כתובת נוכחית†: OX11 0DE, בריטניה, בניין דיימונד, פארק המדע והחדשנות הארוול, דיטקוט, אוקספורדשייר, בריטניה, Diamond Light Source Co., Ltd., מרכז להדמיה ביולוגית אלקטרונית.
קומפלקס קצירת האור 1 של מרכז התגובה (RC-LH1) הוא המרכיב הפוטוסינתטי המרכזי של חיידקים פוטוטרופיים סגולים. הצגנו שני מבנים במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים של קומפלקס RC-LH1 מ-Rhodopseudomonas palustris. מבנה הרזולוציה של 2.65 Å של קומפלקס RC-LH114-W מורכב מ-14 לולאות LH1 של תת-יחידות המקיפות RC, אשר נקטע על ידי חלבון W, בעוד שהקומפלקס ללא חלבון-W מורכב לחלוטין מהרכב RC מוקף ב-RC. לולאת LH1 סגורה בת 16 תת-יחידות. השוואת המבנים הללו מספקת תובנות לגבי הדינמיקה של כינון בקומפלקס RC-LH1, כולל שינויים קונפורמציוניים שלא נקבעו בעבר בעת קשירת כינון באתר QB של RC, כמו גם מיקום אתרי קישור עזר של כינון, המסייעים להעביר אותם ל-RC. המבנה הייחודי של חלבון W מונע את סגירת לולאת LH1, ובכך יוצר תעלה להאצת חילוף הכינון/כינולון.
האנרגיה המסופקת על ידי פוטוסינתזה יכולה לקיים כמעט את כל החיים על פני כדור הארץ, ויש לה פוטנציאל גדול לביוטכנולוגיה סולארית. חיידקים פוטוטרופיים סגולים, בעודם מקדמים פוטוסינתזה עולמית, מציגים גם מצבי אנרגיה ויכולות מטבוליות שונות. הם יכולים להימנע מפוטוסינתזה ולגדול כחיידקים הטרוטרופיים בחושך, יכולים לקבע חנקן ופחמן דו-חמצני, לייצר מימן ולפרק תרכובות ארומטיות (1-3). על מנת לספק אנרגיה לתהליכים אלה, יש להמיר אור במהירות וביעילות לאנרגיה כימית. תהליך זה מתחיל כאשר קומפלקס האנטנה לוכדת האור סופג אור ומעביר את האנרגיה הלכודה למרכז התגובה (RC), ובכך מתחיל הפרדת מטען (4-7). היחידה הבסיסית של פוטוסינתזה בחיידקים פוטוטרופיים סגולים מורכבת מ-RC מסוג 2, מוקפת בקומפלקס קצירת אור 1 (LH1), ויוצרת את קומפלקס הליבה RC-LH1. LH1 נוצר על ידי מערך של הטרודימרים αβ מעוקלים, שכל אחד מהם נקשר לשתי מולקולות כלורופיל חיידקי (BChl) α וקרוטנואיד אחד או שניים (8-12). אנטנת ה-LH1 הפשוטה ביותר מורכבת מ-16 או 17 הטרודימרים של αβ המקיפים את RC (9-13) בלולאה סגורה, אך בקומפלקסים אחרים של ליבה, פפטידים טרנסממברנליים קוטעים את הרציפות של ה-LH1 שמסביב, ובכך מקדמים את דיפוזיה הקינול/קינון בין RC לקומפלקס ציטוכרום bc1 (11, 13-15). הצמח הפוטוטרופי הסגול Rhodopseudomonas (Rps.) הוא אורגניזם מודל שיכול להבין את העברת האנרגיה והאלקטרונים התומכת בפוטוסינתזה. מבנה הגביש הראשון של Rps. המודל של קומפלקס palustris RC-LH1 הוא RC, מוקף ב-15 לולאות LH1 הטרודימריות, הנקטעות על ידי חלבון לא ידוע בשם "Protein W" (14). חלבון-W זוהה לאחר מכן כ-RPA4402, שהוא חלבון לא מאופיין של 10.5kDa עם שלושה סלילים טרנסממברנליים צפויים (TMH) (16). אנו מציעים לשנות את שם הגן rpa4402 המקודד לחלבון W ל-pufW כדי להיות עקבי עם המינוח המשמש לגנים המקודדים לתת-היחידות RC-L, M ‏(pufL, pufM) ו-LH1α, β ‏(pufA, pufB). מעניין לציין, שחלבון-W קיים רק בכ-10% מ-RC-LH1, דבר שחושף כי Rps. palustris מייצר שני קומפלקסים שונים של RC-LH1. כאן, אנו מדווחים על מבני cryo-EM (cryo-EM) ברזולוציה גבוהה של שני קומפלקסים מרכזיים, אחד עם חלבון W ו-14 הטרודימרים של αβ, השני ללא חלבון W ולולאת LH1 סגורה בת 16 הטרודימרים. המבנה שלנו מייצג שינוי צעד בהבנת קומפלקס RC-LH1 של Rps. palustris, מכיוון שניתחנו את האוכלוסייה ההומוגנית של כל וריאנט ויש לנו רזולוציה מספקת כדי להקצות בבירור כל פפטיד ופיגמנטים קשורים וליפידים וקינונים קשורים. השוואת המבנים הללו מראה ששלושת חלבוני ה-TMH-W שלא נמצאו עד כה באף קומפלקס RC-LH1 אחר יוצרים תעלת כינון כדי להאיץ את חילוף הכינון/כינולון. זוהו מספר אתרי קישור ליפידים וקינונים שמורים, וחשפנו שינוי קונפורמציה חדש לאחר שילוב של כינון ו-RC, שעשוי להתאים ל-RC בפוטוסיסטם II (PSII) של אורגניזמים פוטוטרופיים מחומצנים. הממצאים שלנו מספקים תובנות חדשות לגבי הקינטיקה של קישור וחילוף כינון/כינולון בקומפלקס הליבה RC-LH1 של חיידקים פוטוטרופיים סגולים.
על מנת להקל על מחקר מפורט של שני הקומפלקסים שנמצאו ב-Rps. palustris, בודדנו כל RC-LH1 בשיטות ביוכימיות. הקומפלקס חסר חלבון W (להלן ΔpufW) טוהר מהזן חסר הגן pufW (16), וניתן לייצר רק קומפלקס RC-LH1 אחד. הקומפלקס המכיל חלבון W מיוצר על ידי זן. חלבון W של זן זה עובר שינוי עם תג His פי 10 בקצה C שלו, כך שניתן לשלב ביעילות את הקומפלקס המכיל חלבון W עם רוב חלבון W חסר על ידי קיבוע מתכת. הקומפלקס מופרד ביעילות (16) באמצעות כרומטוגרפיית זיקה (IMAC).
כפי שמוצג באיור 1, שני הקומפלקסים מכילים RC בן שלוש תת-יחידות (RC-L, RC-M ו-RC-H) המוקף באנטנת LH1. מבנה 2.80-A של הקומפלקס חסר החלבון-W מציג 16 הטרודימרים של αβ, היוצרים לולאת LH1 סגורה המקיפה לחלוטין את RC, להלן יכונה קומפלקס RC-LH116. מבנה 2.65Å של הקומפלקס המכיל חלבון-W כולל LH1-הטרודימר 14 הנקטע על ידי חלבון-W, להלן RC-LH114-W.
(A ו-B) ייצוג פני השטח של התרכובת. (C ו-D) פיגמנטים קשורים המתבטאים במוטות. (E ו-F) הקומפלקסים שנצפו מפני השטח הציטופלזמיים כוללים את הפפטידים ותת-היחידות LH1 המיוצגים בקריקטורות, והם ממוספרים בכיוון השעון מפער החלבון-W [בהתאם למספור Rba. קומפלקס sphaeroides (13)]. עבור LH1-α, צבע תת-היחידה של החלבון הוא צהוב; עבור LH1-β, צבע תת-היחידה של החלבון הוא כחול; עבור חלבון-W, החלבון הוא אדום; עבור RC-H, הוא ציאן; עבור RC-L, הוא כתום; עבור RC-M, מג'נטה. קופקטורים מיוצגים על ידי מוטות, ירוק מייצג מולקולות BChl ו-BPh a, סגול מייצג קרוטנואידים, וצהוב מייצג מולקולות UQ10. (G ו-H) תצוגה מוגדלת של פער החלבון-W באזור המקביל של קומפלקס RC-LH114-W (G) וקומפלקס RC-LH116 (H). קופקטורים מוצגים בצורת מילוי חלל, כינון כלאטי מוצג בכחול. הפער בין חלבון ל-W מודגש על ידי קו מקווקו כחול ב-(G), והחורים הקטנים שבהם כינון/כינולול מתפזר על טבעת LH116 מודגשים על ידי קו מקווקו שחור ב-(H).
איור 1 (A ו-B) מציג את ה-RC מוקף במערכים פתוחים או סגורים של הטרודימרים של LH1αβ, שכל אחד מהם נקשר לשני BChl וקרוטנואיד אחד (איור 1, C ו-D). מחקרים קודמים הראו ש-Rps הוא קומפלקס LH1. במסלול הביוסינתטי של קסנטין ספירולינה, מינים אלה מכילים אוכלוסיות מעורבות של קרוטנואידים (17). עם זאת, ספירופירוקסנטין הוא הקרוטנואיד הדומיננטי וצפיפותו מספקת. לכן, בחרנו לדמות את הספירוקסנטין בכל אתרי הקישור של LH1. הפוליפפטידים אלפא ובטא הם TMHs בודדים עם אזורים חיצוניים קצרים של הממברנה (איור 1, A, B, E ו-F). למרות שצפיפות של 17 שיירים בקצה C לא נצפתה, הפוליפפטיד אלפא נותק מ-Met1 ל-Ala46 בשני הקומפלקסים. פוליפפטיד β צומצם מ-Gly4 ל-Tyr52 ב-RC-LH116, ומ-Ser5 ל-Tyr52 ב-RC-LH114-W. לא נצפתה צפיפות של 3 או 4 שאריות N-טרמינליות או 13 שאריות C-טרמינליות (איור S1). ניתוח ספקטרומטריית מסות של הקומפלקס המעורב RC-LH1 שהוכן מהזן הבר הראה שהאזור החסר היה תוצאה של ביקוע הטרולוגי של פפטידים אלה (איור S1 ו-S2). נצפתה גם פורמילציה של α-Met1 ב-N-טרמינליות (f). הניתוח הראה כי ה-α-פפטיד מורכב משאריות fMet1 עד Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, וכי ה-β-פפטיד מורכב משאריות Ser2 עד Ala53, דבר התואם היטב את מפת צפיפות ה-EM בטמפרטורה נמוכה.
קואורדינציה של α-His29 ו-β-His36 יוצרת BChls פנים אל פנים; כל הטרודימר αβ מתאסף עם שכניו ויוצר לולאה פתוחה (RC-LH114-W) או לולאה סגורה (RC-LH116) סביב מערך הפיגמנטים המצומדים לאקסיטונים (איור 1, C ו-D). בהשוואה לפס 877 ננומטר של RC-LH114-W, הסחת האדום של בליעה ב-880 ננומטר של RC-LH116 היא 3 ננומטר (איור 2A). עם זאת, ספקטרום הדיכרואיזם המעגלי כמעט זהה (איור 2B), דבר המצביע על כך שלמרות שקיים הבדל ברור בין לולאות פתוחות וסגורות, הסביבה המקומית של BChls דומה מאוד. הסחת האדום של בליעה עשויה להיות תוצאה של תנועה תרמית מופחתת ויציבות מוגברת בלולאה הסגורה (18, 19), השינוי בצימוד הפיגמנטים הנגרם על ידי הלולאה הסגורה (20, 21), או שילוב של שתי השפעות אלו (11).
(א) ספקטרום בליעה אולטרה סגול/נראה/קרוב אינפרא אדום, ששיאיו מסומנים בפיגמנטים המתאימים ומנורמלים לשיא BPh ב-775 ננומטר. (ב) ספקטרום דיכרואיזם מעגלי מנורמל לבליעה של BChl ב-805 ננומטר. (ג) ו-ד) ספקטרום ΔA נבחר מתוך ספקטרום בליעה בזמן של קומפלקס RC-LH114-W (ג) וקומפלקס RC-LH116 (ד). להשוואה טובה יותר, כל הספקטרומים מנורמלים ל-ΔA של −A ב-0.2 ps. (ה) קצב חמצון ציטוכרום c2 לאחר הקרנה בנוכחות ריכוזים שונים של UQ2 (ראה איור S8 לנתונים גולמיים). (ו) בתאים שגודלו תחת אור בעוצמה נמוכה, בינונית או גבוהה (10, 30 או 300μMm-2 s-1, בהתאמה), תת-היחידות של חלבון W ו-RC-L בקומפלקס המטוהר ויחס הממברנה המופרדת. קבע את רמת החלבון באמצעות אלקטרופורזה בג'ל SDS-polyacrylamide ומבחן אימונו (ראה איור S9 לנתונים גולמיים). קבע את היחס ביחס לקומפלקס RC-LH114-W המטוהר. היחס הסטוכיומטרי של RC-L לחלבון-W של הקומפלקס הוא 1:1.
‏ה-BChls במיקום 1 בלולאת αβ14 המעוותת של RC-LH114-W (איור 1, A, C ו-E) קרובים יותר לתורם העיקרי של RC (P) ב-6.8Å מאשר ה-BChls המקבילים ב-RC-LH116 (איור 1, B, D ו-F, ואיור S3); עם זאת, קינטיקה של ספיגה חולפת של שני הקומפלקסים מראה שעבור RC-LH114-W ו-RC-LH116, קבועי זמן העברת אנרגיית העירור מ-LH1 ל-RC הם 40 ±4 ו-44 ±3 ps (איור 2, C ו-D, איור S4 וטבלה S2). כמו כן, אין הבדל משמעותי בהעברה אלקטרונית בתוך RC (איור S5 וטקסט משלים קשור). אנו חושדים שההתאמה הקרובה של זמן העברת האנרגיה בין LH1 ל-RC-P נובעת מהמרחק, הזווית והאנרגיה הפוטנציאלית הדומים של רוב BChl בשתי לולאות LH1. נראה כי חקירת תבנית האנרגיה של LH1 כדי להגיע למרחק המינימלי אינו מהיר יותר מהעברת אנרגיה ישירה מאתרים תת-אופטימליים ל-RC. לולאת LH1 בלולאה הפתוחה ב-RC-LH114-W עשויה גם היא לעבור תנועה תרמית לא משמעותית בתנאי טמפרטורה נמוכים לצורך ניתוח מבני, ויש קונפורמציה ארוכה יותר של טבעת αβ14 בטמפרטורת החדר ממרחק הפיגמנטציה של βBChls במיקום של RC 1.
הקומפלקס RC-LH116 מכיל 32 BChls ו-16 קרוטנואידים, והסידור הכללי שלו זהה לזה המתקבל מ-Thermochromatium (Tch.) pidpidum [מזהה של בנק נתוני חלבונים (PDB) 5Y5S] (9), זן Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (מזהה PDB 7C9R) (12) ואצות ירוקות (Blc.viridis) (מזהה PDB 6ET5) (10). לאחר היישור, נצפו רק סטיות קטנות במיקומי ההטרודימרים של αβ, במיוחד 1-5, 15 ו-16 (איור S6). לנוכחות חלבון-W יש השפעה משמעותית על מבנה LH1. שלושת ה-TMHs שלו מחוברים באמצעות לולאות קצרות, כאשר הטרמינל N נמצא בצד החלומי של הקומפלקס והטרמינל C בצד הציטופלזמי (איורים 1A ו-3, A עד D). חלבון-W הוא הידרופובי ברובו (איור 3B), ו-TMH2 ו-TMH3 מקיימים אינטראקציה עם LH1αβ-14 ויוצרים משטח טרנסממברני (איור 3, B ו-E עד G). הממשק מורכב בעיקר משאריות Phe, Leu ו-Val באזור הטרנסממברני. שאריות אלו עמוסות בחומצות אמינו הידרופוביות ובפיגמנטים של αβ-14. כמה שאריות פולריות תורמות גם הן לאינטראקציה, כולל קשר המימן בין W-Thr68 ו-β-Trp42 על פני החלל המורכב (איור 3, F ו-G). על פני הציטופלזמה, Gln34 צמוד לקבוצת הקטו של קרוטנואידים של αβ-14. בנוסף, מולקולת n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) נפרדה, וזנבה ההידרופובי התארך עד לממשק בין חלבון-W ו-αβ-14, וייתכן שזנב הליפידים ממוקם בגוף. שמנו לב גם שאזורי הרזולוציה בקצה ה-C של חלבון W ו-RCH קרובים מאוד, אך אינם בטווח של יצירת אינטראקציות ספציפיות (איור 1, A ו-E). עם זאת, ייתכנו אינטראקציות בחומצות האמינו הלא פתורות בקצה ה-C של שני חלבונים אלה, אשר עשויות לספק מנגנון לגיוס חלבון-W במהלך הרכבת הקומפלקס RC-LH114-W.
(א) חלבון-W, הפונה לממשק עם LH1αβ14 בצורת מצויר, בעל שרשרת צד בצורת מוט (אדום), המוצגת בחלק מדיאגרמת הפוטנציאל האלקטרוסטטי (משטח אפור שקוף עם רמת קו מתאר של 0.13). (ב) חלבון-W מיוצג על ידי משטח צבעוני הידרופובי. אזורים פולריים וטעונים מוצגים בציאן, אזורים הידרופוביים מוצגים בלבן, ואזורים הידרופוביים חזקים מוצגים בכתום. (ג ו-ד) חלבון-W מיוצג בציור, כיוונו זהה לזו שב-(א) (ג), ומסובב ב-180° (ד). בהתאם למיקום ברצף, השאריות הניתנות להבחנה מאמצות ערכת צבעי קשת, כאשר הקצה ה-N הוא כחול והקצה ה-C הוא אדום. (ה) חלבון-W באותו מבט כמו ב-(א), והשאריות בממשק של חלבון-W:LH1 מיוצגות על ידי מוטות עם סימנים מחוברים. (F) חלבון-W מסובב ב-90° יחסית ל-(E) ול-LH1αβ14 בייצוג הקריקטורה, ויחסית לשאריות הממשק בייצוג העמודות. השאריות הבולטות מהפוליפפטיד בטא מסומנות. הקו-פקטור מוצג כעמודה התואמת את צבע איור 1, β-DDM המפורק מוצג באפור, והחמצן מוצג באדום. (G) התצוגה ב-(F) מסובבת ב-180°, כאשר השאריות הבולטות של הפוליפפטיד אלפא המסומן.
חלבון-W מחליף הטרודימר αβ (ה-15 באיור 1F), ובכך מונע סגירת לולאה והטיה של שלושת ההטרודימרים הראשונים של αβ. נצפה כי זווית הנטייה המקסימלית של ההטרודימר הראשון של αβ-1 ביחס לנורמלי הסרט הייתה 25° עד 29° (איור 1, A ו-E), אשר נוצרה על ידי הנטייה של 2° עד 8° של αβ-1 ב-RC A sharp contrast-LH116 (איור 1, B ו-F). ההטרודימרים השני והשלישי נוטים ב-12° עד 22° ו-5° עד 10°, בהתאמה. עקב הפרעה הסטרית של RC, הנטייה של αβ-1 אינה כוללת את הזוג השני של αβ (התואם ל-αβ ה-16 באיור 1F), ובכך יוצרת פער ברור בטבעת LH1 (איור 1, A ו-E). עקב היעדר שני הטרודימרים של αβ, המלווים באובדן של ארבעה BChl ושני קרוטנואידים, אף אחד מהקרוטנואידים לא נקשר לתת-היחידה αβ-1 המעוותת, וכתוצאה מכך נוצרת טבעת LH114-W המכילה 13 קרוטנואידים צמחוניים ו-28 BChl. הערכות הרזולוציה המקומית של שני הקומפלקסים באזורים αβ1 עד 7 נמוכות מאלה של שאר לולאת LH1, דבר שעשוי לשקף את הפלסטיות הטבועה של תת-היחידה LH1 הסמוכה לאתר RC QB (איור 4).
התמונות של RC-LH114-W (A ו-B) ו-RC-LH116 (C ו-D) מוצגות מאותו מבט מלמעלה/צדדי (A ו-B) (A ו-C) וממשטח החלל של איור 1 (B ו-D). המקשים הצבעוניים מוצגים מימין.
קומפלקס הליבה האופייני היחיד הנוסף עם יחס סטוכיומטרי של 1:14 הוא הדימר Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). עם זאת, לחלבון W ול-PufX אין הומולוגיה ברורה, ויש להם השפעה משמעותית על מבני ה-LH1 שלהם. PufX הוא TMH יחיד עם דומיין ציטופלזמי N-טרמינלי שמקיים אינטראקציה עם הצד הציטופלזמי של תת-היחידה RC-H (13) במיקום המתאים ל-Rps. palustris LH116αβ-16. PufX יוצר תעלה לחילוף קינון/קינולונים בין RC-LH1 לקומפלקס ציטוכרום bcl והוא קיים בכל קומפלקס הליבה של Rba. sphaeroides (13). למרות שהממשק בין מונומר למונומר נמצא ב-Rba. הדימר sphaeroides RC-LH1-PufX ממוקם בעמדת הקישור של חלבון W ב-RC-LH114-W, והפער הנוצר על ידי PufX וחלבון-W נמצא במיקום שווה ערך (איור S7A). הפער ב-RC-LH114-W מיושר גם עם תעלת הכינון ההיפותטית (8) של Pseudomonas rosea LH1, אשר נוצרת על ידי פפטידים שאינם קשורים לחלבון W או PufX (איור S7B). בנוסף, תעלת הכינון ב-Blc. LH1 בצבע ירוק אזמרגד שנוצר על ידי הוצאת תת-יחידה אחת של γ (7) ממוקם במיקום דומה (איור S7C). למרות שהיא מתווכת על ידי חלבונים שונים, הופעת תעלות הכינון/כינולול הללו במיקום משותף בקומפלקס RC-LH1 נראית כדוגמה לאבולוציה מתכנסת, דבר המצביע על כך שהפער שנוצר על ידי חלבון W עשוי לשמש כתעלת כינון.
הפער בלולאת LH114-W מאפשר היווצרות של אזור ממברנה רציף בין החלל הפנימי של קומפלקס RC-LH114-W לבין הממברנה הגדולה (איור 1G), במקום לחבר את שני הדומיינים דרך נקבובית חלבון כמו בחלבונים. קומפלקס RC-LH116 דומה לקומפלקס Tch. סגור דמוי מחט (22) (איור 1H). מכיוון שהדיפוזיה של כינון דרך הממברנה מהירה יותר מהדיפוזיה דרך תעלת החלבון הצרה, לולאת LH114-W הפתוחה יכולה לאפשר תחלופה מהירה יותר של RC מאשר לולאת LH116 הסגורה, ודיפוזיה של כינון לתוך ה-RC עשויה להיות מוגבלת יותר. על מנת לבדוק האם חלבון W משפיע על המרת הכינונים דרך RC, ביצענו בדיקת חמצון ציטוכרום על ריכוז מסוים של יוביקווינון 2 (UQ2) (אנלוג של UQ10 טבעי עם זנב איזופרן קצר יותר) (איור 2E). למרות שנוכחותו של כינון כלאטי מעכבת את הקביעה המדויקת של קבוע מיכאליס לכאורה (RC-LH114-W ו-RC-LH116 מתאימים ל-0.2±0.1μM ו-0.5±0.2μM, בהתאמה), הקצב המקסימלי של RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) גדול ב-28±5% מ-RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
בתחילה הערכנו כי חלבון-W קיים בכ-10% מקומפלקס הליבה (16); כאן, שיעורי התפוסה של תאי צמיחה בעלי אור נמוך, אור בינוני ואור גבוה הם 15±0.6%, 11±1% ו-0.9±0.5% בהתאמה (איור 2F). השוואה כמותית של ספקטרומטריית מסות הראתה כי הוספת תג היסטידין לא הפחיתה את השפע היחסי של חלבון-W בהשוואה לזנים מסוג בר (P = 0.59), כך שרמות אלו אינן ארטיפקט של חלבון-W שעבר שינוי (איור S10). עם זאת, תפוסה נמוכה זו של חלבון-W בקומפלקס RC-LH1 עשויה לאפשר לחלק מה-RCs להתהפך בקצב מואץ, ובכך למתן את חילוף הכינון/כינולונים האיטי יותר בקומפלקס RC-LH116. שמנו לב ששיעור התפוסה הגבוה באור אינו עולה בקנה אחד עם נתוני הטרנסקריפטומיקה האחרונים, המצביעים על כך שביטוי הגן pufW עולה תחת אור חזק (איור S11) (23). ההבדל בין שעתוק pufW לבין שילוב חלבון-W בקומפלקס RC-LH1 מבלבל ועשוי לשקף את הרגולציה המורכבת של החלבון.
ב-RC-LH114-W, 6 מולקולות קרדיוליפין (CDL), 7 פוספטידילכולין (POPC), פוספטידיגליצרול אחד (POPG) ו-29 מולקולות β-DDM מוקצות ומודולמות בו: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG ו-12 βDDM. RC-LH116 (איור 5, A ו-B). בשני מבנים אלה, CDL ממוקם כמעט בצד הציטופלזמי של הקומפלקס, בעוד ש-POPC, POPG ו-β-DDM ממוקמים בעיקר בצד הלומינל. שתי מולקולות ליפיד ודטרגנטים בודדו באזור αβ-1 עד αβ-6 של קומפלקס RC-LH114-W (איור 5A), וחמש בודדו באזור המקביל של RC-LH116 (איור 5B). בצד השני של הקומפלקס נמצאו יותר ליפידים, בעיקר CDL, שהצטברו בין RC ו-αβ-7 עד αβ-13 (איור 5, A ו-B). ליפידים וחומרי ניקוי אחרים בעלי מבנה נפרד ממוקמים מחוץ לטבעת LH1, ושרשראות אציל בעלות מבנה נפרד משתרעות בין תת-היחידות LH1, המסומנות באופן זמני כ-β-DDM ב-RC-LH114-W, ומוגדרות כ-β-DDM ב-RC A. תערובת של β-DDM ו-POPC-LH116. המיקומים הדומים של ליפידים וקלאטים וחומרי ניקוי במבנה שלנו מצביעים על כך שהם אתרי קישור רלוונטיים פיזיולוגית (איור S12A). גם למיקומים של מולקולות מקבילות ב-Tch יש עקביות טובה. Gentle ו-Trv. זן 970 RC-LH1s (איור S12, B עד E) (9, 12) ושאריות קשרי המימן של קבוצת ראש השומנים הראו שימור טוב למדי ביישור הרצף (איור S13), דבר המצביע על כך שאתרים אלו, אשר נקשרו ל-CDL (24), עשויים להישמר בקומפלקס RC-LH1.
(A ו-B) פפטידים של RC-LH114-W (A) ו-RC-LH116 (B) מיוצגים על ידי איורים, והפיגמנטים מיוצגים על ידי מוטות, באמצעות ערכת הצבעים באיור 1. ליפידים מוצגים באדום, וחומרי ניקוי מוצגים באפור. קשרי מימן הקשורים לאתרי RC QA ו-QB הם צהובים, בעוד שקשרי מימן מבודד הם כחולים. (C ו-D) אותם תצוגות כמו (A) ו-(B), ללא ליפידים. (E עד G) תצוגה מוגדלת של Q1(E), Q2(F) ו-Q3(G) מ-RC-LH116, עם שרשראות צד המשפיעות זו על זו. קשרי המימן מוצגים כקווים מקווקווים שחורים.
ב-RC-LH116, גם RC QA וגם QB UQ, המשתתפים בהעברת אלקטרונים בתהליך הפרדת המטען, מתפרקים באתרי הקישור שלהם. עם זאת, ב-RC-LH114-W, כינון QB לא הופרד ויידון בפירוט בהמשך. בנוסף לכינונים QA ו-QB, שתי מולקולות UQ קהילתיות (הממוקמות בין טבעות RC ו-LH1) מוקצות במבנה RC-LH114-W בהתאם לקבוצות הראש הקהילות שלהן (הממוקמות ב-Q1 וב-Q2, בהתאמה). (איור 5C). שתי יחידות איזופרן מוקצות ל-Q1, ומפת הצפיפות פותרת את 10 זנבות האיזופרן המלאים של Q2. במבנה של RC-LH116, שלוש מולקולות UQ10 קהילתיות (Q1 עד Q3, איור 5D) הופרדו, ולכל המולקולות יש צפיפות ברורה לאורך הזנב (איור 5, D עד G). בשני המבנים, למיקומם של קבוצות ראש הכינון של Q1 ו-Q2 יש עקביות מצוינת (איור S12F), והם מקיימים אינטראקציה רק ​​עם RC. Q1 ממוקם בכניסה לפער W של RC-LH114-W (איור 1G ו-5, C, D ו-E), ו-Q2 ממוקם ליד אתר הקישור QB (איור 5, C, D) ו-F). שיירי L-Trp143 ו-L-Trp269 השמורים קרובים מאוד ל-Q1 ו-Q2 ומספקים אינטראקציות פוטנציאליות של π-stacking (איור 5, E ו-F, ואיור S12). L-Gln88, 3.0 Å מהחמצן הדיסטלי של Q1, מספק קשר מימן חזק (איור 5E); שיירי זה שומר בכל RCs למעט הקשר הרחוק ביותר (איור S13). L-Ser91 מוחלף באופן שמרני במקום Thr ברוב ה-RCs האחרים (איור S13), הוא 3.8 אנגסטרם מהמתיל חמצן של Q1, ועשוי לספק קשרי מימן חלשים (איור 5E). נראה כי ל-Q3 אין אינטראקציה ספציפית, אך הוא ממוקם באזור ההידרופובי בין תת-היחידה RC-M לתת-היחידות LH1-α 5 עד 6 (איור 5, D ו-G). Q1, Q2 ו-Q3 או קינונים קלטריים סמוכים נפרדו גם הם ב-Tch. Gentle, Trv. Strain 970 ו-Blc. מבנה הקשתית (9, 10, 12) מצביע על אתר קישור קינון עזר שמור בקומפלקס RC-LH1 (איור S12G). חמשת מולקולות ה-UQ המפורקות ב-RC-LH116 תואמות היטב את ה-5.8±0.7 של כל קומפלקס שנקבע על ידי כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), בעוד ששלושת מולקולות ה-UQ המפורקות ב-RC-LH114-W נמוכות מ-. הערך הנמדד של 6.2±0.3 (איור S14) מצביע על כך שישנן מולקולות UQ לא פתורות במבנה.
הפוליפפטידים הפסאודו-סימטריים L ו-M מכילים כל אחד חמישה TMHs ויוצרים הטרודימר המשלב דימר BChl אחד, שני מונומרים של BChl, שני מונומרים של בקטריופאג'ים (BPh), ומולקולת ברזל לא-הם אחת ומולקולה אחת או שתיים של UQ10. באמצעות נוכחות קשרי מימן על קבוצת הקטון הסופית והצטברותה הידועה ב-Rps, קרוטנואידים משולבים בתת-היחידה M, הנקראת cis-3,4-dehydroorhodopin. מינים (25). תחום הממברנה החיצונית של RC-H מעוגן לממברנה על ידי TMH יחיד. מבנה ה-RC הכולל דומה לשלוש תת-היחידות RC של מינים קרובים (כגון Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). המקרו-מחזורים של BChl ו-BPh, עמוד השדרה הקרוטנואידי וברזל לא-הם חופפים בטווח הרזולוציה של מבנים אלה, כמו גם קבוצת הראש UQ10 באתר QA והכינון QB ב-RC-LH116 (איור S15).
הזמינות של שני מבני RC עם שיעורי תפוסה שונים של אתרי QB מספקת הזדמנות חדשה לבחון את השינויים הקונפורמציוניים העקביים הנלווים לקשירת כינון QB. בקומפלקס RC-LH116, כינון QB ממוקם במיקום "פרוקסימלי" קשור במלואו (26), אך ההפרדה של RC-LH114-W אינה מכילה כינון QB. אין כינון QB ב-RC-LH114-W, וזה מפתיע מכיוון שהקומפלקס פעיל, יותר מקומפלקס RC-LH116 עם כינון QB מנותק מבנית. למרות ששתי טבעות LH1 מקשרות כשישה כינונים, חמישה מנותקים מבנית בטבעת RC-LH116 הסגורה, בעוד שרק שלושה מוגבלים מבנית בטבעת RC-LH114-W הפתוחה. אי-סדר מבני מוגבר זה עשוי לשקף את ההחלפה המהירה יותר של אתרי QB RC-LH114-W, קינטיקה מהירה יותר של כינון בקומפלקס, ואת הסבירות המוגברת לחצות את לולאת LH1. אנו מציעים כי היעדר UQ באתר RC QB של RC-LH114-W עשוי להיות תוצאה של קומפלקס מורכב ופעיל יותר, ואתר QB של RC-LH114-W הוקפא באופן מיידי בתחלופת UQ. השלב הספציפי (הכניסה לאתר QB נסגרה) משקף את הקונפורמציה של פעילות זו.
ללא QB, הסיבוב הנלווה של L-Phe217 למצב שאינו תואם לקשירת UQ10, מכיוון שהוא יגרום להתנגשות מרחבית עם יחידת האיזופרן הראשונה של הזנב (איור 6A). בנוסף, השינויים הקונפורמציוניים העיקריים הברורים ניכרים, במיוחד הסליל de (סליל קצר בלולאה בין TMH D ו-E) שבו L-Phe217 מוזז לכיס הקישור QB והסיבוב של L-Tyr223 (איור 6A) כדי לשבור את קשר המימן עם מסגרת M-Asp45 ולסגור את הכניסה לאתר הקישור QB (איור 6B). הסליל de מסתובב בבסיסו, Cα של L-Ser209 מוזז ב-0.33Å, בעוד ש-L-Val221Cα מוזז ב-3.52Å. אין שינויים נצפים ב-TMH D ו-E, הניתנים לחפיפה בשני המבנים (איור 6A). ככל הידוע לנו, זהו המבנה הראשון ב-RC הטבעי שסוגר את אתר ה-QB. השוואה עם המבנה המלא (קשור ל-QB) מראה שלפני שהכינון עובר חיזור, נדרש שינוי קונפורמציה כדי לגרום לו להיכנס לכינון. L-Phe217 מסתובב ויוצר אינטראקציית π-stacking עם קבוצת הראש של הכינון, והסליל זז החוצה, מה שמאפשר לשלד של L-Gly222 ולשרשרת הצדדית של L-Tyr223 ליצור רשת קשרי מימן עם מבנה קשרי מימן יציב (איור 6, A ו-C).
(א) קריקטורה חופפת של הולוגרמה (שרשרת L, שרשרת כתומה/שרשרת M, מג'נטה) ומבנה אפו (אפור), שבה השאריות המרכזיות מוצגות בצורת ייצוג דמוי מוט. UQ10 מיוצג על ידי פס צהוב. הקו המקווקו מציין את קשרי המימן שנוצרו במבנה כולו. (ב) ו-ג) ייצוג פני השטח של האפוליפופרוטאין ומבנה הטבעת כולו, תוך הדגשת חמצן שרשרת הצד של L-Phe217 בכחול ו-L-Tyr223 באדום, בהתאמה. תת-היחידה L היא כתומה; תת-היחידות M ו-H אינן צבועות. (ד) ו-ה) אתרי אפוליפופרוטאין (ד) ואתרי RC QB שלמים (ה) [צביעה לפי (א) בהתאמה] ו-Thermophilus thermophilus PSII (ירוק, כחול עם כינון פלסטי; מזהה PDB: 3WU2) יישור (58).
באופן בלתי צפוי, למרות שקיימים מספר מבנים של תאי RC חסרי QB ללא LH1, השינויים הקונפורמציוניים שנצפו במחקר זה לא דווחו בעבר. אלה כוללים את מבנה דלדול ה-QB מ-Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ו-Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), שכולם כמעט זהים למבנה ה-QB הכולל שלהם. בדיקה מדוקדקת של 3PRC גילתה שמולקולות דטרגנטים LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) נקשרות בכניסה למיקום QB, מה שעשוי למנוע סידור מחדש לקונפורמציה סגורה. למרות ש-LDAO אינו מתפרק באותו מיקום ב-1EYS או 1OGV, תאי RC אלה מוכנים באמצעות אותו דטרגנטים ולכן עשויים לייצר את אותה השפעה. מבנה הגביש של Rba. נראה שגם ל-Sphaeroides RC שהתגבש יחד עם ציטוכרום c2 (PDB ID: 1L9B) יש אתר QB סגור. עם זאת, במקרה זה, האזור ה-N-טרמינלי של הפוליפפטיד RC-M (המקיים אינטראקציה עם אתר הקישור QB דרך קשר H של שארית Tyr על סליל Q) מאמץ קונפורמציה לא טבעית, ושינוי הקונפורמציה של QB לא נחקר עוד (30). מה שמעצים הוא שלא ראינו סוג זה של דפורמציה של הפוליפפטיד M במבנה RC-LH114-W, שהוא כמעט זהה לאזור ה-N-טרמינלי של RC-LH116 RC. כמו כן יש לציין שלאחר מיגור אנטנת LH1 מבוססת דטרגנטים, RCs האפוליפופרוטאין ב-PDB נפתרו, מה שביטל את מאגרי הכינון הפנימיים והליפידים בפער שבין ה-RC למשטח הפנימי של טבעת LH1 שמסביב (31, 32). RC נשאר פונקציונלי משום שהוא שומר על כל הקופקטורים, למעט כינון QB הניתן לפירוק, שהוא פחות יציב ולעתים קרובות אובד במהלך תהליך ההכנה (33). בנוסף, ידוע כי הסרת LH1 וליפידים מחזוריים טבעיים מ-RC יכולה להשפיע על תפקודים, כגון קיצור תוחלת החיים של מצב P+QB המופרד במטען (31, 34, 35). לכן, אנו משערים כי קיומה של טבעת LH1 מקומית המקיפה את ה-RC עשוי לשמור על אתר ה-QB ה"סגור", ובכך לשמר את הסביבה המקומית ליד ה-QB.
למרות שאפוליפופרוטאין (ללא כינון QB) והמבנה המלא מייצגים רק שתי תמונות מצב של תחלופת אתר ה-QB, ולא סדרה של אירועים, ישנן אינדיקציות לכך שניתן לשלוט בקישור כדי למנוע קישור חוזר על ידי הידרוקינון כדי לעכב עיכוב סובסטרט. האינטראקציה של כינולול וכינון ליד אתר ה-QB של אפוליפופרוטאין עשויה להיות שונה, מה שמוביל לדחייתו על ידי RC. הוצע זה מכבר ששינויים קונפורמציוניים ממלאים תפקיד בקישור ובחיזור של כינונים. היכולת של RCs קפואים להפחית כינונים לאחר הסתגלות לחושך נפגעת (36); קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן מראה שנזק זה נובע מכלידת כינונים QB בקונפורמציה "דיסטלית" כ-4.5Å מהמיקום הפרוקסימלי הפעיל (26, 37). אנו מציעים שקונפורמציה דיסטלית זו של קישור היא תמונה מצבית של מצב הביניים בין אפוליפופרוטאין למבנה הטבעת המלא, אשר עוקב אחר האינטראקציה הראשונית עם כינון ופתיחת אתר ה-QB.
ל-RC מסוג II שנמצא בקומפלקס PSII של חיידקים פוטוטרופיים מסוימים, ציאנובקטריה, אצות וצמחים יש שימור מבני ותפקודי (38). היישור המבני המוצג באיור 6 (D ו-E) מדגיש את הדמיון בין RCs PSII לאתר QB של קומפלקס RC חיידקי. השוואה זו משמשת זה מכבר מודל לחקר המערכות הקרובות של קשירה וחיזור כינונים. פרסומים קודמים הציעו ששינויים קונפורמציה מלווים בחיזור PSII של כינונים (39, 40). לכן, בהתחשב בשימור האבולוציוני של RC, מנגנון קשירה זה, שלא נצפה בעבר, עשוי להיות ישים גם לאתר QB של RC PSII בצמחים פוטוטרופיים מחומצנים.
זני Rps ΔpufW (מחיקה לא מסומנת של pufW) ו-PufW-His (חלבון W מתויג פי 10 ב-C-טרמינל, המתבטא מלוקוס pufW טבעי). palustris CGA009 תואר בעבודה קודמת שלנו (16). זנים אלה וההורה האיזוגני מסוג בר חולצו מהמקפיא על ידי הדבקת מספר קטן של תאים על צלחת PYE (כל אחד 5 גרם ליטר) (מאוחסן ב-LB ב-80°C-, המכילה 50% (w/v) גליצרול), חלבון, תמצית שמרים וסוקסינט) אגר [1.5% (w/v)]. הצלחת הודגרה למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר בתנאים אנאירוביים, ולאחר מכן הוארה באור לבן (~50 מיקרומול-2 s-1) שסופק על ידי נורות הלוגן OSRAM 116-W (RS Components, UK) למשך 3 עד 5 ימים עד להופעת מושבה אחת. מושבה אחת שימשה להזנת 10 מ"ל של מצע M22+ (41) בתוספת 0.1% (w/v) חומצות קזאמינו (להלן M22). התרבית גודלה בתנאי חמצן נמוכים בחושך ב-34°C תוך ניעור ב-180 סל"ד למשך 48 שעות, ולאחר מכן 70 מ"ל מהתרבית הוזנתה באותם תנאים למשך 24 שעות. תרבית חצי-אירובית בנפח של 1 מ"ל שימשה להזנת 30 מ"ל של מצע M22 בבקבוק זכוכית שקוף אוניברסלי עם מכסה הברגה של 30 מ"ל והוקרנה תוך ערבוב (~50μmol-2 s-1) למשך 48 שעות באמצעות מוט ערבוב מגנטי סטרילי. לאחר מכן, 30 מ"ל מהתרבית הוזנתה בכליטר אחד של תרבית תחת אותם תנאים, אשר שימשה לאחר מכן להזנת כ-9 ליטר של תרבית מוארת ב-~200 μmol-2 s-1 למשך 72 שעות. התאים נאספו באמצעות צנטריפוגה ב-7132 RCF למשך 30 דקות, הושעו מחדש בכ-10 מ"ל של 20 mM טריס-HCl (pH 8.0), ואוחסנו ב-20°C- עד לצורך.
לאחר ההפשרה, הוסיפו כמה גבישים של דאוקסיריבונוקלאז I (Merck, בריטניה), ליזוזים (Merck, בריטניה) ושתי טבליות מעכבי הולואנזים פרוטאז של Roche (Merck, בריטניה) לתאים שהושעו מחדש. בתא לחץ צרפתי בלחץ של 20,000 psi (Aminco, ארה"ב), התאים נקרעו 8 עד 12 פעמים. לאחר הסרת תאים שלמים ופסולת בלתי מסיסת על ידי צנטריפוגה ב-18,500 RCF למשך 15 דקות ב-4°C, הממברנה הושקעה מהליזט הפיגמנטי על ידי צנטריפוגה ב-113,000 RCF למשך שעתיים ב-43,000°C. השליכו את החלק המסיס והשעו מחדש את הממברנה הצבעונית ב-100 עד 200 מ"ל של 20 mM tris-HCl (pH 8.0) והומוגנו עד שאין אגרגטים גלויים. הממברנה התלויה הודגרה ב-20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, ארה"ב) המכילה 2% (w/v) β-DDM למשך שעה אחת בחושך ב-4°C תוך ערבוב עדין. לאחר מכן עברו צנטריפוגה ב-70°C כדי להמיס 150,000 RCF ב-4°C למשך שעה אחת כדי להסיר שאריות של חומרים בלתי מסיסים.
הממברנה המסיסת מזן ΔpufW הונחה על עמודת חילופי יונים מסוג DEAE Sepharose בנפח 50 מ"ל עם שלושה נפחי עמודה (CV) של בופר קשירה [20 mM tris-HCl (pH 8.0) המכיל 0.03% (w/v) β-DDM]. שטפו את העמודה עם שני בופרי קשירה CV, ולאחר מכן שטפו את העמודה עם שני בופרי קשירה המכילים 50 mM NaCl. קומפלקס RC-LH116 עבר אליציה עם גרדיאנט לינארי של 150 עד 300 mM NaCl (בבופר קשירה) ב-1.75 CV, וקומפלקס הקישור הנותר עבר אליציה עם בופר קשירה המכיל 300 mM NaCl ב-0.5 CV. אספו את ספקטרום הקליטה בין 250 ל-1000 ננומטר, שמרו על השבר עם יחס ספיגה (A880/A280) גדול מ-1 בטווח של 880 עד 280 ננומטר, דללנו אותו פעמיים בבופר הקישור, והשתמשו באותו הליך שוב בעמודת DEAE בטיהור. דללנו את השברים עם יחסי A880/A280 גבוהים מ-1.7 ויחסי A880/A805 גבוהים מ-3.0, בצעו את הסיבוב השלישי של חילוף יונים, ושמרו שברים עם יחסי A880/A280 גבוהים מ-2.2 ויחסי A880/A805 גבוהים מ-5.0. הקומפלקס שעבר טיהור חלקי רוכז לכ-2 מ"ל במסנן צנטריפוגלי Amicon 100,000 מולקולרי משקל סף (MWCO) (Merck, בריטניה), והועמס על עמודת אי הכללת גודל Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, ארה"ב) המכילה בופר NaCl 200 mM, ולאחר מכן עבר אלציה באותו בופר ב-1.5 CV. אספו את ספקטרום הקליטה של ​​מקטע אי הכללת הגודל, ורכזו את ספקטרום הקליטה עם יחסי A880/A280 מעל 2.4 ויחסי A880/A805 מעל 5.8 עד 100 A880, והשתמשו בהם מיד להכנת רשת cryo-TEM או אחסון. שמרו בטמפרטורה של -80°C עד הצורך.
הממברנה הממסה מזן PufW-His הוחלה על עמודת HisPrep FF Ni-NTA Sepharose בנפח 20 מ"ל (20 mM tris-HCl (pH 8.0) המכילה 200 mM NaCl ו-0.03% (w/w)) בבופר IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. העמודה נשטפה עם חמישה CVs של בופר IMAC, ולאחר מכן עם חמישה CVs של בופר IMAC המכיל 10 mM היסטידין. קומפלקס הליבה חולק מהעמודה עם חמישה בופרים IMAC המכילים 100 mM היסטידין. הפרקציה המכילה את קומפלקס RC-LH114-W מרוכזת לכ-10 מ"ל במיכל ערבוב המצויד במסנן Amicon 100,000 MWCO (Merck, בריטניה), מדוללת פי 20 עם בופר קשירה, ולאחר מכן נוספה ל-25 מ"ל. בעמודת DEAE Sepharose, נעשה שימוש מראש בארבעה CVs הקשורים לבופר. שטפו את העמודה עם ארבעה בופרים של קשירת CV, לאחר מכן עברו אלוטציה של הקומפלקס על שמונה CVs בשיפוע ליניארי של 0 עד 100 mM NaCl (בבופר קשירה), ואת ארבעת ה-CVs הנותרים עברו אלוטציה של 100 mM בופר קשירה. הקומפלקסים הנותרים שעברו אלוטציה על נתרן כלורי בשילוב עם יחס A880/A280 גבוה מ-2.4 ויחס A880/A805 גבוה מ-4.6 רוכזו ל-~2 מ"ל במסנן צנטריפוגלי Amicon 100,000 MWCO, ומולאו בעמודת אי-הכללה בגודל Superdex 200 16/600 שעברה איזון מראש עם בופר, ולאחר מכן עברו אלוטציה באותו בופר מעל 1.5 CV. אספו את ספקטרום הקליטה של ​​שברי אי-הכללת הגודל ורכזו את ספקטרום הקליטה עם יחסי A880/A280 מעל 2.1 ויחסי A880/A805 מעל 4.6 עד 100 A880, אשר משמשים מיד להכנת רשת TEM קפואה או מאוחסנים ב-80°C- עד לצורך.
להכנת רשתות TEM בטמפרטורה נמוכה נעשה שימוש במקפיא טבילה Leica EM GP. הקומפלקס דולל בבופר IMAC ל-A880 של 50, ולאחר מכן הועמס 5 מיקרוליטר על רשת נחושת מצופה פחמן QUANTIFOIL 1.2/1.3 שפרקה חדשה בזוהר (Agar Scientific, UK). דגירה של הרשת ב-20°C ולחות יחסית של 60% למשך 30 שניות, לאחר מכן יבשה בכתף ​​למשך 3 שניות, ולאחר מכן כבה אותה באתאן נוזלי ב-176°C-.
נתוני הקומפלקס RC-LH114-W נרשמו ב-eBIC (מרכז הדמיה ביולוגית אלקטרונית) (British Diamond Light Source) באמצעות מיקרוסקופ Titan Krios, הפועל במתח תאוצה של 300kV, עם הגדלה נומינלית של ×130,000 ואנרגיה של - בחרו מרווח של 20 eV. נעשה שימוש במיקרוסקופ Gatan 968 GIF Quantum עם גלאי שיא K2 כדי להקליט תמונות במצב ספירה ולאסוף נתונים. גודל הפיקסל המכויל הוא 1.048Å, וקצב המינון הוא 3.83 e-Å-2s-1. הסרט נאסף תוך 11 שניות וחילק אותו ל-40 חלקים. השתמשו באזור המצופה פחמן כדי למקד מחדש את המיקרוסקופ, ולאחר מכן אספו שלושה סרטים לכל חור. בסך הכל נאספו 3130 סרטים, עם ערכי דפוקס בין -1 ל- -3μm.
הנתונים עבור קומפלקס RC-LH116 נאספו באמצעות אותו מיקרוסקופ במעבדת Asterbury Biostructure (אוניברסיטת לידס, בריטניה). הנתונים נאספו במצב ספירה עם הגדלה של 130k, וגודל הפיקסל כייל ל-1.065Å עם מינון של 4.6 e-Å-2s-1. הסרטון צולם ב-12 שניות וחולק ל-48 חלקים. בסך הכל נאספו 3359 סרטים, עם ערכי דפוקוס בין -1 ל- -3μm.
כל עיבוד הנתונים מתבצע בצינור Relion 3.0 (42). השתמשו ב-Motioncorr 2 (43) כדי לתקן את תנועת הקרן על ידי שקלול מינון, ולאחר מכן השתמשו ב-CTFFIND 4.1 (44) כדי לקבוע את פרמטר CTF (פונקציית העברת ניגודיות). פוטומיקרוגרפים אופייניים לאחר שלבי עיבוד ראשוניים אלה מוצגים באיור 2. S16. תבנית הבחירה האוטומטית נוצרת על ידי בחירה ידנית של כ-250 פיקסלים מתוך 1000 חלקיקים במסגרת של 250 פיקסלים וללא סיווג דו-ממדי (2D) ייחוס, ובכך דוחים את הסיווגים שעומדים בדרישות זיהום הדגימה או שאין להם מאפיינים ניתנים להבחנה. לאחר מכן, בוצעה בחירה אוטומטית על כל המיקרוגרפים, ו-RC-LH114-W היה 849,359 חלקיקים, וקומפלקס RC-LH116 היה 476,547 חלקיקים. כל החלקיקים שנבחרו עברו שני סבבים של סיווג דו-ממדי שאינו מבוסס על ייחוס, ולאחר כל סיבוב, החלקיקים שעומדים בדרישות אזור הפחמן, זיהום הדגימה, ללא מאפיינים ברורים או חלקיקים חופפים מאוד נדחו, וכתוצאה מכך נרכשו 772,033 (90.9%) ו-359,678 (75.5%) חלקיקים המשמשים לסיווג תלת-ממדי של RC-LH114-W ו-RC-LH116 בהתאמה. מודל הייחוס התלת-ממדי הראשוני נוצר באמצעות שיטת ירידת גרדיאנט סטוכסטית. תוך שימוש במודל הראשוני כנקודת ייחוס, החלקיקים שנבחרו מסווגים לארבע קטגוריות בתלת-ממד. תוך שימוש במודל בקטגוריה זו כנקודת ייחוס, בצעו עידון תלת-ממדי על החלקיקים בקטגוריה הגדולה ביותר, לאחר מכן השתמשו במסנן מעביר הנמוכים הראשוני של 15Å כדי לכסות את אזור הממס, הוסיפו 6 פיקסלים של קצוות רכים, ועבדו לאחר מכן את הפיקסלים כדי לתקן את פונקציית העברת המודולציה של שיא Gatan K2 של הגלאי העליון. עבור מערך הנתונים RC-LH114-W, מודל ראשוני זה שונה על ידי הסרת הצפיפות החזקה בקצוות המסכה (מנותקת מצפיפות הקומפלקס הליבה בכימרה של UCSF). המודלים המתקבלים (הרזולוציות של RC-LH114-W ו-RC-LH116 הן 3.91 ו-4.16Å, בהתאמה) משמשים כנקודת ייחוס לסבב השני של סיווג תלת-ממדי. החלקיקים ששימשו מקובצים למחלקה התלת-ממדית הראשונית ואינם מכילים קורלציה חזקה עם השכנות. חפיפה או היעדר מאפיינים מבניים ברורים. לאחר סבב הסיווג התלת-ממדי השני, נבחרה הקטגוריה עם הרזולוציה הגבוהה ביותר [עבור RC-LH114-W, קטגוריה אחת היא 377,703 חלקיקים (44.5%), עבור RC-LH116, ישנן שתי קטגוריות, בסך הכל 260,752 חלקיקים (54.7%), כאשר הן זהות רק כאשר הן מיושרות לאחר הסיבוב הראשוני עם הבדל קטן]. החלקיקים שנבחרו מופקים מחדש בקופסה של 400 פיקסלים ומעודנים באמצעות זיקוק תלת-ממדי. מסיכת הממס נוצרת באמצעות מסנן מעביר נמוך ראשוני של 15Å, הרחבת מפה של 3 פיקסלים ומסכה רכה של 3 פיקסלים. באמצעות זיקוק CTF לכל חלקיק, תיקון תנועה לכל חלקיק והסיבוב השני של זיקוק CTF לכל חלקיק, מבוצעים זיקוק תלת-ממדי, מיסוך ממס ועיבוד לאחר מכן לאחר כל שלב כדי לעדן עוד יותר את המרקם המתקבל. באמצעות ערך החיתוך של FSC (מקדם מתאם מעטפת פורייה) של 0.143, הרזולוציות של המודלים הסופיים של RC-LH114-W ו-RC-LH116 הן 2.65 ו-2.80Å, בהתאמה. עקומת FSC של המודל הסופי מוצגת באיור 2. S17.
כל רצפי החלבונים הורדו מ-UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) שימש לבניית מודל הומולוגיה של RC, המכיל את רצפי החלבונים של RC-L, RC-M ו-RC-H ואת מבנה הגביש של Rba. sphaeroides RC שימש כתבנית (PDB ID: 5LSE) (46). השתמשו בכלי "התאמה למפה" ב-UCSF Chimera כדי להתאים את המודל שנוצר למפה (47), לשפר את מבנה החלבון, ולהוסיף קו-פקטור [4×BChl a (שם שארית ספריית המונומרים = BCL), 2×BPh a (BPH), סוג אחד או שניים של UQ10 (U10), ברזל לא-הם אחד (Fe) ו-3,4-דיהידרו-הקסקרבונילכולין אחד (QAK)] באמצעות Coot (48). מכיוון ש-QAK אינו זמין בספריית המונומרים, הוא עבר פרמטריזציה באמצעות כלי eLBOW ב-PHENIX (49).
לאחר מכן, נבנתה תת-היחידה LH1. בתחילה, כלי הבנייה האוטומטי ב-PHENIX (49) שימש לבנייה אוטומטית של חלק מרצף LH1 באמצעות המפה ורצפי החלבונים LH1-α ו-LH1-β כקלט. בחר את תת-היחידה השלמה ביותר של LH1, חילץ אותה וטען אותה לתוך Coot, הוסף ידנית את הרצף החסר בה, ושפר ידנית את המבנה כולו לפני הוספת שני BCls a (BCL) וספירילוקסנטין (CRT) [בהתאם ל-Rps הרלוונטי. צפיפות קומפלקס LH1 ותכולת הקרוטנואידים הידועה. מינים (17)]. העתק את תת-היחידה המלאה של LH1, והשתמש בכלי "Docking Map Tool" של כימרה של UCSF כדי לעגון באזור הסמוך שאינו מודל של צפיפות LH1, ולאחר מכן שפר אותה ב-Coot; חזור על התהליך עד שכל תת-היחידות LH1 מודלו. עבור מבנה RC-LH114-W, על ידי חילוץ הצפיפות הלא מוקצית ב-Coot, החלבון מחולק מהרכיבים שאינם חלבונים הנותרים במפת הכימרה של USCF וכלי הבנייה האוטומטית משמש ליצירת המודל הראשוני ותת-היחידות הנותרות (חלבון-W). מידול. ב-PHENIX (49). הוסף את כל הרצפים החסרים למודל המתקבל ב-Coot (48), ולאחר מכן שפר ידנית את כל תת-היחידה. הצפיפות הנותרת הלא מוקצית מתאימה לשילוב של ליפידים (מזהה ספריית מונומר PDB של CDL = CDL, POPC = 6PL ו-POPG = PGT), דטרגנטים β-DDM (LMT) ומולקולות UQ10 (U10). השתמש באופטימיזציה של PHENIX (49) ובאופטימיזציה ידנית ב-Coot (48) כדי לשכלל את המודל הראשוני המלא עד שלא ניתן לשפר עוד יותר את סטטיסטיקות המודל ואת האיכות החזותית של ההתאמה. לבסוף, השתמש ב-LocScale (50) כדי לחדד את המפה המקומית, ולאחר מכן בצע מספר מחזורים נוספים של מידול הצפיפות הלא מוקצית ואופטימיזציה אוטומטית וידנית.
הפפטידים, הקופקטורים והליפידים והקינונים האחרים המקושרים בצפיפויותיהם מוצגים באיורים 1 ו-2. S18 עד S23. המידע הסטטיסטי של המודל הסופי מוצג בטבלה S1.
אלא אם כן צוין אחרת, ספקטרום הבליעה של UV/Vis/NIR נאסף בספקטרופוטומטר Cary60 (Agilent, ארה"ב) במרווחים של 1 ננומטר, מ-250 ננומטר עד 1000 ננומטר, ובזמן אינטגרציה של 0.1 שנייה.
מדללים את הדגימה בקובט קוורץ עם מסלול של 2 מ"מ ל-A880 של 1, ואוספים את ספקטרום הקליטה בין 400 ל-1000 ננומטר. הספקטרומים הדיכרואיים המעגליים נאספו על ספקטרופולרימטר Jasco 810 (Jasco, יפן) במרווחים של 1 ננומטר בין 400 ננומטר ל-950 ננומטר בקצב סריקה של 20 ננומטר לדקה-1.
מקדם ההכחדה המולרי נקבע על ידי דילול קומפלקס הליבה ל-A880 של כ-50. יש לדלל את הנפח של 10 מיקרוליטר ב-990 מיקרוליטר בופר קשירה או מתנול, ולאסוף את ספקטרום הבליעה באופן מיידי כדי למזער את פירוק BChl. תכולת BChl של כל דגימת מתנול חושבה על ידי מקדם ההכחדה ב-771 ננומטר של 54.8 mM-1 סמ"ק, ומקדם ההכחדה נקבע (51). יש לחלק את ריכוז BChl הנמדד ב-32 (RC-LH114-W) או 36 (RC-LH116) כדי לקבוע את ריכוז קומפלקס הליבה, המשמש לאחר מכן לקביעת ספקטרום הבליעה של אותה דגימה שנאספה בבופר במקביל. בוצעו שלוש מדידות חוזרות עבור כל דגימה, והבליעה הממוצעת של מקסימום Qy של BChl שימשה לחישוב. מקדם ההכחדה של RC-LH114-W שנמדד ב-878 ננומטר הוא 3280±140 mM-1 cm-1, בעוד שמקדם ההכחדה של RC-LH116 שנמדד ב-880 ננומטר הוא 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 כומת לפי השיטה ב-(52). בקצרה, בוצעה HPLC פאזה הפוכה (RP-HPLC) באמצעות מערכת Agilent 1200 HPLC. יש להמיס כ-0.02 ננומול של RC-LH116 או RC-LH114-W ב-50 מיקרוליטר של מתנול:כלורופורם 50:50 המכיל 0.02% (w/v) ברזל כלורי, ולהזריק את ממיסת אולטרספירת ODS 4.6 מ"מ של Beckman Coulter שעברה איזון מראש ב-1 מ"ל-1 לדקה-1 ב-40°C בממס HPLC (80:20 מתנול:2-פרופנול) על עמודה בגודל 25 ס"מ. יש לבצע אלוציה איזוקרטית בממס HPLC כדי לנטר את הספיגה ב-275 ננומטר (UQ10), 450 ננומטר (קרוטנואידים) ו-780 ננומטר (BChl) למשך שעה. השיא בכרומטוגרמה של 275 ננומטר לאחר 25.5 דקות שולב, ולא הכיל תרכובות אחרות הניתנות לזיהוי. השטח המשולב משמש לחישוב הכמות המולרית של UQ10 שחולצה בהתייחס לעקומת הכיול שחושבת מהזרקת סטנדרטים טהורים מ-0 עד 5.8 ננומול (איור S14). כל דגימה נותחה בשלושה חזרות, והשגיאה המדווחת תואמת את סטיית התקן של הממוצע.
תמיסה המכילה את קומפלקס RC-LH1 עם ספיגה מקסימלית של Qy של 0.1 הוכנה עם 30 מיקרומולר ציטוכרום c2 של לב סוסים מופחת (Merck, בריטניה) ו-0 עד 50 מיקרומולר של MUQ2 (Merck, בריטניה). שלוש דגימות של 1 מ"ל הוכנו בכל ריכוז UQ2 והודגרו למשך הלילה בחושך ב-4 מעלות צלזיוס כדי להבטיח הסתגלות מלאה לחושך לפני המדידה. התמיסה הועמסה לספקטרופוטומטר מודולרי OLIS RSM1000 המצויד בסריג להבה/קו 500 של 300 ננומטר, חריצי כניסה של 1.24 מ"מ, חריצי אמצע של 0.12 מ"מ וחריצי יציאה של 0.6 מ"מ. מסנן מעביר באורך 600 ננומטר ממוקם בכניסה של צינור הצילום של הדגימה ושפופרת הפוטו-מכפיל הייחוס כדי למנוע אור עירור. הספיגה נוטרה ב-550 ננומטר עם זמן אינטגרציה של 0.15 שניות. אור העירור נפלט מדיודת LED (Light Emitting Diode) M880F2 880 ננומטר (Thorlabs Ltd., UK) דרך כבל סיב אופטי בעוצמה של 90% באמצעות בקר DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) ונפלט למקור האור בזווית של 90°. אלומת המדידה מנוגדת למראה כדי להחזיר כל אור שלא נספג בתחילה על ידי הדגימה. יש לנטר את הבליעה 10 שניות לפני עוצמת ההארה של 50 שניות. לאחר מכן, הבליעה נוטרה עוד במשך 60 שניות בחושך כדי להעריך את המידה שבה קווינולול מפחית באופן ספונטני את ציטוכרום c23+ (ראה איור S8 לנתונים גולמיים).
הנתונים עובדו על ידי התאמת קצב התחלתי ליניארי בתוך 0.5 עד 10 שניות (בהתאם לריכוז UQ2) וממוצע הקצבים של כל שלוש הדגימות בכל ריכוז UQ2. ריכוז RC-LH1 שחושב על ידי מקדם ההכחדה המתאים שימש להמרת הקצב ליעילות קטליטית, אשר תוכננה בגרף ב-Origin Pro 2019 (OriginLab, ארה"ב), והותאם למודל מיכאליס-מנטן כדי לקבוע את ערכי Km ו-Kcat הנראים לעין.
עבור מדידות ספיגה חולפת, דגימת RC-LH1 דוללה ל-~2 מיקרומולר בבופר IMAC המכיל 50 mM נתרן אסקורבט (Merck, ארה"ב) ו-0.4 mM טרבוטין (Merck, ארה"ב). חומצה אסקורבית משמשת כתורמת אלקטרונים קורבנית, וטרט-בוטקלופן משמש כמעכב QB כדי להבטיח שתורם ה-RC העיקרי יישאר מופחת (כלומר, לא מתחמצן) לאורך כל תהליך המדידה. כ-3 מ"ל של דגימה מתווספים לתא מסתובב מותאם אישית (בקוטר של כ-0.1 מטר, 350 סל"ד) עם אורך נתיב אופטי של 2 מ"מ כדי להבטיח שלדגימה בנתיב הלייזר יהיה מספיק זמן להסתגלות לחושך בין פולסי העירור. השתמשו בפולסי לייזר של ~100-fs כדי להגביר את מערכת הלייזר Ti:Sapphire (Spectra Physics, ארה"ב) כדי לעורר את הדגימה ב-880 ננומטר בקצב חזרות של 1 קילוהרץ (20 nJ עבור NIR או 100 nJ עבור Vis). לפני איסוף הנתונים, חשפו את הדגימה לאור עירור למשך כ-30 דקות. חשיפה תגרום להשבתת פעילות QA (אולי הפחתת QA פעם או פעמיים). אך שימו לב שתהליך זה הפיך מכיוון שלאחר תקופה ארוכה של הסתגלות לחושך, RC יחזור באיטיות לפעילות QA. ספקטרומטר Helios (Ultrafast Systems, ארה"ב) שימש למדידת ספקטרום חולף עם זמן השהייה של -10 עד 7000 פיקו-שניות. השתמשו בתוכנת Surface Xplorer (Ultrafast Systems, ארה"ב) כדי לפרק את מערכי הנתונים, ולאחר מכן למזג ולתקנן. השתמשו בחבילת התוכנה CarpetView (Light Conversion Ltd., ליטא) כדי להשתמש במערך הנתונים המשולב כדי לקבל ספקטרום דיפרנציאלי הקשור לדעיכה, או השתמשו בפונקציה שמשלבת מספר אקספוננטים עם תגובת המכשיר כדי להתאים את האבולוציה הספקטרלית באורך גל יחיד ב-Origin (OriginLab, ארה"ב).
כפי שצוין לעיל (53), הוכן סרט פוטוסינתטי המכיל קומפלקס LH1 חסר אנטנת RC וגם אנטנת LH2 היקפית. הממברנה דוללה ב-20 mM טריס (pH 8.0) ולאחר מכן הועמסה לתוך קובט קוורץ עם נתיב אופטי של 2 מ"מ. נעשה שימוש בפולס לייזר של 30nJ כדי לעורר את הדגימה ב-540 ננומטר עם זמן השהייה של -10 עד 7000 ps. עבדו את מערך הנתונים כמתואר עבור דגימת Rps. pal.
הממברנה נוצרה באמצעות צנטריפוגה ב-150,000 RCF למשך שעתיים ב-4°C, ולאחר מכן ספיגתה ב-880 ננומטר הושעתה מחדש ב-20 mM טריס-HCl (pH 8.0) ו-200 mM NaCl. יש להמיס את הממברנה על ידי ערבוב איטי ב-2% (w/v) β-DDM למשך שעה אחת בחושך ב-4°C. הדגימה דוללה ב-100 mM טריאתילאמוניום קרבונט (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) לריכוז חלבון של 2.5 מ"ג מ"ל-1 (ניתוח Bio-Rad). עיבוד נוסף בוצע לפי השיטה שפורסמה בעבר (54), החל מדילול של 50 מיקרוגרם חלבון לסך של 50 מיקרוליטר TEAB המכיל 1% (w/v) נתרן לאוראט (Merck, UK). לאחר סוניקציה במשך 60 שניות, הוא חוזר עם 5 mM טריס(2-קרבוקסיתיל)פוספין (Merck, בריטניה) ב-37°C למשך 30 דקות. עבור S-אלקילציה, דגרו את הדגימה עם 10 mM מתיל S-מתילתיומאתנסולפונט (Merck, בריטניה) והוסיפו אותה מתמיסת סטוק של 200 mM איזופרופנול למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. עיכול פרוטאוליטי בוצע על ידי הוספת 2 מיקרוגרם של תערובת טריפסין/אנדופרוטאינאז Lys-C (Promega בריטניה) ודגרו ב-37°C למשך 3 שעות. החומר הפעיל שטח לאוראט חולץ על ידי הוספת 50 מיקרוליטר אתיל אצטט ו-10 מיקרוליטר חומצה טריפלואורואצטית 10% (v/v) בדרגת LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, בריטניה) וערבוב במשך 60 שניות. הפרדת הפאזות קודם על ידי צנטריפוגה ב-15,700 RCF למשך 5 דקות. בהתאם לפרוטוקול של היצרן, נעשה שימוש בעמודת ספין C18 (Thermo Fisher Scientific, בריטניה) כדי לשאוב ולסלק בזהירות את הפאזה התחתונה המכילה את הפפטיד. לאחר ייבוש באמצעות צנטריפוגה בוואקום, הדגימה הומסה ב-0.5% TFA ו-3% אצטוניטריל, ו-500 ננוגרם נותחו באמצעות כרומטוגרפיית ננו-זרימה RP בשילוב עם ספקטרומטריית מסות תוך שימוש בפרמטרי המערכת שפורטו קודם לכן.
השתמשו ב-MaxQuant גרסה 1.5.3.30 (56) לזיהוי וכימות חלבונים כדי לחפש את מסד הנתונים של פרוטאום Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). נתוני פרוטאומיקה של ספקטרומטריית מסות הופקדו בברית ProteomeXchange דרך מאגר השותפים של PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) תחת מזהה מערך הנתונים PXD020402.
לצורך ניתוח באמצעות RPLC בשילוב עם ספקטרומטריית מסות יינון אלקטרוספריי, קומפלקס RC-LH1 הוכן מ-Rps מסוג בר. באמצעות השיטה שפורסמה בעבר (16), ריכוז החלבון שנוצר בתאי palustris היה 2 מ"ג מ"ל-1 ב-20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl ו-0.03% (w/v) β- (ניתוח Bio-Rad)) DDM. בהתאם לפרוטוקול היצרן, השתמשו בערכת טיהור דו-ממדית (GE Healthcare, ארה"ב) כדי לחלץ 10 מיקרוגרם חלבון בשיטת משקעים, והמיסו את המשקע ב-20 מיקרוליטר 60% (v/v) חומצה פורמית (FA), 20% (v/v) אצטוניטריל ו-20% (v/v) מים. חמישה מיקרוליטר נותחו באמצעות RPLC (Dionex RSLC) בשילוב עם ספקטרומטריית מסות (Maxis UHR-TOF, Bruker). השתמשו בעמודה MabPac 1.2×100 מ"מ (Thermo Fisher Scientific, בריטניה) להפרדה ב-60°C ו-100μlmin -1, עם גרדיאנט של 85% (v/v) ממס A [0.1% (v/v) FA ו-0.02% (V/v) תמיסה מימית TFA] ל-85% (v/v) ממס B [0.1% (v/v) FA ו-0.02% (v/v) בתמיסה מימית של 90% (v/v) אצטוניטריל TFA]. באמצעות מקור יינון אלקטרוספרייס סטנדרטי ופרמטרי ברירת מחדל במשך יותר מ-60 דקות, ספקטרומטר המסות משיג 100 עד 2750 m/z (יחס מסה-מטען). בעזרת פורטל המשאבים לביואינפורמטיקה של ExPASy, כלי FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), מפו את ספקטרום המסות לתת-היחידות של הקומפלקס.
התאים גודלו במשך 72 שעות תחת אור של 100 מ"ל NF-נמוך (10μMm-2 s-1), בינוני (30μMm-2 s-1) או גבוה (300μMm-2 s-1). מדיום M22 (מדיום M22 שבו אמוניום סולפט מושמט ונתרן סוקצינט מוחלף בנתרן אצטט) בבקבוק עם מכסה הברגה של 100 מ"ל (23). בחמישה מחזורים של 30 שניות, חרוזי זכוכית של 0.1 מיקרון הוכנסו לחרוזים ביחס נפח של 1:1 כדי ליז את התאים וקורנו על קרח למשך 5 דקות. החומר הבלתי מסיס, תאים שלא שבורים וחרוזי הזכוכית הוסרו באמצעות צנטריפוגה ב-16,000 RCF למשך 10 דקות במיקרו-צנטריפוגה שולחנית. הממברנה הופרדה ברוטור Ti 70.1 עם 100,000 RCF ב-20 mM טריס-HCl (pH 8.0) עם גרדיאנט סוכרוז של 40/15% (w/w) במשך 10 שעות.
כפי שתואר בעבודה הקודמת שלנו, גילוי אימונוכי של תגית His על PufW (16). בקצרה, קומפלקס הליבה המטוהר (11.8 ננומטר) או הממברנה המכילה את אותו ריכוז של RC (שנקבע על ידי חמצון תוך הפחתת ספקטרום ההפרשים המופחתים והתאמת העומס על הג'ל הצבוע) בבופר טעינה כפול של SDS (Merck, בריטניה) דוללו פעמיים. החלבונים הופרדו על ג'ל NuPage ביס-טריס 12% רפליקה (Thermo Fisher Scientific, בריטניה). ג'ל נצבע בכחול Coomassie Brilliant (Bio-Rad, בריטניה) כדי לטעון ולהמחיש את תת-היחידה RC-L. החלבון על הג'ל השני הועבר לממברנת פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) המופעלת על ידי מתנול (Thermo Fisher Scientific, בריטניה) לצורך אימונו-אסאי. קרום ה-PVDF נחסם ב-50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 ו-5% (w/v) אבקת חלב רזה, ולאחר מכן הודגר עם הנוגדן הראשוני אנטי-His (בדילול בופר הנוגדנים [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl ו-0.05% (v/v) Tween-20] ביחס של 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, ארה"ב) למשך 4 שעות. לאחר שטיפה 3 פעמים במשך 5 דקות בבופר נוגדנים, הממברנה שולבה עם נוגדן משני נגד עכבר מסוג חזרת פראוקסידאז (Sigma-Aldrich, בריטניה) (מדולל 1:10,000 בבופר נוגדנים). דגירה לאפשר זיהוי (5 דקות לאחר 3 שטיפות בבופר נוגדנים) באמצעות מצע כימילומינסנציה WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, איטליה) ו-Amersham Imager 600 (GE Healthcare, בריטניה).
על ידי שרטוט התפלגות העוצמה של כל ג'ל צבוע או נתיב אימונו-אסאי, שילוב השטח שמתחת לשיא וחישוב יחס העוצמה של RC-L (ג'ל צבוע) וחלבון-W (אימונו-אסאי), ב-ImageJ (57) עבדו את התמונה. יחסים אלה הומרו ליחסים מולריים על ידי ההנחה שהיחס בין RC-L לחלבון-W בדגימת RC-LH114-W הטהורה היה 1:1 ונרמול מערך הנתונים כולו בהתאם.
לחומרים משלימים למאמר זה, אנא עיינו בכתובת http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
זהו מאמר גישה פתוחה המופץ תחת תנאי רישיון ייחוס Creative Commons. המאמר מאפשר שימוש, הפצה ורבייה ללא הגבלה בכל מדיום, בתנאי שהיצירה המקורית מצוטטת כראוי.
הערה: אנו מבקשים שתספקו את כתובת הדוא"ל שלכם רק כדי שהאדם שאתם ממליצים עליו לדף ידע שאתם רוצים שהוא יראה את האימייל ושזה אינו ספאם. לא נאסוף כתובות דוא"ל.
שאלה זו משמשת לבדיקת האם אתה מבקר ולמניעת שליחת דואר זבל אוטומטי.
דיוויד ג'יי קיי סווינסברי, פארק צ'יאן, פיליפ ג'יי ג'קסון, קייטלין מ. פארס, דריוש מ. נידזווידצקי, אליזבת סי. מרטין, דיוויד א. פארמר, לורנה א. מלון, רבקה פ. תומפסון, ניל א. רנסון, דניאל פ. קניף, מארק ג'יי דיקמן, דיואי הולטן, כריסטין קירמאייר, אנדרו היצ'קוק, סי. ניל האנטר
המבנה בעל הרזולוציה הגבוהה של קומפלקס מלכודת האור 1 במרכז התגובה מספק תובנות חדשות לגבי הדינמיקה של הכינון.
דיוויד ג'יי קיי סווינסברי, פארק צ'יאן, פיליפ ג'יי ג'קסון, קייטלין מ. פארס, דריוש מ. נידזווידצקי, אליזבת סי. מרטין, דיוויד א. פארמר, לורנה א. מלון, רבקה פ. תומפסון, ניל א. רנסון, דניאל פ. קניף, מארק ג'יי דיקמן, דיואי הולטן, כריסטין קירמאייר, אנדרו היצ'קוק, סי. ניל האנטר
המבנה בעל הרזולוציה הגבוהה של קומפלקס מלכודת האור 1 במרכז התגובה מספק תובנות חדשות לגבי הדינמיקה של הכינון.
©2021 האגודה האמריקאית לקידום המדע. כֹּל הַזְכוּיוֹת שְׁמוּרוֹת. AAAS הוא שותף של HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ו-COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.