2-hydroxymethylnaphthalene. בנוסף, הטבעת הלא-מותמרת של טבעת הנפתלין עוברת הידרוקסילציה טבעתית ליצירת דיהידרודיול, אשר מתחמצן ל-4-הידרוקסימתילקטכול בסדרה של תגובות מזורזות אנזימים ונכנס למסלול הפחמן המרכזי דרך מסלול ביקוע המטא-טבעתי. באופן דומה, דווח כי S. paucimobilis 2322 משתמש ב-NDO להידרוקסילציה של 2-מתילנפתלין, אשר מתחמצן עוד יותר ליצירת מתיל סליצילט ומתילקטכול (Dutta et al., 1998).
חומצות נפתואיות (מותמרות/לא מתמרמות) הן תוצרי לוואי של ניקוי רעלים/ביוטרנספורמציה הנוצרים במהלך פירוק מתילנפתלין, פננתרן ואנתראצן ומשתחררים למצע הגידול המשומש. דווח כי הבידוד מהקרקע Stenotrophomonas maltophilia CSV89 מסוגל לפרק חומצה 1-נפתואית כמקור פחמן (Phale et al., 1995). חילוף החומרים מתחיל בדיהידרוקסילציה של הטבעת הארומטית ליצירת 1,2-דיהידרוקסי-8-קרבוקסינפתלין. הדיאול המתקבל מתחמצן לקטכול דרך 2-הידרוקסי-3-קרבוקסיבנזילידןפירובט, חומצה 3-פורמילסליצילית, חומצה 2-הידרוקסיאיזופתלית וחומצה סליצילית ונכנס למסלול הפחמן המרכזי דרך מסלול ביקוע המטה-טבעתי (איור 3).
קרבריל הוא קוטל חרקים מסוג נפתיל קרבמט. מאז המהפכה הירוקה בהודו בשנות ה-70, השימוש בדשנים כימיים וחומרי הדברה הוביל לעלייה בפליטות פחמימנים ארומטיים פוליציקליים (PAH) ממקורות חקלאיים לא נקודתיים (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). על פי ההערכות, 55% (85,722,000 דונם) מכלל אדמות הגידול בהודו מטופלות בחומרי הדברה כימיים. בחמש השנים האחרונות (2015–2020), מגזר החקלאות ההודי השתמש בממוצע ב-55,000 עד 60,000 טון של חומרי הדברה מדי שנה (מחלקת הקואופרטיבים ורווחת החקלאים, משרד החקלאות, ממשלת הודו, אוגוסט 2020). במישורי הגנגטים הצפוניים והמרכזיים (המדינות עם האוכלוסייה וצפיפות האוכלוסין הגבוהות ביותר), השימוש בחומרי הדברה על גידולים נפוץ, כאשר קוטלי חרקים הם השולטים. קרבריל (1-נפתיל-N-מתילקרבמט) הוא קוטל חרקים רחב טווח מסוג קרבמט, רעיל במידה בינונית עד גבוהה, המשמש בחקלאות ההודית בכמות ממוצעת של 100-110 טון. הוא נמכר בדרך כלל תחת השם המסחרי Sevin ומשמש להדברת חרקים (כנימות, נמלי אש, פרעושים, קרציות, עכבישים ומזיקים רבים אחרים בחוץ) המשפיעים על מגוון גידולים (תירס, סויה, כותנה, פירות וירקות). מיקרואורגניזמים מסוימים כמו Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus ו-Arthrobacter יכולים לשמש גם להדברת מזיקים אחרים. דווח כי RC100 יכול לפרק קרבריל (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). מסלול הפירוק של קרבריל נחקר בהרחבה ברמה הביוכימית, האנזימטית והגנטית בבידודי קרקע של זני Pseudomonas sp. C4, C5 ו-C6 (Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (איור 3). מסלול המטבולי מתחיל בהידרוליזה של קשר האסטר על ידי קרבריל הידרולאז (CH4) ליצירת 1-נפתול, מתילאמין ופחמן דו-חמצני. לאחר מכן, 1-נפתול מומר ל-1,2-דיהידרוקסינפתלין על ידי 1-נפתול הידרוקסילאז (1-NH), אשר עובר מטבוליזם נוסף דרך מסלול הפחמן המרכזי באמצעות סליצילט וג'נטיסאט. דווח כי חלק מהחיידקים המפרקים קרבריל מפרקים אותו לחומצה סליצילית באמצעות ביקוע טבעת האורתו של קטכול (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). ראוי לציין כי חיידקים המפרקים נפתלין מפרקים בעיקר חומצה סליצילית דרך קטכול, בעוד שחיידקים המפרקים קרבריל מעדיפים לעכל חומצה סליצילית דרך מסלול הגנטיסאט.
חומצה נפתליןסולפונית/חומצה דיסולפונית ונגזרות של חומצה נפתילאמיןסולפונית יכולות לשמש כחומרי ביניים בייצור צבעי אזו, חומרי הרטבה, חומרי פיזור וכו'. למרות שלתרכובות אלו יש רעילות נמוכה לבני אדם, הערכות ציטוטוקסיות הראו שהן קטלניות לדגים, דפניה ואצות (Greim et al., 1994). דווח כי נציגים של הסוג Pseudomonas (זנים A3, C22) מתחילים מטבוליזם על ידי הידרוקסילציה כפולה של הטבעת הארומטית המכילה את קבוצת החומצה הסולפונית ליצירת דיהידרודיול, אשר מומר בהמשך ל-1,2-דיהידרוקסינפתלין על ידי ביקוע ספונטני של קבוצת הסולפיט (Brilon et al., 1981). 1,2-דיהידרוקסינפתלין המתקבל עובר קטבוליזם דרך מסלול הנפתלין הקלאסי, כלומר, מסלול הקטכול או הגנטיסאט (איור 4). הוכח כי חומצה אמינו-נפתלן-סולפונית וחומצה הידרוקסינפתלן-סולפונית ניתנות לפירוק מלא על ידי קבוצות חיידקים מעורבות עם מסלולים קטבוליים משלימים (Nortemann et al., 1986). הוכח שאחד מחברי הקבוצה מבצע הסרת גופרית של חומצה אמינו-נפתלן-סולפונית או חומצה הידרוקסינפתלן-סולפונית על ידי 1,2-דיאוקסיגנציה, בעוד שאמינוסליצילאט או הידרוקסיסליצילאט משתחררים למצע הגידול כמטבוליט ללא מוצא ונספגים לאחר מכן על ידי חברים אחרים בקבוצה. חומצה נפתלן-די-סולפונית היא קוטבית יחסית אך מתכלה ביולוגית בצורה גרועה ולכן ניתנת לחילוף חומרים דרך מסלולים שונים. הסרת הגופרית הראשונה מתרחשת במהלך דיהידרוקסילציה אזורית סלקטיבית של הטבעת הארומטית וקבוצת החומצה הסולפונית; הדה-סולפוריזציה השנייה מתרחשת במהלך הידרוקסילציה של חומצה 5-סולפוסליצילית על ידי 5-הידרוקסילאז של חומצה סליצילית ליצירת חומצה גנטיסית, אשר נכנסת למסלול הפחמן המרכזי (Brilon et al., 1981) (איור 4). האנזימים האחראים לפירוק נפתלין אחראים גם על מטבוליזם של נפתלין סולפונט (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
איור 4. מסלולים מטבוליים לפירוק נפתלין סולפונט. המספרים בתוך העיגולים מייצגים את האנזימים האחראים על מטבוליזם הנפתיל סולפונט, בדומה/זהה לאנזימים המתוארים באיור 3.
PAHs בעלי משקל מולקולרי נמוך (LMW-PAHs) הם ניתנים להפחתה, הידרופוביים ומסיסים בצורה גרועה, ולכן אינם רגישים לפירוק/התפרקות טבעית. עם זאת, מיקרואורגניזמים אירוביים מסוגלים לחמצן אותם על ידי ספיגת חמצן מולקולרי (O2). אנזימים אלה שייכים בעיקר לקבוצת האוקסידורדוקטאזות ויכולים לבצע תגובות שונות כגון הידרוקסילציה של טבעת ארומטית (מונו- או דיהידרוקסילציה), דהידרוגנציה וביקוע טבעת ארומטית. התוצרים המתקבלים מתגובות אלה נמצאים במצב חמצון גבוה יותר ומתפרקים בקלות רבה יותר דרך מסלול הפחמן המרכזי (Phale et al., 2020). דווח כי האנזימים במסלול הפירוק ניתנים להשריה. פעילותם של אנזימים אלה נמוכה מאוד או זניחה כאשר תאים גדלים על מקורות פחמן פשוטים כגון גלוקוז או חומצות אורגניות. טבלה 3 מסכמת את האנזימים השונים (אוקסיגנאזות, הידרולאזות, דהידרוגנאזות, אוקסידאזות וכו') המעורבים במטבוליזם של נפתלין ונגזרותיו.
טבלה 3. מאפיינים ביוכימיים של אנזימים האחראים על פירוק נפתלין ונגזרותיו.
מחקרי רדיואיזוטופים (18O2) הראו כי שילוב של O2 מולקולרי לתוך טבעות ארומטיות על ידי אוקסיגנאזות הוא השלב החשוב ביותר בהפעלת פירוק ביולוגי נוסף של תרכובת (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). שילוב של אטום חמצן אחד (O) מחמצן מולקולרי (O2) לתוך הסובסטרט מתחיל על ידי מונואוקסיגנאזות אנדוגניות או אקסוגניות (הנקראות גם הידרוקסילאזות). אטום חמצן נוסף מצטמצם למים. מונואוקסיגנאזות אקסוגניות מפחיתות פלאבין עם NADH או NADPH, בעוד שבאנדומונואוקסיגנאזות פלאבין מצטמצם על ידי הסובסטרט. מיקום ההידרוקסילציה גורם לגיוון ביצירת התוצר. לדוגמה, סליצילט 1-הידרוקסילאז מבצע הידרוקסילציה של חומצה סליצילית במיקום C1, ויוצר קטכול. מצד שני, הסליצילאט הרב-רכיבי 5-הידרוקסילאז (המכיל תת-יחידות רדוקטאז, פרדוקסין ואוקסינאז) גורם להידרוקסילציה של חומצה סליצילית בעמדה C5, ויוצר חומצה גנטיסית (יאמאמוטו ואחרים, 1965).
דיאוקסיגנאזות משלבות שני אטומי O2 לתוך הסובסטרט. בהתאם לתוצרים הנוצרים, הן מחולקות לדיאוקסיגנאזות הידרוקסילטיביות טבעתיות ודיאוקסיגנאזות חוצות טבעתיות. דיאוקסיגנאזות הידרוקסילטיביות טבעתיות ממירות סובסטרטים ארומטיים לציס-דיהידרודיולים (למשל, נפתלין) והן נפוצות בקרב חיידקים. עד כה, הוכח כי אורגניזמים המכילים דיאוקסיגנאזות הידרוקסילטיביות טבעתיות מסוגלים לגדול על מקורות פחמן ארומטיים שונים, ואנזימים אלה מסווגים כ-NDO (נפתלין), טולואן דיאוקסיגנאז (TDO, טולואן) וביפניל דיאוקסיגנאז (BPDO, ביפניל). גם NDO וגם BPDO יכולים לזרז את החמצון הכפול ואת ההידרוקסילציה של שרשרת הצד של פחמימנים ארומטיים פוליציקליים שונים (טולואן, ניטרוטולואן, קסילן, אתילבנזן, נפתלין, ביפניל, פלואורן, אינדול, מתילנפתלין, נפתליןסולפונט, פננתרן, אנתרצן, אצטופנון וכו') (Boyd and Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO היא מערכת רב-רכיבית המורכבת מאוקסידורדוקטאז, פררדוקסין ורכיב אוקסיגנאז המכיל אתר פעיל (Gibson and Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). היחידה הקטליטית של NDO מורכבת מתת-יחידה α גדולה ותת-יחידה β קטנה המסודרות בתצורת α3β3. NDO שייך למשפחה גדולה של אוקסיגנאזות ותת-היחידה ה-α שלו מכילה אתר ריסקה [2Fe-2S] וברזל חד-גרעיני שאינו-הם, הקובעים את הספציפיות של הסובסטרט של NDO (Parales et al., 1998). בדרך כלל, במחזור קטליטי אחד, שני אלקטרונים מחיזור נוקלאוטיד פירידין מועברים ליון Fe(II) באתר הפעיל דרך רדוקטאז, פררדוקסין ואתר ריסקה. המקבילים המחזרים מפעילים חמצן מולקולרי, שהוא תנאי מוקדם לדיהידרוקסילציה של הסובסטרט (Feraro et al., 2005). עד כה, רק מספר קטן של NDOs טוהרו ואופיינו בפירוט מזנים שונים והבקרה הגנטית של המסלולים המעורבים בפירוק נפתלין נחקרה בפירוט (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). דיאוקסיגנאזות קורעות טבעות (אנזימים קורעי טבעות אנדו- או אורתו-טבעות ואנזימים קורעי אקסודיול- או מטא-טבעות) פועלים על תרכובות ארומטיות שעברו הידרוקסילציה. לדוגמה, הדיאוקסיגנאז קורע טבעות אורתו-טבעות הוא קטכול-1,2-דיאוקסיגנאז, בעוד שהדיאוקסיגנאז קורע טבעות מטא-טבעות הוא קטכול-2,3-דיאוקסיגנאז (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). בנוסף לאוקסיגנאזות שונות, קיימות גם דהידרוגנאזות שונות האחראיות על דהידרוגנציה של דיהידרודיולים ארומטיים, אלכוהולים ואלדהידים ומשתמשות ב-NAD+/NADP+ כקולטי אלקטרונים, שהם חלק מהאנזימים החשובים המעורבים בחילוף החומרים (Gibson and Subramanian, 1984; Shaw and Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
אנזימים כגון הידרולאזות (אסטראזות, אמידאזות) הם סוג חשוב שני של אנזימים המשתמשים במים כדי לחתוך קשרים קוולנטיים ומציגים ספציפיות רחבה לסובסטרט. קרבריל הידרולאז והידרולאזות אחרות נחשבות למרכיבים של הפריפלזמה (טרנסממברנה) בחיידקים גראם-שליליים (Kamini et al., 2018). לקרבריל יש גם קישור אמיד וגם קישור אסטר; לכן, הוא יכול לעבור הידרוליזה על ידי אסטראז או אמידאז ליצירת 1-נפתול. דווח כי קרבריל בזן Rhizobium rhizobium AC10023 ובזן Arthrobacter RC100 מתפקד כאסטראז ואמידאז, בהתאמה. קרבריל בזן Arthrobacter RC100 מתפקד גם כאמידאז. RC100 הוכח כמפרק הידרוליזה לארבעה קוטלי חרקים ממשפחת N-methylcarbamate כגון קרבריל, מתומיל, חומצה מפנמית ו-XMC (Hayatsu et al., 2001). דווח כי CH ב-Pseudomonas sp. C5pp יכול לפעול על קרבריל (פעילות של 100%) ו-1-נפטיל אצטט (פעילות של 36%), אך לא על 1-נפתילאצטמיד, דבר המצביע על כך שמדובר באסטראז (Trivedi et al., 2016).
מחקרים ביוכימיים, דפוסי בקרה אנזימים וניתוח גנטי הראו שגנים של פירוק נפתלין מורכבים משתי יחידות בקרה או "אופרים" ניתנות להשראה: nah ("המסלול במעלה הזרם", הממיר נפתלין לחומצה סליצילית) ו-sal ("המסלול במורד הזרם", הממיר חומצה סליצילית למסלול הפחמן המרכזי דרך קטכול). חומצה סליצילית והאנלוגים שלה יכולים לשמש כמעוררים (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974). בנוכחות גלוקוז או חומצות אורגניות, האופרון מודחק. איור 5 מציג את הארגון הגנטי המלא של פירוק נפתלין (בצורת אופרון). מספר וריאנטים/צורות בעלי שם של הגן nah (ndo/pah/dox) תוארו ונמצאו כבעלי הומולוגיה גבוהה של רצף (90%) בקרב כל מיני Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). הגנים של מסלול הנפתלין במעלה הזרם סודרו בדרך כלל בסדר קונצנזוס כפי שמוצג באיור 5A. גן נוסף, nahQ, דווח גם הוא כמעורב במטבוליזם של נפתלין והוא ממוקם בדרך כלל בין nahC ל-nahE, אך תפקידו האמיתי טרם הובהר. באופן דומה, הגן nahY, האחראי על כימוטקסיס רגיש לנפתלין, נמצא בקצה הדיסטלי של אופרון nah אצל חלק מהחברים. ב-Ralstonia sp., הגן U2 המקודד גלוטתיון S-טרנספראז (gsh) נמצא ממוקם בין nahAa ל-nahAb אך לא השפיע על מאפייני ניצול הנפתלין (Zylstra et al., 1997).
איור 5. ארגון גנטי וגיוון שנצפה במהלך פירוק נפתלין בקרב מיני חיידקים; (א) מסלול נפתלין עליון, מטבוליזם של נפתלין לחומצה סליצילית; (ב) מסלול נפתלין תחתון, חומצה סליצילית דרך קטכול למסלול פחמן מרכזי; (ג) חומצה סליצילית דרך ג'נטיסאט למסלול פחמן מרכזי.
"המסלול התחתון" (אופרון sal) מורכב בדרך כלל מ-nahGTHINLMOKJ וממיר סליצילט לפירובט ואצטאלדהיד דרך מסלול הביקוע המטארינג של קטכול. נמצא כי הגן nahG (המקודד לסליצילאט הידרוקסילאז) נשמר בקצה הפרוקסימלי של האופרון (איור 5B). בהשוואה לזנים אחרים המפרקים נפתלין, ב-P. putida CSV86 האופרונים nah ו-sal הם טנדם וקרובים מאוד (כ-7.5 kb). בחיידקים גראם-שליליים מסוימים, כגון Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 ו-P. putida AK5, נפתלין עובר מטבוליזם כמטבוליט פחמן מרכזי דרך מסלול הגנטיסאט (בצורת האופרון sgp/nag). קסטה של ​​הגן מיוצגת בדרך כלל בצורה nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, כאשר nagR (המקודד לווסת מסוג LysR) ממוקם בקצה העליון (איור 5C).
קרבריל נכנס למחזור הפחמן המרכזי דרך מטבוליזם של 1-נפתול, 1,2-דיהידרוקסינפתלין, חומצה סליצילית וחומצה גנטיסית (איור 3). בהתבסס על מחקרים גנטיים ומטבוליים, הוצע לחלק מסלול זה ל"מעלה הזרם" (המרה של קרבריל לחומצה סליצילית), "אמצעי" (המרה של חומצה סליצילית לחומצה גנטיסית) ו"מורד הזרם" (המרה של חומצה גנטיסית לחומרי ביניים במסלול פחמן מרכזי) (סינג ואחרים, 2013). ניתוח גנומי של C5pp (supercontig A, 76.3 kb) גילה כי הגן mcbACBDEF מעורב בהמרת קרבריל לחומצה סליצילית, ואחריו mcbIJKL בהמרת חומצה סליצילית לחומצה גנטיסית, ו-mcbOQP בהמרת חומצה גנטיסית לחומרי ביניים פחמניים מרכזיים (פומרט ופירובט, Trivedi et al., 2016) (איור 6).
דווח כי אנזימים המעורבים בפירוק של פחמימנים ארומטיים (כולל נפתלין וחומצה סליצילית) יכולים להיות מושרים על ידי התרכובות המתאימות ומעוכבים על ידי מקורות פחמן פשוטים כמו גלוקוז או חומצות אורגניות (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). מבין מסלולי המטבוליזם השונים של נפתלין ונגזרותיו, נחקרו במידה מסוימת המאפיינים הרגולטוריים של נפתלין וקרבריל. עבור נפתלין, גנים הן במסלולים במעלה הזרם והן במסלולים במורד הזרם מווסתים על ידי NahR, מווסת חיובי מסוג LysR בעל פעילות טרנס-אקטיבית. הוא נדרש להשראת הגן nah על ידי חומצה סליצילית ולביטויו ברמה גבוהה לאחר מכן (Yen and Gunsalus, 1982). יתר על כן, מחקרים הראו כי גורם מארח אינטגרטיבי (IHF) ו-XylR (מווסת שעתוק תלוי סיגמא 54) הם גם קריטיים להפעלה שעתוקית של גנים במטבוליזם של נפתלין (Ramos et al., 1997). מחקרים הראו כי אנזימים של מסלול פתיחת המטה-טבעת של קטכול, כלומר קטכול 2,3-דיאוקסיגנאז, מושרים בנוכחות נפתלין ו/או חומצה סליצילית (Basu et al., 2006). מחקרים הראו כי אנזימים של מסלול פתיחת הטבעת האורתו-אורתו-קטכול, כלומר קטכול 1,2-דיאוקסיגנאז, מושרים בנוכחות חומצה בנזואית וציס,ציס-מוקונט (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
בזן C5pp, חמישה גנים, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR ו-mcbS, מקודדים מווסתים השייכים למשפחת LysR/TetR של מווסתים שעתוקיים האחראים על בקרת פירוק קרבריל. נמצא כי הגן ההומולוגי mcbG קשור באופן הדוק ביותר למווסת מסוג LysR, PhnS (זהות חומצת אמינו של 58%) המעורב במטבוליזם של פננתרן ב-Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). נמצא כי הגן mcbH מעורב במסלול הביניים (המרה של חומצה סליצילית לחומצה גנטיסית) ושייך למווסת השעתוק מסוג LysR, NagR/DntR/NahR ב-Pseudomonas ו-Burkholderia. דווח כי בני משפחה זו מזהים חומצה סליצילית כמולקולת אפקטור ספציפית להשראת גנים של פירוק. מצד שני, שלושה גנים, mcbN, mcbR ו-mcbS, השייכים לווסתי תעתוק מסוג LysR ו-TetR, זוהו במסלול במורד הזרם (מטבוליטים של מסלול הפחמן המרכזי-גנטיסאט).
בפרוקריוטים, תהליכי העברת גנים אופקיים (רכישה, החלפה או העברה) באמצעות פלסמידים, טרנספוזונים, פרופאגים, איים גנומיים ואלמנטים מצמידים אינטגרטיביים (ICE) הם גורמים עיקריים לפלסטיות בגנומים חיידקיים, מה שמוביל לרווח או לאובדן של תפקודים/תכונות ספציפיים. זה מאפשר לחיידקים להסתגל במהירות לתנאי סביבה שונים, ומספק יתרונות מטבוליים אדפטיביים פוטנציאליים למארח, כגון פירוק של תרכובות ארומטיות. שינויים מטבוליים מושגים לעתים קרובות באמצעות כוונון עדין של אופרוני פירוק, מנגנוני הרגולציה שלהם וספציפיות האנזימים, מה שמקל על פירוק של מגוון רחב יותר של תרכובות ארומטיות (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). נמצא כי קסטות הגנים לפירוק נפתלין ממוקמות על מגוון אלמנטים ניידים כגון פלסמידים (מצמידים ולא מצמידים), טרנספוזונים, גנומים, ICE ושילובים של מיני חיידקים שונים (איור 5). ב-Pseudomonas G7, האופרונים nah ו-sal של פלסמיד NAH7 משועתקים באותו כיוון והם חלק מטרנספוזון פגום הדורש טרנספוזאז Tn4653 לצורך ניוד (Sota et al., 2006). בזן Pseudomonas NCIB9816-4, הגן נמצא על הפלסמיד המצומד pDTG1 כשני אופרונים (במרחק של כ-15 קילו-בייט זה מזה) ששועתקו בכיוונים מנוגדים (Dennis and Zylstra, 2004). בזן Pseudomonas putida AK5, הפלסמיד הלא-מצומד pAK5 מקודד את האנזים האחראי לפירוק נפתלין דרך מסלול הגנטיסאט (Izmalkova et al., 2013). בזן PMD-1 של Pseudomonas, האופרון nah ממוקם על הכרומוזום, בעוד שאופרון ה-sal ממוקם על הפלסמיד המצומד pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). עם זאת, ב-Pseudomonas stutzeri AN10, כל גני פירוק הנפתלין (אופרונים nah ו-sal) ממוקמים על הכרומוזום וככל הנראה מגויסים באמצעות אירועי טרנספוזיציה, רקומבינציה וסידור מחדש (Bosch et al., 2000). ב-Pseudomonas sp. CSV86, האופרונים nah ו-sal ממוקמים בגנום בצורת ICE (ICECSV86). המבנה מוגן על ידי tRNAGly ואחריו חזרות ישירות המצביעות על אתרי רקומבינציה/התקשרות (attR ו-attL) ואינטגראז דמוי פאג' הממוקם בשני קצוות tRNAGly, ולכן דומה מבחינה מבנית לאלמנט ICEclc (ICEclcB13 ב-Pseudomonas knackmusii לפירוק כלורוקאטכול). דווח כי גנים על גבי ICE ניתנים להעברה באמצעות צימוד בתדירות העברה נמוכה ביותר (10-8), ובכך מעבירים תכונות פירוק לנמען (Basu and Phale, 2008; Phale et al., 2019).
רוב הגנים האחראים לפירוק קרבריל ממוקמים על פלסמידים. Arthrobacter sp. RC100 מכיל שלושה פלסמידים (pRC1, pRC2 ו-pRC300) מתוכם שני פלסמידים מצומדים, pRC1 ו-pRC2, מקודדים לאנזימים ההופכים קרבריל לג'נטיזט. מצד שני, האנזימים המעורבים בהמרת ג'נטיזט למטבוליטים פחמניים מרכזיים ממוקמים על הכרומוזום (Hayatsu et al., 1999). חיידקים מהסוג Rhizobium. זן AC100, המשמש להמרת קרבריל ל-1-נפתול, מכילים פלסמיד pAC200, הנושא את הגן cehA המקודד ל-CH כחלק מהטרנספוזון Tnceh המוקף ברצפים דמויי אלמנט החדרה (istA ו-istB) (Hashimoto et al., 2002). בזן Sphingomonas CF06, הגן לפירוק הקרבריל נמצא ככל הנראה בחמישה פלסמידים: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 ו-pCF05. ההומולוגיה של ה-DNA בין פלסמידים אלה גבוהה, דבר המצביע על קיומו של אירוע שכפול גנים (Feng et al., 1997). בסימביונט מפרק קרבריל המורכב משני מיני Pseudomonas, זן 50581 מכיל פלסמיד מצומד pCD1 (50 kb) המקודד לגן mcd carbaryl hydrolase, בעוד שהפלסמיד המצומד בזן 50552 מקודד לאנזים מפרק 1-naphthol (Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). בזן Achromobacter WM111, גן mcd furadan hydrolase ממוקם על פלסמיד 100 kb (pPDL11). גן זה הוכח כקיים על פלסמידים שונים (100, 105, 115 או 124 kb) בחיידקים שונים מאזורים גיאוגרפיים שונים (Parekh et al., 1995). ב-Pseudomonas sp. C5pp, כל הגנים האחראים לפירוק קרבריל ממוקמים בגנום המשתרע על פני 76.3 kb של רצף (Trivedi et al., 2016). ניתוח גנום (6.15 Mb) גילה את נוכחותם של 42 MGEs ו-36 GEIs, מתוכם 17 MGEs היו ממוקמים בסופר-קונטיג A (76.3 kb) עם תכולת G+C אסימטרית ממוצעת (54-60 mol%), דבר המצביע על אירועי העברת גנים אופקיים אפשריים (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 מציג סידור דומה של גנים המפרקים קרבריל, אך גנים אלה ממוקמים על פלסמיד (Zhu et al., 2019).
בנוסף ליעילות מטבולית ברמה הביוכימית והגנומית, מיקרואורגניזמים מפגינים גם תכונות או תגובות אחרות כגון כימוטקסיס, תכונות שינוי פני התא, חלוקה לאזורים שונים, ניצול מועדף, ייצור חומרים פעילי שטח ביולוגיים וכו', המסייעות להם לפרק ביעילות רבה יותר מזהמים ארומטיים בסביבות מזוהמות (איור 7).
איור 7. אסטרטגיות תגובה תאיות שונות של חיידקים אידיאליים המפרקים פחמימנים ארומטיים לפירוק ביולוגי יעיל של תרכובות מזהמות זרות.
תגובות כימוטקטיות נחשבות לגורמים המגבירים את פירוקם של מזהמים אורגניים במערכות אקולוגיות מזוהמות באופן הטרוגני. (2002) הראו כי כימוטקסיס של Pseudomonas sp. G7 לנפתלין הגביר את קצב פירוק הנפתלין במערכות מימיות. זן הבר G7 פירק נפתלין הרבה יותר מהר מאשר זן מוטנטי חסר כימוטקסיס. נמצא כי חלבון NahY (538 חומצות אמינו עם טופולוגיית ממברנה) עובר תעתוק משותף עם גני מסלול המטא-קלייבג' בפלסמיד NAH7, וכמו מתמרי כימוטקסיס, נראה כי חלבון זה מתפקד ככימורצפטור לפירוק נפתלין (Grimm and Harwood 1997). מחקר נוסף של Hansel et al. (2009) הראה כי החלבון כימוטקטי, אך קצב הפירוק שלו גבוה. (2011) הדגימו תגובה כימוטקטית של פסאודומונס (P. putida) לנפתלין בגז, כאשר דיפוזיה בפאזה הגזית הביאה לזרימה קבועה של נפתלין לתאים, מה ששלט על התגובה הכימוטקטית של התאים. החוקרים ניצלו התנהגות כימוטקטית זו כדי להנדס מיקרובים שישפרו את קצב הפירוק. מחקרים הראו שמסלולים כימו-סנסוריים מווסתים גם תפקודים תאיים אחרים כגון חלוקת תאים, ויסות מחזור התא ויצירת ביופילם, ובכך מסייעים בשליטה על קצב הפירוק. עם זאת, ניצול תכונה זו (כימוטקסיס) לצורך פירוק יעיל מוגבל על ידי מספר צווארי בקבוק. המכשולים העיקריים הם: (א) קולטנים פאראלוגיים שונים מזהים את אותם תרכובות/ליגנדים; (ב) קיום קולטנים חלופיים, כלומר, טרופיזם אנרגטי; (ג) הבדלים משמעותיים ברצף בתחומים החישתיים של אותה משפחת קולטנים; ו-(ד) חוסר מידע על חלבוני החישה החיידקיים העיקריים (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). לעיתים, הפירוק הביולוגי של פחמימנים ארומטיים מייצר מטבוליטים/תוצרי ביניים מרובים, אשר עשויים להיות כימוטקטיים עבור קבוצת חיידקים אחת אך דוחים עבור אחרים, מה שמסבך עוד יותר את התהליך. כדי לזהות את האינטראקציות של ליגנדים (פחמימנים ארומטיים) עם קולטנים כימיים, בנינו חלבוני חישה היברידיים (PcaY, McfR ו-NahY) על ידי מיזוג תחומי החישה והאיתות של Pseudomonas putida ו-Escherichia coli, המכוונים לקולטנים לחומצות ארומטיות, תוצרי ביניים של TCA ונפתלין, בהתאמה (Luu et al., 2019).
תחת השפעת נפתלין ופחמימנים ארומטיים פוליציקליים אחרים (PAHs), מבנה קרום החיידקים ושלמות המיקרואורגניזמים עוברים שינויים משמעותיים. מחקרים הראו כי נפתלין מפריע לאינטראקציה של שרשרת האציל באמצעות אינטראקציות הידרופוביות, ובכך מגביר את הנפיחות והנזילות של הממברנה (Sikkema et al., 1995). כדי לנטרל השפעה מזיקה זו, חיידקים מווסתים את נזילות הממברנה על ידי שינוי היחס והרכב חומצות השומן בין חומצות שומן מסועפות איזו/אנטיסו ואיזומריזציה של חומצות שומן ציס בלתי רוויות לאיזומרים טרנס תואמים (Heipieper and de Bont, 1994). ב-Pseudomonas stutzeri שגודלו בטיפול בנפתלין, יחס חומצות השומן הרוויות לחומצות השומן הבלתי רוויות עלה מ-1.1 ל-2.1, ואילו ב-Pseudomonas JS150 יחס זה עלה מ-7.5 ל-12.0 (Mrozik et al., 2004). כאשר גודלו על נפתלין, תאי Achromobacter KAs 3-5 הציגו צבירה של תאים סביב גבישי נפתלין וירידה במטען פני התא (מ-22.5- ל-2.5- מיליוולט) מלווה בעיבוי ציטופלזמי ווקאוליזציה, דבר המצביע על שינויים במבנה התא ובתכונות פני התא (Mohapatra et al., 2019). למרות ששינויים תאיים/פני שטח קשורים ישירות לקליטה טובה יותר של מזהמים ארומטיים, אסטרטגיות הנדסה ביולוגית רלוונטיות לא עברו אופטימיזציה יסודית. מניפולציה של צורת התא כמעט ולא שימשה לייעול תהליכים ביולוגיים (Volke and Nikel, 2018). מחיקת גנים המשפיעים על חלוקת התא גורמת לשינויים במורפולוגיה של התא. מחיקת גנים המשפיעים על חלוקת התא גורמת לשינויים במורפולוגיה של התא. ב-Bacillus subtilis, חלבון מחיצת התא SepF הוכח כמעורב ביצירת מחיצת התא ונדרש לשלבים הבאים של חלוקת התא, אך הוא אינו גן חיוני. מחיקת גנים המקודדים פפטיד גליקן הידרולאזות ב-Bacillus subtilis הביאה להתארכות תאים, עלייה בקצב הגדילה הסגולי ושיפור ביכולת ייצור האנזימים (Cui et al., 2018).
הוצעה חלוקה למסלול פירוק הקרבריל כדי להשיג פירוק יעיל של זני Pseudomonas C5pp ו-C7 (Kamini et al., 2018). מוצע שקרבריל מועבר לחלל הפריפלזמי דרך מחיצת הממברנה החיצונית ו/או דרך פורינים ברי דיפוזיה. CH3 הוא אנזים פריפלזמי המזרז את ההידרוליזה של קרבריל ל-1-נפתול, שהוא יציב יותר, הידרופובי יותר ורעיל יותר. CH3 ממוקם בפריפלזמה ובעל זיקה נמוכה לקרבריל, ובכך שולט על היווצרות 1-נפתול, ובכך מונע את הצטברותו בתאים ומפחית את רעילותו לתאים (Kamini et al., 2018). ה-1-נפתול שנוצר מועבר לציטופלזמה דרך הממברנה הפנימית על ידי חלוקה ו/או דיפוזיה, ולאחר מכן עובר הידרוקסילציה ל-1,2-דיהידרוקסינפתלין על ידי האנזים בעל הזיקה הגבוהה 1NH3 לצורך מטבוליזם נוסף במסלול הפחמן המרכזי.
למרות שלמיקרואורגניזמים יש את היכולות הגנטיות והמטבוליות לפרק מקורות פחמן קסנוביוטיים, המבנה ההיררכי של ניצולם (כלומר, שימוש מועדף במקורות פחמן פשוטים על פני מורכבים) מהווה מכשול עיקרי לפירוק ביולוגי. נוכחותם וניצולם של מקורות פחמן פשוטים מורידים את הגנים המקודדים לאנזימים המפרקים מקורות פחמן מורכבים/לא מועדפים כגון PAHs. דוגמה שנחקרת היטב היא שכאשר גלוקוז ולקטוז מוזנים יחד ל-Escherichia coli, גלוקוז מנוצל בצורה יעילה יותר מאשר לקטוז (Jacob and Monod, 1965). דווח כי Pseudomonas מפרק מגוון PAHs ותרכובות קסנוביוטיות כמקורות פחמן. ההיררכיה של ניצול מקורות פחמן ב-Pseudomonas היא חומצות אורגניות > גלוקוז > תרכובות ארומטיות (Hylemon and Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). עם זאת, יש יוצא מן הכלל. מעניין לציין, Pseudomonas sp. ל-CSV86 מבנה היררכי ייחודי המשתמש באופן עדיף בפחמימנים ארומטיים (חומצה בנזואית, נפתלין וכו') על פני גלוקוז ומבצע מטבוליזם משותף של פחמימנים ארומטיים עם חומצות אורגניות (Basu et al., 2006). בחיידק זה, הגנים לפירוק והובלה של פחמימנים ארומטיים אינם מווסתים כלפי מטה אפילו בנוכחות מקור פחמן שני כמו גלוקוז או חומצות אורגניות. כאשר גודלו במדיום של גלוקוז ופחמימנים ארומטיים, נצפה כי הגנים להובלה ומטבוליזם של גלוקוז היו מווסתים כלפי מטה, פחמימנים ארומטיים נוצלו בשלב הלוגריתמי הראשון, וגלוקוז נוצל בשלב הלוגריתמי השני (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). מצד שני, נוכחות חומצות אורגניות לא השפיעה על ביטוי מטבוליזם הפחמימנים הארומטיים, ולכן חיידק זה צפוי להיות זן מועמד למחקרי פירוק ביולוגי (Phale et al., 2020).
ידוע היטב כי ביוטרנספורמציה של פחמימנים יכולה לגרום לעקה חמצונית ולעלייה ברמת האנזימים נוגדי החמצון במיקרואורגניזמים. פירוק ביולוגי לא יעיל של נפתלין, הן בתאים בפאזה נייחת והן בנוכחות תרכובות רעילות, מוביל להיווצרות של מיני חמצן ריאקטיביים (ROS) (Kang et al. 2006). מכיוון שאנזימים המפרקים נפתלין מכילים צבירים של ברזל-גופרית, תחת עקה חמצונית, הברזל בחלבוני ההם ובברזל-גופרית יתחמצן, מה שיוביל לאינטאקטיבציה של חלבונים. Ferredoxin-NADP+ reductase (Fpr), יחד עם superoxide dismutase (SOD), מתווכים את תגובת החיזור ההפיכה בין NADP+/NADPH לבין שתי מולקולות של ferredoxin או flavodoxin, ובכך מסלקים ROS ומשחזרים את מרכז הברזל-גופרית תחת עקה חמצונית (Li et al. 2006). דווח כי גם Fpr וגם SodA (SOD) ב-Pseudomonas יכולים להיגרם על ידי עקה חמצונית, ופעילות מוגברת של SOD וקטלאז נצפתה בארבעה זני Pseudomonas (O1, W1, As1 ו-G1) במהלך גידול בתנאי תוספת נפתלין (Kang et al., 2006). מחקרים הראו כי תוספת של נוגדי חמצון כגון חומצה אסקורבית או ברזל ברזלי (Fe2+) יכולה להגביר את קצב הגידול של נפתלין. כאשר Rhodococcus erythropolis גדל במצע נפתלין, התעתוק של גנים של ציטוכרום P450 הקשורים לעקה חמצונית, כולל sodA (Fe/Mn סופראוקסיד דיסמוטאז), sodC (Cu/Zn סופראוקסיד דיסמוטאז) ו-recA גדל (Sazykin et al., 2019). ניתוח פרוטאומי כמותי השוואתי של תאי פסאודומונס שגודלו בנפתלין הראה כי עלייה ברמת החלבונים השונים הקשורים לתגובת עקה חמצונית היא אסטרטגיית התמודדות עם עקה (Herbst et al., 2013).
דווח כי מיקרואורגניזמים מייצרים חומרים פעילי שטח ביולוגיים תחת פעולת מקורות פחמן הידרופוביים. חומרים פעילי שטח אלה הם תרכובות פעילות שטח אמפיפיליות שיכולות ליצור אגרגטים בממשקי שמן-מים או אוויר-מים. זה מקדם מסיסות מדומה ומקל על ספיחה של פחמימנים ארומטיים, וכתוצאה מכך פירוק ביולוגי יעיל (Rahman et al., 2002). בשל תכונות אלה, חומרים פעילי שטח ביולוגיים נמצאים בשימוש נרחב בתעשיות שונות. הוספת חומרים פעילי שטח כימיים או חומרים פעילי שטח ביולוגיים לתרביות חיידקים יכולה לשפר את היעילות וקצב פירוק הפחמימנים. מבין החומרים הפעילי שטח הביולוגיים, רמנוליפידים המיוצרים על ידי Pseudomonas aeruginosa נחקרו ואופיינו בהרחבה (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). בנוסף, סוגים אחרים של חומרים פעילי שטח ביולוגיים כוללים ליפופפטידים (מוקינים מ-Pseudomonas fluorescens), מתחלב 378 (מ-Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg and Ron, 1999), ליפידים דו-סוכריים מסוג טרהלוז מ-Rhodococcus (Ramdahl, 1985), ליכנין מ-Bacillus (Saraswathy and Hallberg, 2002), וחומר פעיל שטח מ-Bacillus subtilis (Siegmund and Wagner, 1991) ו-Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). חומרים פעילי שטח חזקים אלה הוכחו כמפחיתים את מתח הפנים מ-72 דינים/סמ"ר לפחות מ-30 דינים/סמ"ר, מה שמאפשר ספיגה טובה יותר של פחמימנים. דווח כי Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia ומינים חיידקיים אחרים יכולים לייצר חומרים פעילי שטח שונים מבוססי רמנוליפידים וגליקוליפידים כאשר הם גדלים במצעי נפתלין ומתילנפתלין (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 יכול לייצר את החומר הפעיל שטח החוץ-תאי Biosur-Pm כאשר הוא גדל על תרכובות ארומטיות כגון חומצה נפתואית (Phale et al., 1995). הקינטיקה של יצירת Biosur-Pm הראתה כי הסינתזה שלו היא תהליך תלוי גדילה ו-pH. נמצא כי כמות ה-Biosur-Pm המיוצרת על ידי תאים ב-pH ניטרלי הייתה גבוהה יותר מזו ב-pH 8.5. תאים שגודלו ב-pH 8.5 היו הידרופוביים יותר ובעלי זיקה גבוהה יותר לתרכובות ארומטיות ואליפטיות מאשר תאים שגודלו ב-pH 7.0. ב-Rhodococcus spp. N6, יחס פחמן לחנקן (C:N) גבוה יותר ומגבלת ברזל הם תנאים אופטימליים לייצור ביולוגיים פעילי שטח חוץ-תאיים (Mutalik et al., 2008). נעשו ניסיונות לשפר את הביוסינתזה של ביולוגיים פעילי שטח (פעילי שטח) על ידי אופטימיזציה של זנים ותסיסה. עם זאת, טיטר החומר הפעיל שטח במדיום הגידול נמוך (1.0 גרם/ליטר), דבר המהווה אתגר לייצור בקנה מידה גדול (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). לכן, נעשה שימוש בשיטות הנדסה גנטית כדי לשפר את הביוסינתזה שלו. עם זאת, שינויו ההנדסי קשה עקב גודלו הגדול של האופרון (כ-25 קילו-בייט) והוויסות הביוסינתטי המורכב של מערכת חישת המניין (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). מספר מודיפיקציות של הנדסה גנטית בוצעו בחיידקי Bacillus, שמטרתן העיקרית הייתה להגביר את ייצור הסורפקטין על ידי החלפת הפרומוטר (אופרון srfA), ביטוי יתר של חלבון ייצוא הסורפקטין YerP והגורמים הרגולטוריים ComX ו-PhrC (Jiao et al., 2017). עם זאת, שיטות הנדסה גנטית אלו השיגו רק מודיפיקציה גנטית אחת או מעטות ועדיין לא הגיעו לייצור מסחרי. לכן, יש צורך במחקר נוסף של שיטות אופטימיזציה מבוססות ידע.
מחקרי פירוק ביולוגי של PAH נערכים בעיקר בתנאי מעבדה סטנדרטיים. עם זאת, באתרים מזוהמים או בסביבות מזוהמות, גורמים אביוטיים וביוטיים רבים (טמפרטורה, pH, חמצן, זמינות חומרים מזינים, זמינות ביולוגית של מצע, קסנוביוטיקה אחרת, עיכוב תוצר סופי וכו') הוכחו כמשנים ומשפיעים על יכולת הפירוק של מיקרואורגניזמים.
לטמפרטורה יש השפעה משמעותית על פירוק ביולוגי של PAH. ככל שהטמפרטורה עולה, ריכוז החמצן המומס יורד, דבר המשפיע על חילוף החומרים של מיקרואורגניזמים אירוביים, מכיוון שהם דורשים חמצן מולקולרי כאחד הסובסטרטים עבור אוקסיגנאזות המבצעות הידרוקסילציה או תגובות ביקוע טבעת. לעתים קרובות מצוין כי טמפרטורה גבוהה הופכת את ה-PAHs המקוריים לתרכובות רעילות יותר, ובכך מעכבת את הפירוק הביולוגי (Muller et al., 1998).
צוין כי אתרים רבים המזוהמים על ידי PAH סובלים מערכי pH קיצוניים, כגון אתרים מזוהמים על ידי ניקוז מכרות חומצי (pH 1-4) ואתרי גיזוז גז טבעי/פחם מזוהמים בתשטיפים אלקליים (pH 8-12). תנאים אלה עלולים להשפיע קשות על תהליך הפירוק הביולוגי. לכן, לפני השימוש במיקרואורגניזמים לצורך ביו-רמדיאציה, מומלץ להתאים את רמת ה-pH על ידי הוספת כימיקלים מתאימים (בעלי פוטנציאל חמצון-חיזור בינוני עד נמוך מאוד) כגון אמוניום סולפט או אמוניום חנקתי לקרקעות אלקליות או סיד עם סידן פחמתי או מגנזיום פחמתי לאתרים חומציים (Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020).
אספקת חמצן לאזור הפגוע היא הגורם המגביל את קצב הפירוק הביולוגי של PAH. עקב תנאי החמצון-חיזור של הסביבה, תהליכי ביו-רמדיאציה באתר דורשים בדרך כלל הכנסת חמצן ממקורות חיצוניים (עיבוד, הזזת אוויר והוספה כימית) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) הראו כי הוספת מגנזיום פרוקסיד (תרכובת משחררת חמצן) לאקוויפר מזוהם יכולה לבצע ביולוגיית רימדיאציה יעילה של תרכובות BTEX. מחקר נוסף בחן את הפירוק באתר של פנול ו-BTEX באקוויפר מזוהם על ידי הזרקת נתרן חנקתי ובניית בארות מיצוי כדי להשיג ביולוגיית רימדיאציה יעילה (Bewley and Webb, 2001).